一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞的制作方法

技术特征：
1.seq id no:1所示序列的sirna。2.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的单链可变片段包含muc1的单链抗体。3.如权利要求2所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述muc1的抗体为特异性抗胰腺癌细胞muc1单克隆抗体pam4；或，所述嵌合抗原受体的单链可变片段为muc1的单链抗体，包括轻链可变区及重链可变区，通过接头序列连接；所述铰链区选自ighg1；或，所述嵌合抗原受体的跨膜结构域来源于cd4，cd8，cd28或cd3ζ中的一种；进一步的，所述跨膜结构选自cd8；或，所述嵌合抗原受体的信号传导域为fcrγ1胞内区、pi3k的p85亚基胞内区；或，所述嵌合抗原受体中还包括连接肽、标记基团；进一步的，所述连接肽为p2a，所述标记基团为绿色荧光蛋白egfp；进一步的，所述嵌合抗原受体为依次连接的cd8信号肽、抗muc1单链抗体、myc-tag标记基因、ighg1铰链区、cd8跨膜区、fcrγ1胞内区、pi3k的p85亚基胞内区、p2a和egfp的融合蛋白；具体的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:2所示；或，所述嵌合抗原受体还包括seq id no:2第28-1011位氨基酸序列所示的氨基酸序列、seq id no:2第1-1011位所示氨基酸序列的突变体；所述突变体包括：与该car具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相似性并保留该嵌合抗原受体的生物学活性的氨基酸序列。4.一种表达框，其特征在于，所述表达框包括权利要求2或3所述嵌合抗原受体的编码序列及shklf4；优选的，所述表达框具有如seq id no:3所示的多核苷酸序列。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体具有如权利要求4所述的表达框；优选的，所述表达载体类型包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒或粘粒；进一步的，所述表达载体为piggybac转座子；所述piggybac转座子表达载体，该载体含有复制起始位点，3’itr，5’itr，权利要求4所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。6.一种纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物采用甘露糖-壳寡糖-精氨酸高分子材料包覆表达载体；优选的，所述甘露糖-壳寡糖-精氨酸高分子材料制备方法如下:将壳寡糖与甘露吡喃酰基苯异硫氰酸酯混合得到甘露糖-壳寡糖，将活化后的l-精氨酸加入甘露糖-壳寡糖得到所述甘露糖-壳寡糖-精氨酸材料。7.一种嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞膜表面具有权利要求2所述嵌合抗原受体修饰，并且所述巨噬细胞中klf4表达被抑制；优选的，所述巨噬细胞中klf4表达被抑制的方式具体为，通过seq id no：1所示sirna进行抑制；进一步的，所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞的制备方式如下：通过将权利要求4所述表达框、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述纳米复合物转入巨噬细胞进行表达。8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞；
优选的，所述组合物中还包括缓冲液、碳水化合物、蛋白质、多肽或氨基酸、抗氧化剂、螯合剂、佐剂或防腐剂中的一种或多种；优选的，所述药物组合物的施用方式包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植；进一步的，所述组合物可通过皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。9.权利要求4所述表达框、权利要求5表达载体、权利要求6所述纳米复合物、权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞和/或权利要求8所述药物组合物在制备抗肿瘤产品中的应用；所述抗肿瘤产品包括但不限于药物或模型药物。10.一种肿瘤的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括向有治疗需求的患者回输权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞；优选的，所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、神经系统癌症、白血病或宫颈癌中的一种；进一步的，所述嵌合抗体受体修饰的免疫细胞用于胰腺癌的治疗；优选的，所述治疗方法还包括获取患者的巨噬细胞，向所述巨噬细胞中转入权利要求4所述表达框、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述纳米复合物；优选的，所述免疫细胞治疗方法与其它疗法结合；所述其他疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。

技术总结
本发明涉及一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞。本发明全基因合成shKLF4和嵌合抗原受体CD8SP-抗MUC1sc Fv-IghG1铰链区-CD8TM-FcRγ1-PI3κ的p85亚基的基因片段插入到PiggyBac载体中，提供了一种靶向MUC1及沉默KLF4的双功能表达载体。所述表达载体包装在MCA高分子材料中对巨噬细胞进行转染，使巨噬细胞表达该嵌合抗原受体。本发明提供的高分子材料的转化方法应用于巨噬细胞的转染具有转化效率高，外源基因能够稳定表达等优点，制备得到的巨噬细胞具有理想的临床应用前景。前景。前景。


技术研发人员：姜新义 刘颖 张盛昌 王艳
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2021.09.30
技术公布日：2022/1/28