一种DNA作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物的制作方法

一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，特别是一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物。


背景技术：

2.很长时期以来，各种抗体偶联物在科学研究和医疗制药领域有着广泛的应用，比如各种带有标记的抗体，用于细胞标记，在免疫细胞组化、流式细胞术等领域，有着广泛的应用；另一方面抗体-药物的偶联物制成的抗体药物复合物(adc)，在肿瘤治疗领域得到了越来越多的应用，成为肿瘤治疗的一个新兴方向(drago,j.z.,modi,s.,&chandarlapaty,s.(2021).unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy.nature reviews.clinical oncology,18(6),327
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344.)。
3.另一方面，dna具有高载荷特征，dna除了是生物遗传信息的载体之外，研究人员也开发了dna作为结构物质，用于载荷小分子，比如抗癌药物，靶向到肿瘤部位(li,s.,jiang,q.,liu,s.,zhang,y.,tian,y.,song,c.,wang,j.,zou,y.,anderson,g.j.,han,j.-y.,chang,y.,liu,y.,zhang,c.,chen,l.,zhou,g.,nie,g.,yan,h.,ding,b.,&zhao,y.(2018).a dna nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo.nature biotechnology,36(3),258
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264.https://doi.org/10.1038/nbt.4071)。自从1970年代开始，研究人员就研究开发dna-阿霉素复合物，用以降低阿霉素对其它器官的非特异性伤害，减轻阿霉素的毒性。这种dna-阿霉素复合物中的dna包括鲱鱼精子dna、纯化的线性/环形dna以及三维立体结构的dna折纸。
4.一些研究人员制备了抗体dna偶联物，并且将之用作载荷药物分子，靶向肿瘤细胞(hsu,n.s.,lee,c.c.,kuo,w.c.,chang,y.w.,lo,s.y.,&wang,a.h.j.(2020).development of a versatile and modular linker for antibody-drug conjugates based on oligonucleotide strand pairing.bioconjugate chemistry,31(7),1804
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1811.https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00281)，这种抗体dna偶联物是用偶联剂将药物小分子与dna直接共价结合在一起的，存在药物荷载量受到限制，需要对dna进行特别修饰的问题。
5.抗体dna偶联物，将之用作载荷药物分子给药后，配方包含三种主要循环成分：抗体dna偶联物(占绝大多数)、未偶联的抗体和游离的小分子药物等各种成分的混合物。这几个组成部分的相对比例可能在不同情况下有所不同，抗体dna偶联物的比例，部分取决于连接体的稳定性和产品纯度，并可能在给药后几天内随时间变化。例如，跟踪t-dm1各成分的临床药代动力学研究研究表明，总trastuzumab(偶联抗体加未偶联抗体)的血清峰值浓度比完整t-dm1结合物的血清峰值浓度高出约20％，而dm1有效载荷的浓度则低几个数量级，几乎无法通过分析检测到(drago,j.z.,modi,s.,&chandarlapaty,s.(2021).unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy.nature reviews.clinical oncology,18(6),327
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344.)。
