癌治疗剂的制作方法

1.本发明涉及癌治疗剂。更具体而言，本发明涉及发挥优异的抗肿瘤效果，且还能够降低癌干细胞的干细胞性的癌治疗剂。


背景技术：

2.mirna为由18～24个核苷酸组成的小rna，其广泛存在于真核生物中，已阐明人体中存在数千mirna。mirna为1993年首次报告的内源性表达的短rna。由dna转录被称为初级mirna的具有环结构的rna。环被酶切断而形成前体mirna。该前体mirna被转运至核外，被dicer切成20～25个碱基左右的mirna序列。其被称为rna诱导沉默复合体(rna-induced silencing complex，risc)的核糖核酸与argonoute蛋白的复合体摄取而形成mirna-risc复合体，与mrna的3'utr结合而抑制基因表达。mirna与mrna的结合并不彻底，因此靶基因不限于1个，而是能够以多个基因为靶标并加以控制，这是其重要特征。另外已经阐明mirna在生物体内的基因表达控制方面发挥重要的作用，mirna的控制系统异常与多种疾病的原因、进展有关。特别是，已经阐明多种与癌的发病、进展显示出关联性的mirna，作为用于治疗癌的核酸药物的引导者而受到关注。
2.另一方面，癌细胞有自我增殖能力，具有能够向周边组织浸润、向远端组织转移的特性。但是已经获知，并非构成癌组织的所有癌细胞均具有上述特性，使癌发病或者使癌进展的癌细胞是在癌细胞中仅微量存在的癌干细胞。癌干细胞具有以下特性：与正常干细胞相同显示出未分化的表面性状，具有自我复制能力和多分化潜能，产生处于构成癌组织的多个分化阶段的所有癌细胞。即，认为癌干细胞在癌组织中通过自我复制来维持与自身相同的细胞，且成为通过分化而产生大多数的癌细胞的源头。因此，认为将癌干细胞本身作为治疗对象关系到癌的根治。
4.另外，klf5是锌指转录因子即klf家族的成员之一。已经阐明：klf5在正常肠道的隐窝中强表达，但在癌变部分klf5广泛表达，通过增强wnt/catnb信号转导而促进癌细胞增殖(非专利文献1)。另外，也报告如果在lgr5阳性细胞、小鼠中使klf5缺损则不形成肿瘤(非专利文献1)。现有技术文献非专利文献
5.非专利文献1:takeo nakaya et al.,cancer res；74(10)may 15,2014


技术实现要素：

发明所要解决的技术问题
6.如上述所述，klf5为癌变需要的要素，提示与癌干细胞有关，但是以往并未发现能够与klf5结合且对治疗癌有效的mirna。另外，如试验例2所示，虽然是能够与klf5结合mirna，但是存在多种对癌细胞不显示增殖抑制效果的mirna。在上述状况下，本发明的目的在于提供用于治疗癌的核酸药物，其能够有效治疗癌。
用于解决问题的技术方案
7.本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，mir-4711-5p具有以下特性：不仅与和癌变有关的klf5的mrna结合，而且还与在细胞周期从g1期进入s期方面重要的tfdp1的mrna结合。此外，还确认到mir-4711-5p抑制mdm2表达，该mdm2抑制在细胞的凋亡、细胞周期的控制方面重要的p53。发现mir-4711-5p能够抑制klf5、tfdp1和mem2表达，其结果，能够有效抑制癌细胞增殖、浸润和转移，使细胞停留在g1期，还能够诱导癌细胞凋亡。另外还发现，mir-4711-5p具有降低癌干细胞的干细胞性的作用，有效抑制癌干细胞增殖。本发明是基于上述见解并反复进行研究而完成的。
8.即，本发明提供以下揭示的方式的发明。项1.一种癌治疗剂，其包含mir-4711-5p作为有效成分。项2.根据项1记载的癌治疗剂，其中，mir-4711-5p为成熟mirna、初级mirna或前体mirna。项3.根据项1或2记载的癌治疗剂，其中，mir-4711-5p复合于碳酸磷灰石颗粒。项4.一种癌干细胞的增殖抑制剂，其包含mir-4711-5p作为有效成分。项5.mir-4711-5p在制造癌治疗剂中的用途。项6.mir-4711-5p，其在用于治疗癌的处置中使用。项7.一种癌治疗方法，其对癌患者给药治疗有效量的mir-4711-5p。项8.mir-4711-5p在制造癌干细胞的增殖抑制剂中的用途。项9.mir-4711-5p，其在用于抑制癌干细胞的增殖的处置中使用。项10.一种癌干细胞的增殖抑制方法，其对癌患者给药治疗有效量的mir-4711-5p来抑制癌干细胞的增殖。发明的效果
9.本发明的癌治疗剂不仅与和癌干细胞有关的klf5的mrna结合，而且还与使细胞周期从g1期进入s期需要的tfdp1、抑制p53的mdm2的mrna结合，发挥优异的抗肿瘤效果，抑制癌细胞的增殖、浸润和转移，而且能够有效诱导癌细胞凋亡。另外，本发明的癌治疗剂还能够降低癌干细胞的干细胞性，因此能够抑制癌干细胞的增殖，作为用于治疗癌的核酸药物在临床上的有用性非常高。
附图说明
10.图1为表示转染有41种候选mirna的大肠癌细胞株(dld-1、hct116和ht29)的增殖试验的结果的图。图2为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的klf5 mrna表达量而得到的结果的图。图3为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的klf5(蛋白质)表达量而得到结果的图。图4为表示通过双荧光素酶分析确认mir-4711-5p与klf5的结合的结果的图。图5为表示转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的细胞增殖试验的结果的图。图6为表示转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的浸润分析结果
