包含间充质细胞的细胞群、包含其的医药组合物及其制造方法与流程

1.本发明涉及可以在医学、生物化学等领域中利用的包含间充质细胞的细胞群、包含该细胞群的医药组合物、以及该细胞群的制造方法。


背景技术：

2.再生医疗是通过将在体外人工培养的干细胞等施用至患者体内，使损伤的器官、组织再生而使生物体功能恢复的医疗。近年来，将间充质干细胞、骨骼肌成肌细胞、上皮细胞等细胞施用于患者而促进组织、器官的再生、功能改善的新治疗方法的实用化快速发展。例如，以急性移植物抗宿主病(gvhd)、脊髓损伤的患者作为对象的骨髓间充质干细胞制剂、以严重心力衰竭的患者作为对象的骨骼肌成肌细胞片已经作为再生医疗等的产品而在日本国内销售。
3.再生医疗等所使用的大多数细胞具有粘附于培养基材的性质，在制造上述细胞制剂时，除了使细胞粘附于培养基材进行增殖培养的工序以外，还有将粘附于培养基材的细胞剥离的工序。上述的骨髓间充质干细胞也具有粘附于培养基材的性质，在使细胞粘附于培养基材的状态下进行增殖培养后，经过将细胞从培养基材剥离的工序，回收细胞悬浮液。作为上述将细胞从培养基材剥离的方法，可以列举例如：使用了胰蛋白酶这样的蛋白质分解酶、化学试剂的化学方式、使用了细胞刮刀这样的将细胞物理性剥离的器具的物理方式。例如，专利文献1公开了将胰蛋白酶添加于培养基材而使间充质干细胞剥离的方法。
4.另外，专利文献2公开了使用将细胞粘附性随温度而发生变化的温度响应型高分子包覆于表面而得到的培养基材，通过温度变化将细胞从培养基材剥离的方法。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本专利第5394932号公报
8.专利文献2：国际公开wo2001/068799


技术实现要素：

9.发明要解决的问题
10.如上所述，开发了各种将间充质干细胞等粘附性细胞从培养基材剥离的方法。然而，在专利文献1的方法中，培养细胞会因胰蛋白酶等化学物质而受到损伤。另外，在通过胰蛋白酶处理而将培养细胞从培养基材剥离时，被剥离的细胞成为单个细胞，无法以细胞片的形态剥离。
11.另外，在专利文献2的方法中，作为成为细胞培养的支架的培养基材，需要使用特定的材料，因此制造成本增加。
12.因此，本发明的问题在于提供不使用化学方式、物理方式、特殊培养基材而从培养基材自发剥离的细胞群、其制造方法、以及包含其的医药组合物。
13.解决问题的方法
14.本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，包含呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上、且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的间充质细胞的细胞群可自发地从基材剥离而不需要特殊的手段、器具。本发明是基于这样的见解而完成的。
15.即，根据本说明书，可以提供以下的发明。
16.(1)一种细胞群，其是包含间充质细胞的细胞群，
17.在上述细胞群中，呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上，且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上。
18.(2)根据(1)所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，呈cd326阳性的细胞的比率为10％以下。
19.(3)根据(1)或(2)所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，呈cd73阳性的间充质细胞的比率为80％以上，呈cd166阳性的间充质细胞的比率为80％以上，呈cd45阳性的细胞的比率为10％以下，且呈cd105阳性的间充质细胞的比率为70％以上。
20.(4)根据(1)～(3)中任一项所述的细胞群，其中，上述间充质细胞来自于胎儿附属物。
21.(5)一种包含间充质细胞的细胞群的制造方法，该方法包括：
22.对包含间充质细胞的细胞群进行培养的工序、以及
23.从上述包含间充质细胞的细胞群中筛选具有以下所示的(a)及(b)的特性的细胞群的工序，
24.(a)在上述细胞群中，呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上，
25.(b)在上述细胞群中，呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上。
26.(6)一种医药组合物，其包含(1)～(4)中任一项所述的细胞群和药学上可接受的介质。
27.(7)根据(6)所述的医药组合物，其中，以间充质细胞的1次给药量为10
12
个以下的方式对人给药。
28.(8)根据(6)或(7)所述的医药组合物，其中，上述医药组合物为注射用制剂。