6.目前，一些公司发布了蛋白质dna或者是抗体dna偶联试剂盒，例如abcam公司生产的抗体偶联试剂盒，但是这些试剂盒存在着价格昂贵，制备量小，在研究、医疗和制药生产上受到限制；而文献中报道的一些方法，仍然存在费事费力价格昂贵，不够简便易行，难以普及和推广的问题(gong,haibiao,ilona holcomb,aik ooi,xiaohui wang,daniel majonis,marc a.unger,and ramesh ramakrishnan.2016.“simple method to prepare oligonucleotide-conjugated antibodies and its application in multiplex protein detection in single cells.”bioconjugate chemistry27(1):217
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25.doi:10.1021/acs.bioconjchem.5b00613.)，至今为止，并没有在实验室和制药工业中普及抗体dna偶联物的制备和应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为dna作为药物载体并插入嵌入剂和/或铂类药物分子的抗体偶联物抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为抗体-dna-小分子复合物，抗体-dna-小分子复合物为抗体-dna-抗肿瘤药物复合物或者抗体-dna-核酸染料分子复合物。
9.本发明的进一步改进在于：嵌入剂分子为阿霉素、米托蒽醌以及双功能的蒽环类分子。
10.本发明的进一步改进在于：铂类药物分子是奥沙利铂、顺铂、卡铂。
11.本发明的进一步改进在于：dna为线性、环状或者立体结构的。
12.本发明的进一步改进在于：将抗体-dna偶联技术与dna-小分子复合物技术结合起来制备抗体-dna-小分子复合物，即抗体与dna通过偶联剂共价连接，铂类药物分子单独链接dna或者联合蒽环类分子链接dna。
13.本发明的进一步改进在于：抗体-dna-小分子复合物的制备方法为：将抗体在缓冲液中溶解或者稀释，根据抗体的浓度，加入适量的偶联剂，抗体与偶联剂的摩尔比为1:5；进行偶联反应的第一步，偶联结束后用缓冲液去盐，获得活化的抗体，活化的抗体保存在4～8℃冰箱中，然后将活化的抗体与dna分子进行偶联反应，制备得到抗体dna偶联物，抗体dna偶联物储存在保存溶液中备用；小分子在dna与抗体进行偶联反应之前或之后、或者在使用时加入，获得抗体-dna-小分子三组分复合物。
14.本发明的进一步改进在于：抗体-dna-小分子复合物的制备方法为：将dna或者寡聚核苷酸在缓冲液中溶解或者稀释，根据寡聚核苷酸的浓度，加入偶联剂，寡聚核苷酸与偶联剂的摩尔比为1:5；进行偶联反应的第一步，偶联结束后用缓冲液去盐，获得活化的寡聚核苷酸，然后将活化的寡聚核苷酸与抗体进行偶联反应，制备得到抗体dna偶联物，抗体dna偶联物储存在保存溶液中备用；小分子在dna与抗体进行偶联反应之前或之后、或者在使用时加入，获得抗体-dna-小分子三组分复合物。
15.本发明的进一步改进在于：缓冲液为去盐柱。
16.本发明的进一步改进在于：小分子为抗肿瘤药物或者具有抗肿瘤作用的核酸染料分子。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明提供了一种改进的抗体dna偶联物，将adc药物与dna-阿霉素复合物结合在一起，一方面发挥了抗体的靶向作用，另一方面发挥了dna高荷载量以及减轻抗癌药物对其它正常组织和器官的毒性。
附图说明
19.图1为anti-her2-dna的sds-page；
20.图2为anti-her2-dna(drug)动物实验中肿瘤相对重量的比较。结果显示，相对于单纯的药物和对照，anti-her2-dna(drug)肿瘤重量更小。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
23.本发明提供了一种简便易行的制备抗体-dna偶联物和抗体-dna-小分子三组分复合物的方法，首次将抗体-抗原高亲和特性与dna对特定抗肿瘤药物的高荷载量特征结合起来，获得的抗肿瘤鸡尾酒药物在抗肿瘤治疗上的应用，具有极好的应用前景。
24.本实施例提供一种技术方案：一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为dna作为药物载体并插入嵌入剂和/或铂类药物分子的抗体偶联物抗肿瘤药物，同时通过碱基配位链接金属类药物和(或)通过通过嵌入剂插入碱基对之间，它可以用作一类抗体靶向肿瘤药物，增加对于肿瘤的治疗效果。该抗肿瘤药物为抗体-dna-小分子复合物，抗体-dna-小分子复合物为抗体-dna-抗肿瘤药物复合物或者抗体-dna-核酸染料分子复合物。