的图。图7为表示转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的细胞转移能力评价结果的图。图8为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的annexinv染色的细胞，即发生凋亡的细胞的比例而得到的结果的图。图9为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的p53、survivin、cparp和ccaspase3的表达量而得到的结果的图。图10为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的klf5、cd44v9、lgr5、bmi1和lrig1的mrna量而得到的结果的图。图11为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1)的cd44v9阳性细胞的比例而得到的结果的图。图12为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1)的活性氧类活性而得到的结果的图。图13为表示评价转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的细胞团形成能力而得到的结果的图。图14为表示使用转染有mir-4711-5p或阴性对照的大肠癌细胞株(dld-1)的次代测序结果进行ingenuity pathways analysis的结果的图。图15为表示对转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)进行细胞周期分析的结果的图。图16为表示测定转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的与g1期/s期检查点控制相关蛋白(tfdp1、e2f1、rb、ccne、cdk2、p53、p21、p27、ccnd1、cdk2、cdk6和mdm2)和β-actin(actb)的蛋白质水平的表达量而得到的结果的图。图17为表示通过双荧光素酶分析确认mir-4711-5p与tfdp1的结合的结果的图。图18为表示通过双荧光素酶分析确认mir-4711-5p与mdm2的结合的结果的图。图19为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，经时测定肿瘤尺寸而得到的结果的图。图20为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，观察第14天从小鼠摘取的肿瘤表示的结果的图。图21为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，经时测定小鼠体重而得到的结果的图。图22为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，苏木精伊红染色观察第14天从小鼠摘取的各组织而得到的结果的图。图23为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，测定肿瘤的mir-4711-5p量而得到的结果的图。图24为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，测定肿瘤的klf5、tfdp1、mdm2和actb的mrna量而得到的结果的图。图25为小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，测定肿瘤的klf5、tfdp1、mdm2和actb的蛋白质水平的表达量而得到的结果的图。图26为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，tunel分析肿瘤组织而
得到的结果的图。图27为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，tunel分析肿瘤组织而得到的结果的图。图28为表示小鼠皮下实体瘤模型(大肠癌细胞株dld-1)中，测定肿瘤的cparp、ccaspase3和actb的蛋白量而得到的结果的图。图29为表示转染有mir-4711-5p、mir-21-5p、mir-152-5p、mir-153-3p、mir-448-3p和mir-34a的大肠癌细胞株(dld-1和hct116)的细胞增殖试验的结果的图。纵轴表示450nm的吸光度。图30为表示对由大肠癌患者得到的大肠癌细胞转染mir-4711-5p和mir-34a，并在72小时后观察细胞状态而得到的结果的图。图31为表示对由大肠癌患者得到的大肠癌细胞转染mir-4711-5p和mir-34a，并进行细胞增殖试验而得到的结果的图。
具体实施方式
11.1.癌治疗剂本发明的癌治疗剂的特征在于，包含mir-4711-5p作为有效成分。以下，对本发明的癌治疗剂进行详细说明。
12.[有效成分]本发明的癌治疗剂中，使用mir-4711-5p作为有效成分。mir-4711-5p为源自人的mirna，其碱基序列的成熟mirna(mature-mirna)为5'-ugcaucaggccagaagacaugag-3'(序列号1)。
[0013]
本发明的癌治疗剂中，作为有效成分使用的mir-4711-5p可以为成熟mirna，另外也可以为发夹型前体mirna(初级mirna)、初级mirna的一部分被切断而成的前体mirna。该初级mirna、前体mirna在细胞内接受加工而成为成熟mirna。另外，上述各mirna可以形成与具有互补碱基序列的rna构成的双链前体。该双链前体在癌细胞内解开双链而游离出成熟mirna。另外，按照产生由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸作为成熟mirna的方式设定发夹型前体mirna、前体mirna的碱基序列即可，上述碱基序列可由本领域技术人员适当设定。
[0014]
作为有效成分使用的mirna可以根据需要而进行通常对核酸实施的各种修饰，以赋予对酶的分解抗性等。作为上述修饰，例如可举出2'-o甲基化等糖链部分的修饰；碱基部分的修饰；氨基化、低级烷基氨基化、乙酰化等磷酸部分的修饰等。
[0015]
[适用对象]成为本发明的癌干细胞的癌治疗剂的适用对象的癌种类，没有特别限制，例如可举出大肠癌、食道癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、脑瘤、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。上述癌种类中，优选举出实体癌，进一步优选举出大肠癌。
[0016]
另外，本发明的癌治疗剂还能够抑制癌干细胞增殖，因此对于化学疗法无效的癌也可确认到有效的治疗效果，因此作为本发明的癌干细胞的癌治疗剂的适用对象的一个方式，可举出化学疗法无效的癌。