29.(9)根据(6)或(7)所述的医药组合物，其中，上述医药组合物为细胞团块或片状结构的移植用制剂。
30.(10)根据(6)～(9)中任一项所述的医药组合物，其是选自免疫相关疾病、缺血性疾病、下肢缺血、脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、神经系统疾病、移植物抗宿主病、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、放射性肠炎、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、胶原性疾病、脑卒中、脑梗塞、脑血肿、脑血管麻痹(cerebrovascular paralysis)、脑肿瘤、肝硬化、特应性皮炎、多发性硬化症、牛皮癣、大疱性表皮松解症、糖尿病、蕈样真菌病、硬皮病、由软骨等结缔组织的变性和/或炎症引起的疾病、关节软骨缺损、半月板损伤、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死、膝骨性关节炎(knee osteoarthritis)、炎性关节炎(inflammatory arthritis)、类风湿性关节炎、眼病、血管新生相关疾病(angiogenesis-related disease)、缺血性心脏病、冠心病、心肌梗塞、心绞痛、心力衰竭、心肌病、心瓣膜病、创伤、上皮损伤、纤维症(fibrosis)、肺病、肌肉萎缩症、慢性胰腺炎、慢性肾炎、以及癌中的疾病的治疗剂。
31.(11)(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群在医药组合物的制造中的用
途。
32.(12)(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群在细胞治疗剂的制造中的用途。
33.(13)(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群在用于心肌的再生、心肌细胞的产生、血管新生、血管的修复、或免疫应答的抑制的药物的制造中的用途。
34.(14)根据(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群，其用于疾病的治疗。
35.(15)根据(14)所述的细胞群，其中，上述疾病为(10)所述的疾病。
36.(16)根据(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群，其用于对患者或受试者给药并进行心肌的再生、心肌细胞的产生、血管新生、血管的修复、或免疫应答的抑制。
37.(17)一种患者或受试者的疾病的治疗方法，该方法包括：对患者或受试者给药治疗有效量的(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群的工序。
38.(18)根据(17)所述的方法，其中，上述疾病为上述(10)所述的疾病，上述患者或受试者为需要上述疾病的治疗的患者或受试者。
39.(19)根据(17)或(18)所述的方法，其中，患者为人，1次的给药量为10
12
个细胞以下。
40.(20)根据(17)、(18)或(19)所述的方法，其中，上述细胞群具有细胞团块或片状结构。
41.(21)对患者或受试者进行心肌的再生、心肌细胞的产生、血管新生、血管的修复、或免疫应答的抑制的方法，该方法包括：对患者或受试者给药治疗有效量的(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群的工序。
42.(22)根据(21)所述的方法，其中，患者为人，1次的给药量为10
12
个细胞以下。
43.(23)根据(21)或(22)所述的方法，其中，上述细胞群具有细胞团块或片状结构。
44.本说明书包含作为本技术的优先权基础的日本专利申请编号2019-111470号的公开内容。
45.发明的效果
46.本发明的一个以上实施方式的细胞群即使不使用化学方法和/或物理方法也会自发地从培养基材剥离。
47.本发明的一个以上实施方式的细胞群的制造方法可以高效地制造具有上述效果的细胞群。
48.本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以用于免疫相关疾病等的治疗。
附图说明
49.图1是评价1中的由供体#1制备的比较例1的第5次传代的细胞群在培养第21天的细胞形态的观察像(倍率40倍)。
50.图2是评价2中的由供体#1制备的实施例1的第5次传代的细胞群在培养第10天的细胞形态的观察像(倍率40倍)。观察到了部分细胞的剥离。
51.图3是评价2中的由供体#3制备的实施例2的第2次传代的细胞群在培养第10天的细胞形态的观察像(倍率100倍)。观察到了部分细胞的剥离。