25.嵌入剂分子为阿霉素、米托蒽醌以及双功能的蒽环类分子；铂类药物分子是奥沙利铂、顺铂、卡铂；dna为线性、环状或者立体结构的。
26.本发明利用了dna分子对蒽环类药物阿霉素、二氨环己烷的铂类化合物奥沙利铂和带苯环的核酸染料分子gelgreen(biotium公司生产)的高荷载量特征，将抗体-dna偶联技术与dna-小分子复合物技术结合起来，制备了抗体-dna-小分子复合体，并提供了这种三组分复合物在肿瘤靶向药物方面的应用。
27.将抗体-dna偶联技术与dna-小分子复合物技术结合起来制备抗体-dna-小分子复合物，即抗体与dna通过偶联剂共价连接，铂类药物分子单独链接dna或者联合蒽环类分子链接dna。
28.抗体-dna-小分子复合物的制备方法为：将抗体在缓冲液中溶解或者稀释，根据抗体的浓度，加入适量的偶联剂，抗体与偶联剂的摩尔比为1:5，即抗体浓度＜1mg/ml时，使用40-80倍摩尔量的偶联剂，抗体浓度为1-4mg/ml时，使用20倍摩尔量的偶联剂，抗体浓度为5-10mg/ml时，使用5-10倍摩尔量的偶联剂；进行偶联反应的第一步，偶联结束后用缓冲液
去盐，获得活化的抗体，活化的抗体保存在4～8℃冰箱中，然后将活化的抗体与dna分子进行偶联反应，制备得到抗体dna偶联物，抗体dna偶联物储存在保存溶液中备用，如含5mm edta的50mm pbs中备用；小分子在dna与抗体进行偶联反应之前或之后、或者在使用时加入，获得抗体-dna-小分子三组分复合物。
29.抗体-dna-小分子复合物的制备方法为：将dna或者寡聚核苷酸在缓冲液中溶解或者稀释，根据寡聚核苷酸的浓度，加入偶联剂，寡聚核苷酸与偶联剂的摩尔比为1:5；进行偶联反应的第一步，偶联结束后用缓冲液去盐，获得活化的寡聚核苷酸，然后将活化的寡聚核苷酸与抗体进行偶联反应，制备得到抗体dna偶联物，抗体dna偶联物储存在保存溶液中备用，如含5mm edta的50mm pbs中备用；小分子在dna与抗体进行偶联反应之前或之后、或者在使用时加入，获得抗体-dna-小分子三组分复合物。
30.缓冲液为去盐柱；小分子为抗肿瘤药物或者具有抗肿瘤作用的核酸染料分子。
31.如上所述的抗体-dna-抗肿瘤药物复合物，作为改进的adc药物在抗肿瘤靶向治疗方向的应用，将肿瘤治疗药物直接无差别进入正常和肿瘤细胞的细胞核的过程，转化成三个步骤：首先，抗体靶向对应的抗原高表达的肿瘤细胞(例如高表达her2的乳腺癌细胞)，抗体-dna-抗肿瘤药物三组分复合物通过抗体-抗原的亲和作用，结合在细胞膜上；然后通过细胞的内吞左右，抗体-dna-抗肿瘤药物进入细胞中，存在于膜相的内质网或者溶酶体中；最后是抗肿瘤药物从抗体-dna-抗肿瘤药物三组分复合物中释放，进入细胞盒中。通过这种作用和过程，抗体-dna-抗肿瘤药物三组分复合物起到了双重作用，一方面可以降低抗肿瘤药物直接进入正常细胞的机会，从而减轻抗肿瘤药物对应其它正常细胞的毒性；另一方面，通过抗体-抗原的亲和作用，靶向肿瘤细胞，提高了抗肿瘤药物的治疗效果。
32.本发明进行了动物实验，研究了本发明的抗体-dna偶联物的抗肿瘤鸡尾酒药物对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用。本发明使用了可以致瘤的小鼠balb/c裸鼠和具致瘤性而且her2表达阳性的肿瘤细胞skbr3，建立her2阳性的肿瘤小鼠模型，将对数生长期的肿瘤细胞，经胰酶消化，pbs洗涤，调整活细胞浓度，取适量细胞悬液接种于裸鼠左乳房垫内。以抗肿瘤药物小分子和抗肿瘤抗体的量为基准给药。待肿瘤体积生长至约100立方毫米，小鼠静脉给药。每3天注射一次，共6次。第一次注射的那天被指定为第0天。每次给药的第二天用卡尺对肿瘤进行三维测量，测量肿瘤大小，称量体重。最后一次给药后3天，处死小鼠，取肿瘤，称重，拍照。肿瘤和主要器官(心肝脾肺肾)在指定的时间从携带her2阳性细胞系的小鼠体内收集，组织标本用4％多聚甲醛固定。为了评估组织药物毒性，切片用苏木精伊红(h&e)染色。同时用未给药裸鼠做对照(选1,2,3,10,11组)。通过测量肿瘤组织的大小，显示本发明的抗体-dna偶联物的抗肿瘤鸡尾酒药物，能够显著增加抗肿瘤效果，实验结束，抗体-dna偶联物载药实验组的平均肿瘤重量/平均体重，为盐水给药组和抗体给药组的1/10-1/5，单纯化学药物给药组的1/8-1/3。。
33.表1 anti-her2-dna(drug)动物实验结果
34.组号给药内容平均体重(g)平均肿瘤重量(g)平均肿瘤重量/体重1盐水给药组24.7540.907340.03662dox给药组26.4840.649880.02453gelgr给药组24.6940.789280.03194ab给药组26.5780.891120.0335