[0017]
[给药方法]作为本发明的癌治疗剂的给药方法，只要在生物体内能够将mir-4711-5p运送至上述癌组织或癌细胞就没有特别限制，例如，可举出血管内(动脉内或静脉内)注射、持续输液、皮下给药、局部给药、肌肉内给药、腹膜内给药等。其中，优选举出动静脉内给药。
[0018]
本发明的癌治疗剂的给药量可根据成为适用对象的癌干细胞的种类、患者的性别、年龄、症状等适当决定，因此不能一概而论，例如可举出以mir-4711-5p的成熟mirna量换算计每天为1～100mg/m2(体表面积)左右。
[0019]
[制剂化]本发明的癌治疗剂通过将mir-4711-5p输送至癌干细胞内并表现功能而发挥癌治疗效果，因此优选将本发明的癌治疗剂与mirna导入剂一起制剂化，从而容易将mir-4711-5p输送至癌细胞内。作为上述mirna导入剂，没有特别限制，例如可以是碳酸磷灰石颗粒、脂质体(lipofectamine)、oligofectamine、rnai fect等中的任一者。上述mirna导入剂中，碳酸磷灰石颗粒能够在生物体内积聚于癌细胞并有效将mir-4711-5p转移至癌细胞内，因此，作为本发明的癌治疗剂的优选的一个方式，可举出mir-4711-5p以与碳酸磷灰石颗粒混合的状态存在、或者mir-4711-5p复合(内包)于碳酸磷灰石颗粒而成的复合颗粒的状态存在。
[0020]
以下，对作为mir-4711-5p的导入剂使用的碳酸磷灰石颗粒进行说明。
[0021]
(碳酸磷灰石颗粒)碳酸磷灰石具有利用co3置换羟基磷灰石(ca
10
(po4)6(oh)2)的部分羟基而成的结构，其为通式ca
10-m
xm(po4)6(co3)
1-nyn
表示的化合物。在此，x为可部分置换碳酸磷灰石中的ca的元素，例如可举出sr、mn、稀土类元素等。m通常为0以上且1以下的正数，优选为0以上且0.1以下，更优选为0以上且0.01以下，进一步优选为0以上且0.001以下。y为可部分置换碳酸磷灰石中的co3的基团或元素，可举出oh、f、cl等。n通常为0以上且0.1以下的正数，优选为0以上且0.01以下，更优选为0以上且0.001以下，进一步优选为0以上且0.0001以下。
[0022]
本发明使用的碳酸磷灰石颗粒的平均粒径，只要为能够给药到生物体内而转移至细胞内的程度的大小就没有特别限制。具体而言，作为本发明使用的碳酸磷灰石颗粒的平均粒径，可举出通常超过30nm，优选为30～3000nm，进一步优选为30～2000nm，特别优选为30～1500nm。
[0023]
应予说明，上述碳酸磷灰石的平均粒径为通过动态光散射法颗粒计测(dls)测定得到的值。在存在不适合使用dls得测定的巨大颗粒(例如，粒径5μm以上)的情况下，它们会被排除在测定对象范围之外。另外，本说明书中，粒径是指：在利用扫描型探针显微镜进行测定时，能够作为单个颗粒识别的独立颗粒的粒径。因此，在多个颗粒发生凝聚的情况下，它们的集合体将被判断为一个颗粒。
[0024]
碳酸磷灰石颗粒可按照公知的方法得到。例如，可通过使钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子在水溶液中共存而制备得到。水溶液中的各离子浓度只要可形成碳酸磷灰石颗粒就没有特别限制，可参考以下适当设定。
[0025]
水溶液中的钙离子浓度可举出通常为0.1～1000mm，优选为0.5～100mm，进一步优选为1～10mm。
[0026]
水溶液中的磷酸根离子浓度可举出通常为0.1～1000mm，优选为0.5～100mm，进一步优选为1～10mm。
[0027]
水溶液中的碳酸氢根离子可举出浓度通常为1.0～10000mm，优选为5～1000mm，进一步优选为10～100mm。
[0028]
作为钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子的供给源，只要能够在水溶液中供给上述离子就没有特别限制，例如可举出上述离子的水溶性盐。具体而言，作为钙离子源，可使用cacl2，作为磷酸根离子源，可使用nah2po4·
2h2o，作为碳酸根离子源，可使用nahco3。
[0029]
用于制备碳酸磷灰石颗粒的水溶液，只要能够形成碳酸磷灰石颗粒则可以含有上述各离子供给源及其它物质以外的成分。例如，可以通过在水溶液中对上述组合物添加氟离子、氯离子、sr、mn等而对碳酸磷灰石中的ca或co3进行部分置换。其中，氟离子、氯离子、sr、mn的添加量优选设在不会对形成的复合体颗粒的ph溶解性、粒径范围产生显著影响的范围内。另外，用于制备碳酸磷灰石颗粒的水溶液可以使用水作为基剂，也可以使用用于培养细胞的各种培养基、缓冲液等。
[0030]
在本发明使用的碳酸磷灰石颗粒的制备中，各离子供给源和其它物质在水溶液中的混合顺序没有特别限定，只要可得到作为目标的碳酸磷灰石颗粒则可以以任何混合顺序来制备水溶液。例如，可在制备含有钙离子和其它物质的第1溶液的同时，另外制备含有磷酸根离子和碳酸氢根离子的第2溶液，将第1溶液和第2溶液混合而制备水溶液。
[0031]
碳酸磷灰石颗粒可通过将含有上述各离子的水溶液的ph调整到6.0～9.0的范围并放置(保温)一定时间而得到。作为形成碳酸磷灰石颗粒时的该水溶液的ph，例如可举出6.5～9.0，优选为6.7～8.8，进一步优选为6.7～8.6，更进一步优选为6.8～8.5，特别优选为7.0～8.5，最优选为7.1～8.0。
[0032]
形成碳酸磷灰石颗粒时的该水溶液的温度条件，只要能够形成碳酸磷灰石颗粒就没有特别限制，通常为0℃以上，例如可举出4℃以上或37℃。
[0033]
用于形成碳酸磷灰石颗粒的该水溶液的保温时间，只要能够形成碳酸磷灰石颗粒就没有特别限制，可举出通常为1分钟～24小时，优选为5分钟～1小时。是否形成颗粒，例如可通过在显微镜下观察来确认。
[0034]