52.图4是评价2中的由供体#3制备的实施例2的第2次传代的细胞群在培养第11天的
细胞形态的观察像(倍率40倍)。观察到了从基材剥离的细胞片凝聚成的块状结构物(细胞团块)。
具体实施方式
53.[1]用语说明
[0054]
本说明书中的“间充质细胞(mesenchymal cells)”是指呈现cd73阳性、cd90阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阴性、以及cd326阴性中的至少1种细胞，代表性地是指满足以下i)及ii)的特征的细胞，“间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells)”及“间充质干细胞(mesenchymal stem cells：msc)”也包含于本发明的间充质细胞。
[0055]
作为“间充质细胞”，在能够从各种组织及器官中采集的体细胞(组织细胞)中，可以使用呈现cd73阳性、cd90阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阴性、cd326阴性中的至少1种的细胞，优选可以使用满足下述i)及ii)的特征的细胞。作为上述体细胞，没有特别限定，可以列举例如：脂肪细胞、脂肪干细胞、神经细胞、神经干细胞、心肌细胞、心肌干细胞、肝细胞、肝干细胞、上皮细胞、上皮干细胞、骨骼肌细胞、骨骼肌干细胞、造血细胞、造血干细胞、间充质细胞、间充质干细胞、羊膜来源的间充质细胞、羊膜来源的间充质干细胞、羊膜上皮来源的间充质细胞、羊膜上皮来源的间充质干细胞、羊膜细胞外基质层来源的间充质细胞、羊膜细胞外基质层来源的间充质干细胞、消化道上皮细胞、消化道上皮干细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞、滑膜干细胞等。
[0056]
本说明书中的间充质细胞的典型特征
[0057]
i)在标准培养基的培养条件下对塑料显示出粘附性。这里所谓的标准培养基是指在基础培养基(例如：αmem培养基)中添加了血清、血清代替试剂或增殖因子(例如：作为血清代替试剂的人血小板溶解物)的培养基。
[0058]
ii)表面抗原的cd73、cd90为阳性，cd45、cd326为阴性。
[0059]
上述“间充质细胞”只要是呈现cd73阳性、cd90阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阴性、cd326阴性中的至少1种的细胞即可，例如可以为呈现cd73阳性、cd90阳性、cd45阴性及cd326阴性的细胞，对于是否具有分化为骨、软骨、脂肪等的分化能力没有特别限定。本说明书中的“间充质细胞”也包括如间充质干细胞那样具有分化为骨、软骨及脂肪的分化能力的细胞。另外，上述“间充质细胞”也包括虽然呈现cd73阳性、cd90阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阴性、cd326阴性中的至少1种、但并不具有分化为骨、软骨、脂肪的分化能力的细胞。另外，上述“间充质细胞”还包括虽然呈现cd73阳性、cd90阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阴性、cd326阴性中的至少1种、但仅分化为骨、软骨、脂肪中的1种或2种的细胞。
[0060]
在本说明书中，“胎儿附属物”是指胎膜、胎盘、脐带及羊水。另外，“胎膜”是包含胎儿的羊水的胎囊，从内侧起由羊膜、绒毛膜及蜕膜形成。其中，羊膜和绒毛膜起源于胎儿。“羊膜”是指位于胎膜最内层的缺乏血管的透明薄膜，内壁被具有分泌功能的一层上皮细胞覆盖并分泌羊水。羊膜的内层(也被称为上皮细胞层)被具有分泌功能的一层上皮细胞包覆，分泌羊水，羊膜的外层(也被称为细胞外基质层，相当于基质)包含间充质细胞。
[0061]
本说明书中的“包含间充质细胞的细胞群”的形态没有特别限定，可以列举例如：细胞粒、细胞聚集体、细胞片、细胞漂浮液、细胞悬浮液、它们的冷冻物等。
[0062]
在本说明书中，对于给定的表面抗原的“呈阳性的(间充质)细胞的比率”如后述的
实施例中的记载所述，表示在作为对象的细胞群中通过流式细胞术分析得到的对给定表面抗原为阳性的细胞的比率。在本说明书中，对给定的表面抗原呈阳性的细胞的比率有时记载为“阳性率”，另外，对给定的表面抗原呈阴性的细胞的比率有时记载为“阴性率”。
[0063]
在本说明书中，细胞群中的给定细胞的比率是指上述给定细胞的细胞数相对于作为对象的细胞群的总细胞数的比例。
[0064]
在本说明书中，“间充质细胞”、“包含间充质细胞的细胞群”及“胎儿附属物”优选来自于人。
[0065]
[2]包含间充质细胞的细胞群
[0066]