5dna ox给药组27.3060.580980.02126dna dox给药组23.2420.356240.01537ab-dna dox给药组27.0080.184420.00688ab-dna gelgr给药组27.530.354380.01289ab-dna ox gelgr给药组25.0540.07990.0031
35.实施例1抗体-dna-小分子复合物的制备。
36.参照thermo公司的sulfo-smcc的使用说明书和生工公司的去盐柱的使用说明书：1、二抗用1xpbs 5mm edta(edta螯合二价离子，有双重作用，抑制二硫键的生成和抑制dnasei，保护dna)溶解或者稀释，如果有必要，使用去盐柱更换缓冲液。估计或计算二抗的浓度，根据sulfo-smcc的使用说明书，加入少量的sulfo-smcc(sulfo-smcc不要加多)，进行偶联的第一步。用生工的0.1ml-6kd截留的去盐柱去盐备用。2、带有巯基标记的dna用1xpbs 5mm edta，与gelgreen染料混合，然后用生工的0.1ml-6kd截留的去盐柱去盐更换备用。3、将偶联有sulfo-smcc的二抗与dna(dna不要加多)混合，进行偶联的第二步，偶联结束后的的抗体-dna偶联物与药物小分子混合给药，根据不同的药物，在实验中二者质量比为从1：2到1：6。
37.实施例2抗肿瘤鸡尾酒药物对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用。
38.为了评估本发明的抗肿瘤鸡尾酒药物对her2阳性荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，本发明进行了抗肿瘤鸡尾酒药物对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用的动物实验。
39.实验动物可以致瘤的小鼠：balb/c裸鼠，spf级，4-5周龄，20g以上。用来动物肿瘤建模的细胞为具致瘤性而且her2表达阳性的肿瘤细胞skbr3。将对数生长期的肿瘤细胞，经胰酶消化，pbs洗涤，调整活细胞浓度，取5
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106个细胞悬液接种于裸鼠左乳房垫内，从而建立her2阳性的肿瘤小鼠模型。
40.肿瘤造模小鼠her2阳性乳腺癌小鼠实验动物分为9组，1、盐水给药组对照；2、阿霉素(dox)给药组；3、凝胶绿(gelgr，gelgreenbiotium公司生产)给药组；4、抗体(ab，赫赛汀-注射用曲妥珠单抗，罗氏制药(roche))给药组；5、dna-dna偶联物 奥沙利铂(ox)给药组；6、dna 阿霉素(dox)给药组；7、抗体-dna偶联物(ab-dna) 阿霉素(dox)给药组；8、抗体-dna偶联物(ab-dna) 奥沙利铂(ox)；9、抗体-dna偶联物(ab-dna) 奥沙利铂(ox) 凝胶绿(gelgr)给药组。
41.根据实验动物体重，以抗体曲妥珠单抗和药物小分子的量为基准给药。其中曲妥珠单抗和dna的给药量为25ug/g动物，抗体-dna偶联物的给药量为12.5ug/g动物，凝胶绿和阿霉素为2ug/g动物，奥沙利铂为5ug/g动物。
42.待肿瘤体积生长至约100立方毫米，小鼠静脉给药。每3天注射一次，共6次。第一次注射的那天被指定为第0天。每次给药的第二天用卡尺对肿瘤进行三维测量，测量肿瘤大小，称量体重。最后一次给药后3天，处死小鼠，取肿瘤，称重，拍照。肿瘤和主要器官(心肝脾肺肾)在指定的时间从携带her2阳性细胞系的小鼠体内收集，组织标本用4％多聚甲醛固定。为了评估组织药物毒性，切片用苏木精伊红(h&e)染色。同时用未给药裸鼠做对照。
43.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
44.需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本技术的实施方式，例如，能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、产品或设备固有的其它步骤或单元。
45.现在，将参照附图更详细地描述根据本技术的示例性实施方式。然而，这些示例性实施方式可以由多种不同的形式来实施，并且不应当被解释为只限于这里所阐述的实施方式。应当理解的是，提供这些实施方式是为了使得本技术的公开彻底且完整，并且将这些示例性实施方式的构思充分传达给本领域普通技术人员，在附图中，为了清楚起见，有可能扩大了层和区域的厚度，并且使用相同的附图标记表示相同的器件，因而将省略对它们的描述。
46.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。