另外，作为将碳酸磷灰石颗粒的平均粒径控制在上述范围的方法，没有特别限制，例如可举出在碳酸磷灰石颗粒的制造过程或碳酸磷灰石颗粒制造后添加分散剂的方法。关于分散剂的种类，只要能够使碳酸磷灰石颗粒分散就没有特别限制，为通常添加于药品的分散剂即可，作为示例，可举出白蛋白。分散剂可以单独使用1种，另外也可以组合使用2种以上。作为包含碳酸磷灰石颗粒的水溶液中的分散剂浓度，只要能够得到微细化和/或抑制再凝聚的效果就没有特别限制，例如可举出0.1～500mg/ml，优选为1～100mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml左右；或0.001～10重量％左右。另外，作为粒径的控制方法的另一示例，可举出对上述水溶液中形成的碳酸磷灰石颗粒进行超声波振动处理的方法。作为超声波振动处理，具体可举出：使超声波破碎机等超声波振子直接接触试样而施加超声波的处理；使用具备超声波振子和水槽(清洗槽)的超声波洗涤器，在该水槽中加入液体(例如，水)，使收纳碳酸磷灰石颗粒的容器(例如，塑料制管)浮在液体中，介由液体对包含碳酸磷灰石颗粒的水溶液施加超声波的处理等。通过上述超声波振动处理，能够简便且有效将碳酸磷灰石颗粒的粒径微细化到上述范围。
[0035]
上述的超声波振动处理的条件，只要能够将粒径控制在规定范围就没有特别限制。例如，在使用具备超声波振子和水槽(清洗槽)的超声波洗涤器进行的情况下，可例示以
下条件。水槽的温度：例如为5～45℃，优选为10～35℃，进一步优选为20～30℃。高频输出：例如为10～500w，优选为20～400w，进一步优选为30～300w，更优选为40～100w。振动频率：例如为10～60hz，优选为20～50hz，进一步优选为30～40hz。处理时间：例如为30秒～30分钟，优选为1～20分钟，进一步优选为3～10分钟。
[0036]
进行超声波振动处理时使用的、包含碳酸磷灰石颗粒的容器的种类，只要能够将颗粒微细化到规定的粒径范围就没有限制，可根据水溶液的体积、使用目的适当选择。例如，可使用1～1000ml容量的塑料制管。
[0037]
另外，超声波振动处理优选在分散剂存在下(即，在包含碳酸磷灰石颗粒的水溶液中添加分散剂的状态)进行。其原因在于，通过在分散剂和碳酸磷灰石颗粒共存的环境中进行超声波振动处理，可得到具有更微细的粒径的碳酸磷灰石纳米颗粒，还能够抑制颗粒的再凝聚。
[0038]
(mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒)在本发明的癌治疗剂的优选的一个方式中，使用mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒复合而成的复合颗粒。如此通过使mir-4711-5p复合于碳酸磷灰石颗粒，能够通过碳酸磷灰石的作用使mir-4711-5p积聚到生物体内的癌细胞中而在癌细胞内有效导入mir-4711-5p。另外，导入到细胞内后，mir-4711-5p在细胞内能够从碳酸磷灰石颗粒游离，因此还能够有效发挥mir-4711-5p产生的抗肿瘤效果。
[0039]
本发明中，mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒是指：mir-4711-5p通过离子键、氢键等吸附于碳酸磷灰石颗粒而担载的状态。mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒的形成方法，没有特别限制，例如可举出通过使mir-4711-5p和碳酸磷灰石颗粒在水溶液中共存而形成的方法；在制备碳酸磷灰石颗粒的水溶液中，使mir-4711-5p与钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子一起共存，从而同时进行碳酸磷灰石颗粒的形成以及mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合的方法；等。
[0040]
mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒的形成，在同时进行碳酸磷灰石颗粒的形成以及mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合的情况下，在用于制备碳酸磷灰石的水溶液中，例如以0.1～1000nm，优选为0.5～500nm，进一步优选为1～200nm的量添加mir-4711-5p即可。
[0041]
mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒中，mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的比率，没有特别限制，根据mir-4711-5p的给药量等适当设定即可。例如，在使2mg的mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒复合的情况下，可以在上述用于制备碳酸磷灰石颗粒的水溶液2.5l中，添加5mg的mir-4711-5p，从而同时进行碳酸磷灰石颗粒的形成以及mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合。
[0042]
另外，本发明中，在使用与碳酸磷灰石颗粒复合而成的mir-4711-5p的情况下，以分散于适合对生物体给药的溶剂中的状态来使用。如上述所示，碳酸磷灰石颗粒是通过使作为各种离子供给源的物质溶解于水、培养基或缓冲液等溶剂而得到的，如此得到的碳酸磷灰石颗粒分散溶液，从渗透压、缓冲性能、无菌性等观点出发，未被适合对生物体给药(血管内给药)。因此，为了将分散有碳酸磷灰石颗粒的溶剂置换为适合于对生物体给药的溶剂
(例如，生理盐水等)，通常需要通过离心从溶剂分离回收碳酸磷灰石颗粒而置换溶剂的操作。但是，如果进行上述操作，则碳酸磷灰石颗粒彼此凝聚，颗粒巨大，因此反而变成不适合对生物体给药的状态。因此，通过将凝聚的碳酸磷灰石颗粒添加到适合于对生物体给药的溶剂中并进行上述超声波振动处理，从而能够使mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒在适合于对生物体给药的溶剂中以适度粒径(上述范围的平均粒径)分散。
[0043]
另外，本发明的癌治疗剂中，在使用与碳酸磷灰石颗粒复合的mir-4711-5p的情况下，本发明的癌治疗剂的给药优选为：在通过超声波振动处理使mir-4711-5p与碳酸磷灰石颗粒的复合颗粒以微小颗粒状态分散后，在该颗粒凝聚前迅速进行。例如，优选在超声波振动处理后1分钟以内，优选30秒以内给药。但是，如上述所示，在通过添加白蛋白来抑制碳酸磷灰石颗粒凝聚的情况下，也能够在超声波振动处理后经过数分钟～数十分钟后给药。
[0044]
2.癌干细胞的增殖抑制剂mir-4711-5p也能够降低癌干细胞的干细胞性而抑制癌干细胞的增殖，因此本发明还提供一种包含mir-4711-5p作为有效成分的癌干细胞的增殖抑制剂。
[0045]
本发明的癌干细胞的增殖抑制剂为抑制癌干细胞增殖而使用的核酸药物，使用的有效成分、作为适用对象的癌种类、给药方法、制剂化等与上述“1.癌治疗剂”的情况相同。实施例
[0046]
以下，举出实施例来说明本发明。但是，不应解释为本发明限定于以下实施例。
[0047]
试验例1：候选mirna的提取使用mirbase和target scan这2个数据库，提取可能与klf5结合的mirna。从提取得到的mirna内，提取与wnt/β-连环蛋白信号、wnt/ca

信号和notch信号中的任一者有关的mirna。其结果，从mirbase提取29种mirna，从target scan提取31种mirna。从mirbase提取出的mirna与从target scan提取的mirna有16种是重复的，因此提取合计44种mirna。44种mirna中3种mirna已经进行过功能分析，因此将它们排除而选择41种mirna作为候选。
[0048]
试验例2：mirna的筛选使用上述提取的41种候选mirna进行大肠癌细胞株的增殖试验。具体而言，首先在96孔板的各孔中分别以5000细胞/孔的方式播种dld-1、hct116和ht29这3个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染候选mirna或阴性对照mirna(nc，5'-auccgcgcgauaguacgua-3'，序列号2)。转染开始72小时后，使用cell counting kit-8(同仁化学研究所)在glomax-multi detection system(promega)中测定细胞存活率(cell viability，％)。
[0049]
将结果示于图1。图1中，no.20的候选mirna为mir-4711-5p。由图1可知，确认到mir-4711-5p的大肠癌细胞株的增殖抑制效果优异。
[0050]
试验例3：mir-4711-5p对klf5的mrna水平的表达量产生的影响的分析分析对大肠癌细胞株的增殖抑制效果优异的mir-4711-5p对klf5 mrna表达量产生的影响。具体而言，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。在转染24小时后回收细胞，使用mirneasy kit(applied biosystems)提取总rna，通过pcr测定klf5 mrna量。
[0051]
将结果示于图2。其结果，确认到mir-4711-5p具有在mrna水平抑制大肠癌细胞株
中klf5表达的作用。
[0052]
试验例4：mir-4711-5p对klf5的蛋白质水平的表达量产生的影响的分析分析mir-4711-5p对klf5的蛋白质水平的表达量产生的影响。具体而言，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105个细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染48小时后回收细胞，提取细胞内的总蛋白，通过蛋白质印迹测定klf5的蛋白质水平的表达量。
[0053]
将结果示于图3。其结果，确认到转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株的klf5的表达在蛋白质水平上也受到抑制。
[0054]
试验例5：mir-4711-5p与klf5的结合的确认为了确认在转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株中mir-4711-5p是否与klf5结合，使用pmirglo dual-luciferase mirna target expression vector(promega)进行分析。首先，使用target scan确定预测为基于mir-4711-5p的强结合的结合位点1(klf5的3'utr的位置1186-1208，5'-aauaguaaugugaugcugaugcu-3'(序列号3))和预测为基于mir-4711-5p的弱结合的结合位点2(klf5的3'utr的位置917-939，5'-gacaauguugcauuuaugaugc-3'(序列号4)和klf5的3'utr的位置951-973，5'-caaaacguugaauugaugaugca-5'(序列号5)的2个区域)。制作包含结合位点1的dna分子(插入物1)和包含结合位点2(2个区域)的dna分子(插入物2)，将插入物1和2分别插入到pmirglo dual-luciferase mirna target expression vector的多克隆位点。
[0055]
在96孔板的各孔中分别以1.0
×
104细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，利用包含10％fbs(胎牛血清)的d-mem培养基培养12小时后，将培养基交换为不含血清的opti-mem培养基，使用lipofectamine 2000(invitrogen)共转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)以及插入有插入物1或2的质粒。在转染8小时后将培养基交换为含有10％fbs的d-mem培养基，进一步培养24小时后，按照制品的说明书测定荧光素酶蛋白表达量。
[0056]
将结果示于图4。其结果，通过mir-4711-5p抑制荧光素酶的表达，确认道mir-4711-5p结合于结合位点1和2这两者。
[0057]
试验例6：细胞增殖试验使用mir-4711-5p进行大肠癌细胞株的细胞增殖试验。具体而言，首先，在96孔板的各孔中分别以3.0
×
103细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc、序列号2)。转染开始24、48和72小时后，使用cell counting kit-8(同仁化学研究所)，在glomax-multi detection system(promega)中测定活细胞数。
[0058]
将结果示于图5。其结果，确认到：进行mir-4711-5p转染的情况下，与阴性对照相比，48和72小时后能够显著抑制dld-1和hct116的细胞增殖。
[0059]
试验例7：浸润分析使用mir-4711-5p进行大肠癌细胞株的浸润分析。具体而言，首先，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转
染开始24小时后，将细胞播种于bd biocoat matrigel invasion chambers(bd biosciences)并培养48小时。接着，利用苏木精进行核染色，测定浸润的细胞数。
[0060]
将结果示于图6。其结果，确认到：在进行mir-4711-5p转染的情况下，与阴性对照相比，有浸润能力的细胞数显著降低。
[0061]
试验例8：转移能力的评价使用mir-4711-5p，利用伤口愈合分析进行大肠癌细胞株的转移能力的评价。具体而言，首先，在24孔板中设置插入物(ibidi culture insert 2well(ibidi))，在各孔中分别以3.5
×
105～4.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养24小时。接着，除去插入物而制作伤口，继续进行培养，除去插入物开始24、48和72小时后，测定伤口面积。
[0062]
将结果示于图7。其结果，确认到：在进行mir-4711-5p转染的情况下，与阴性对照相比，伤口面积显著变宽，细胞的转移能力下降。
[0063]
试验例9：凋亡分析使用mir-4711-5p进行大肠癌细胞株的凋亡分析。具体而言，首先，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始48小时后，使用alexa fluor 488annexinv/dead cell apoptosis kit(thermo fisher scientific)处理细胞，使用sh800zcell sorter(sony biotechnology inc.)求出被annexinv染色的比例。另外，在转染开始48小时后回收细胞，提取细胞内的总蛋白，通过蛋白质印迹测定p53、survivin、cparp(cleaved parp)、ccaspase3(cleaved caspase3)和actb(β-actin)的表达量。
[0064]
将测定被annexinv染色的细胞(即，发生凋亡的细胞)的比例得到的结果示于图8，将p53、survivin、cparp、ccaspase3和acbt的表达量的测定结果示于图9。其结果，转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株中，被annexinv染色的细胞增加，可知强烈诱导凋亡。另外，具有野生型的p53的hct116中，通过转染mir-4711-5p而使p53的表达亢进，凋亡抑制蛋白即survivin的表达量减少，凋亡蛋白cparp和ccaspase3的表达量增加。另外，具有突变型p53的dld-1中，通过转染mir-4711-5p，survivin的表达降低，ccaspase3的表达量增加。即，上述结果表明，通过mir-4711-5p的转染而诱导了大肠癌细胞株的凋亡。
[0065]
试验例10：干细胞标志物的表达量的分析分析mir-4711-5p对大肠癌细胞株的干细胞标志物的表达量产生的影响。具体而言，首先，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始24小时后回收细胞，使用mirneasy kit(applied biosystems)提取总rna，通过pcr测定klf5、cd44v9、lgr5、bmi1和lrig1的mrna量。另外，转染开始48小时后的dld-1，通过facs测定细胞表面的cd44v9量。
[0066]
将测定klf5、cd44v9、lgr5、bmi1和lrig1的mrna量得到的结果示于图10，将通过facs测定dld-1表面的cd44v9量得到的结果示于图11。由图10可知，通过mir-4711-5p的转染，dld-1中，干细胞标志物cd44v9、lgr5和bmi1的表达得到抑制，hct116中，干细胞标志物cd44v9和bmi1的表达得到抑制。另外，由图11可知，通过mir-4711-5p的转染，dld-1的细胞
表面存在的cd44v9减少。根据以上结果可知，转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株中，干细胞标志物的表达得到抑制，mir-4711-5p具有降低癌干细胞的干细胞性的作用。
[0067]
试验例11：活性氧活性的测定干细胞性高的细胞具有使活性氧(reactive oxidant species,ros)活性保持低的性质。因此分析mir-4711-5p对大肠癌细胞株的ros活性产生的影响。具体而言，首先，在6孔板中以1.0
×
105个细胞/孔的方式播种dld-1，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始24小时后回收细胞，利用cellrox deep red(thermos fisher scientific)染色，通过facs测定ros活性。
[0068]
将结果示于图12。应予说明，图12的右图所示的ros活性为：判定为ros活性高的细胞的比例。高与低的截止值使用未暴露于cell rox试剂的细胞来确定。其结果，确认到：转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株中，ros活性高的细胞的比例增加，mir-4711-5p降低干细胞性。
[0069]
试验例12：细胞团形成能力的分析分析mir-4711-5p对大肠癌细胞株的细胞团形成能力产生的影响。具体而言，首先，在6孔板的各孔中分别以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始24小时后回收细胞，使细胞呈彼此不凝聚的状态，以1
×
103细胞/孔的方式播种于96孔超低吸附培养板(corning inc.,usa)，培养1周。应予说明，该培养使用包含egf 20ng/ml、bfgf 10ng/ml和青霉素g 100μg/ml的无血清dmem/f-12培养基。1周后，测定40μm以上的球状体数(n＝10)。
[0070]
将结果示于图13。其结果，确认到：转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株的球状体数减少，可知mir-4711-5p具有降低大肠癌细胞株的细胞团形成能力的作用。
[0071]
试验例13：ipa分析对转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株，使用下一代测序的结果进行ingenuity pathways analysis(ipa)。具体而言，首先，在6孔板的各孔中以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始36小时后回收细胞，利用mirneasy kit(applied biosystems)提取总rna。接着，使用得到的总rna制备文库后，对该文库进行下一代测序分析。然后使用进行下一代测序的结果，实施ingenuity pathways analysis。
[0072]
将结果示于图14。其结果提示，转染有mir-4711-5p的大肠癌细胞株抑制从细胞周期中的g1期进入s期。
[0073]
试验例14：细胞周期分析上述试验例13的结果提示，mir-4711-5p抑制从细胞周期中的g1期进入s期，因此详细分析mir-4711-5p对大肠癌细胞株的细胞周期产生的影响。具体而言，首先，在6孔板的各孔中以1.0
×
105细胞/孔的方式播种dld-1，使用含有10％fbs的d-mem培养基培养过夜。接着，将培养基交换成不含有fbs的d-mem培养基，培养24小时，然后使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始24小时后将培养基交换成含有10％fbs的d-mem培养基。接着培养8小时，然后回收细胞并进行细胞周期分析。细胞的回收和细胞周期分析的方法如以下所示。
uauggaauaaaacuacugaugca-3'(序列号7))。制作包含该结合位点的dna分子(插入物)，将插入物插入到pmirglo dual-luciferase mirna target expression vector的多克隆位点。
[0082]
在96孔板的各孔中以3.0
×
103细胞/孔的方式播种dld-1，使用包含10％fbs(胎牛血清)的d-mem培养基培养12小时后，将培养基交换成不含有血清的opti-mem培养基，使用lipofectamine 2000(invitrogen)共转染mir-4711-5p或阴性对照mirna(nc，序列号2)以及插入有插入物的质粒。转染8小时后将培养基交换成含有10％fbs的d-mem培养基，进一步培养24小时，然后按照制品的说明书测定荧光素酶活性。
[0083]
将结果示于图18。其结果，mir-4711-5p抑制荧光素酶的表达，确认到mir-4711-5p结合于mdm2的3'utr的位置2315-2337。
[0084]
试验例18：小鼠皮下实体瘤模型中的mir-4711-5p的抗肿瘤效果和安全性评价1.mirna与碳酸磷灰石的复合颗粒的制造在100ml的蒸馏水中依次添加0.37g的nahco3、90μl的nah2po4·
2h2o(1m)以及180μl的cacl2(1m)并使其溶解，利用1n的hcl将ph调整为7.5。利用直径0.2μm的过滤器将其过滤。相对于得到的缓冲液1ml混合2μg的mirna、4μl的cacl2(1m)，在37℃的水浴中保温30分钟。然后以15000rpm
×
5分钟进行离心，将得到的颗粒分散于生理盐水(含有0.5重量％白蛋白)，得到在碳酸磷灰石颗粒中内包有mirna的复合颗粒的分散液。在即将供于试验前，对得到的分散液进行10分钟超声波振动处理。应予说明，使用具有超声波振动功能的水浴，使收纳于塑料容器的上述分散液漂浮于设定为20℃的水中，在高频输出55w、振动频率38khz的条件下进行超声波振动处理10分钟。将如此得到的制剂立即用于后述的试验。
[0085]
应予说明，超声波振动处理的分散液生成由包含mirna的碳酸磷灰石纳米颗粒构成的复合颗粒，可确认到该复合颗粒中每1mg碳酸磷灰石包含约20μg左右的mirna。
[0086]
2.小鼠皮下实体瘤模型试验在6～8周龄的balb/ca裸鼠(雌，日本clea公司制造)的背部附近，以5
×
105个细胞/肿瘤的方式皮下注射dld-1，制作具有实体瘤的模型小鼠。在肿瘤达到约20mm3的大小的时刻，将小鼠随机分为mir-4711-5p给药组(mir-4711-5p)5只、阴性对照组(negative control)5只以及无处置组(parent)4只这3组。mir-4711-5p给药组，将肿瘤达到约20mm3的大小的时刻作为第0天，在第0天、第2天、第4天、第7天、第9天和第11天，以mir-4711-5p量换算计成为40μg/次的方式，从尾静脉静脉注射包含ir-4711-5p的碳酸磷灰石纳米颗粒。阴性对照组按照与mir-4711-5p给药组相同的给药方案和用量，由尾静脉静脉注射包含对照mirna(序列号2)的碳酸磷灰石纳米颗粒。无处置组未进行药剂的给药。试验期内，经时测定小鼠背部的肿瘤尺寸(长径
×
短径
×
短径
×
1/2)以及小鼠的体重。另外，第14天从小鼠摘取肿瘤并观察大小。另外第14天从小鼠摘取脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和结肠，进行苏木精
·
伊红染色，进行组织观察。
[0087]
将经时测定肿瘤尺寸得到的结果示于图19，将第14天从小鼠摘取的肿瘤的观察结果示于图20。其结果，mir-4711-5p给药组，与阴性对照组和未处置组相比，肿瘤尺寸显著小。
[0088]
另外，将经时测定小鼠体重得到的结果示于图21。其结果，3组间体重没有显著差异，确认到没有mir-4711-5p产生的副作用。
[0089]
另外，将第14天从小鼠摘取脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和结肠并进行苏木精
·
伊红染色的结果示于图22。根据各组织的苏木精
·
伊红染色的结果，也未确认到mir-4711-5p产生的副作用。
[0090]
试验例19：mir-4711-5p的抗肿瘤效果的评价在8周龄的balb/ca裸鼠(雌，日本clea公司制造)的背部附近，以2.5
×
106细胞/肿瘤的方式皮下注射dld-1，制作具有实体瘤的模型小鼠。将小鼠随机分成mir-4711-5p给药组(mir-4711-5p)3只以及阴性对照组(negative control)3只这2组。mir-4711-5p给药组，将皮下注射dld-1的时刻作为第0天，在第7天、第8天和第9天，以mir-4711-5p量换算计成为40μg/次的方式，从尾静脉静脉注射包含ir-4711-5p的碳酸磷灰石纳米颗粒(在与上述试验例18相同的条件下制备)。阴性对照组，按照与mir-4711-5p给药组相同的给药方案和用量从尾静脉静脉给药包含对照mirna(序列号2)的碳酸磷灰石纳米颗粒。第10天从小鼠中摘取肿瘤。
[0090]
通过pcr测定摘取的肿瘤中的mir-4711-5p量。另外，通过pcr测定摘取的肿瘤中的klf5、tfdp1和mdm2的mrna量。此外，从摘取的肿瘤提取总蛋白，通过蛋白质印迹测定klf5、tfdp1、mdm2、cparp(cleaved parp)、ccaspase3(cleaved caspase3)和actb(β-actin)的蛋白质水平的表达量。此外，对于摘取的肿瘤，通过tunel分析将因凋亡而产生的片段化dna染色，另外，通过hoechst将核染色。
[0092]
将测定肿瘤中的mir-4711-5p量得到的结果示于图23。其结果，mir-4711-5p给药组与阴性对照组相比，肿瘤中的mir-4711-5p量显著增加。
[0093]
另外，将测定肿瘤中的klf5、tfdp1、mdm2和actb的mrna量得到的结果示于图24，将测定肿瘤中的klf5、tfdp1、mdm2和actb的蛋白质量得到的结果示于图25。其结果，确认到mir-4711-5p给药组与阴性对照组相比，klf5、tfdp1和mdm2的表达量在mrna和蛋白质两方面降低。
[0094]
将进行tunel分析得到的结果示于图26和27，将测定cparp、ccaspase3和actb的蛋白水平的表达得到的结果示于图28。其结果可知，mir-4711-5p给药组中诱导凋亡的细胞显著增加，凋亡蛋白即cparp和ccaspase3的表达量增大。
[0095]
试验例20：细胞增殖试验(与其它mirna的比较)使用大肠癌细胞株(dld-1和hct116)，对报告mir-4711-5p、klf5的表达抑制作用的4种mirna(mir-21-5p、mir-152-5p、mir-153-3p和mir-448-3p)以及报告抗肿瘤效果的mir-34a进行细胞增殖试验。具体而言，首先，在96孔板的各孔中分别以3.0
×
103细胞/孔的方式播种dld-1和hct116这2个大肠癌细胞株，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p、mir-21-5p、mir-152-5p、mir-153-3p、mir-448-3p、mir-34a和阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始24、48和72小时后，使用cell counting kit-8(同仁化学研究所)在glomax-multi detection system(promega)中测定活细胞数。
[0096]
将结果示于图29。应予说明，图29的纵轴为450nm的吸光度。其结果，在进行mir-4711-5p的转染的情况下，可确认到最高的增殖抑制效果。
[0097]
试验例21：细胞增殖试验(使用从患者采取的大肠癌细胞的检验)使用由ii期和iii期的患者5名(pt.28、pt.36、pt.40、pt.41和pt.45)采取的大肠癌细胞进行细胞增殖试验。本试验是在得到大阪大学病院的伦理委员会的许可的基础上，并在该许可下使用由得到知情同意的5名大肠癌患者采取的大肠癌细胞进行。将从各患者
采取的大肠癌细胞的球状体与tryple express(invitrogen)一同在37℃保温30分钟而解离为单个大肠癌细胞。将得到的单个大肠癌细胞以4.0
×
103细胞/孔的方式播种在96孔板的各孔中，培养过夜后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)转染mir-4711-5p、mir-34a和阴性对照mirna(nc，序列号2)。转染开始72小时后，观测细胞的状态，并且使用cell counting kit-8(同仁化学研究所)，在glomax-multi detection system(promega)中测定活细胞数。
[0098]
将观察细胞状态得到的结果示于图30，将测定活细胞数得到的结果示于图31。其结果，确认到mir-4711-5p与mir-34a和阴性对照相比，对由大肠癌患者得到的大肠癌细胞的增殖抑制效果显著高(p《0.01p)。
[0099]
＜综合考察＞根据上述试验例1～9的结果阐明以下内容，可确认到mir-4711-5p具有抗肿瘤效果。(1)在针对klf5的mirna中，mir-4711-5p能够有效降低癌细胞的存活率，抑制癌细胞中的klf5的表达。(2)mir-4711-5p与klf5的3'utr结合。(3)mir-4711-5p能够抑制癌细胞的增殖、浸润和转移。(4)mir-4711-5p能够诱导癌细胞凋亡。
[0100]
另外，根据上述试验例10～12的结果阐明以下内容，可确认到mir-4711-5p降低癌细胞的干细胞性。(5)mir-4711-5p能够抑制癌干细胞的干细胞标志物的表达。(6)mir-4711-5p增大ros活性高的癌细胞的比例。(7)mir-4711-5p能够抑制癌细胞形成细胞团。
[0101]
另外，根据上述试验例13～17的结果阐明以下内容，可确认到mir-4711-5p能够抑制癌细胞由细胞周期中的g1期进入s期。(8)mir-4711-5p增加g0/g1期的癌细胞的比例。(9)通过mir-4711-5p抑制由g1期进入s期的机制之一为mir-4711-5p直接下调作为靶标的tfdp1。(10)通过mir-4711-5p抑制由g1期进入s期的机制之一为mir-4711-5p直接下调作为靶标的mdm2。
[0102]
根据试验例18和19的结果可确认到：mir-4711-5p在体内也发挥抗肿瘤效果且未观察到对正常组织的副作用。
[0103]
根据试验例20和21的结果可确认到：mir-4711-5p与已报告抗肿瘤效果的mir-34a相比具有优异的抗肿瘤效果，对从大肠癌患者摘取的大肠癌细胞也实际发挥了优异的抗肿瘤效果。