本发明的一个以上实施方式的细胞群为包含间充质细胞的细胞群，在上述细胞群中，呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上，且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上。呈cd324阳性的细胞可以为间充质细胞。
[0067]
将包含具有该特征的间充质细胞的细胞群在基材上培养时，即使不使用通常的化学方法和/或物理方法，包含间充质细胞的细胞群也会自发地从基材剥离。在更优选的方式中，上述包含间充质细胞的细胞群以细胞片的形态自发地从基材剥离。
[0068]
本说明书中的“包含间充质细胞的细胞群”只要是至少包含间充质细胞的细胞群即可，没有特别限定，可以为包含其它细胞的群体。上述包含间充质细胞的细胞群中的间充质细胞的比率可以为70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、97％以上、99％以上、100％，但没有特别限定。
[0069]
另外，上述包含间充质细胞的细胞群中的其它细胞的比率可以为30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、3％以下、1％以下、0％。需要说明的是，上述其它细胞只要为间充质细胞以外即可，没有特别限定，可以列举例如淋巴细胞、粒细胞、红细胞等血细胞类细胞。
[0070]
表面抗原的cd324是指分化群324，是已知为上皮钙粘蛋白(e-cadherin)的蛋白质。
[0071]
表面抗原的cd90是指分化群90，是已知为thy-1的蛋白质。
[0072]
在上述细胞群中，呈cd324阳性的细胞的比率可以更优选为75％以上、80％以上、85％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上。
[0073]
在上述细胞群中，呈cd90阳性的间充质细胞的比率可以更优选为91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，可以为100％。
[0074]
本发明的一个以上实施方式的细胞群优选呈cd326阳性的细胞的比率为10％以下。
[0075]
cd326是指分化群326，是已知为epcam的蛋白质。
[0076]
在上述细胞群中，呈cd326阳性的细胞的比率可以更优选为5％以下(阴性率95％以上)、4％以下(阴性率96％以上)、3％以下(阴性率97％以上)、2％以下(阴性率98％以上)、1％以下(阴性率99％以上)，可以为0％(阴性率100％)。
[0077]
根据本发明的一个方式，由本发明提供的包含间充质细胞的细胞群优选满足以下的1项以上，更优选全部满足：呈cd73阳性的间充质细胞的比率为90％以上、呈cd166阳性的
间充质细胞的比率为80％以上、呈cd105阳性的间充质细胞的比率为70％以上、呈cd45阳性的细胞的比率为10％以下。另外，根据本发明的一个方式，由本发明提供的包含间充质细胞的细胞群优选呈cd34阳性的细胞的比率为10％以下。
[0078]
cd73是指分化群73，是已知为5-核苷酸酶或ecto-5
’‑
核苷酸酶的蛋白质。
[0079]
cd166是指分化群166，是已知为activated leukocyte cell adhesion molecule(alcam)的蛋白质。
[0080]
cd105是指分化群105，是已知为endoglin的蛋白质。
[0081]
cd45是指分化群45，是已知为ptprc(protein tyrosine phosphatase,receptor type,c)或lca(leukocyte common antigen)的蛋白质。
[0082]
cd34是指分化群34，是已知为hematopoietic progenitor cell antigen cd34的蛋白质。
[0083]
在上述细胞群中，呈cd73阳性的间充质细胞的比率可以更优选为91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，可以为100％。
[0084]
在上述细胞群中，呈cd166阳性的间充质细胞的比率可以更优选为85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
[0085]
在上述细胞群中，呈cd105阳性的间充质细胞的比率可以更优选为74％以上、75％以上、80％以上、85％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上。
[0086]
在上述细胞群中，呈cd45阳性的细胞的比率可以更优选为5％以下(阴性率95％以上)、4％以下(阴性率96％以上)、3％以下(阴性率97％以上)、2％以下(阴性率98％以上)、1％以下(阴性率99％以上)，可以为0％(阴性率100％)。
[0087]
在上述细胞群中，呈cd34阳性的细胞的比率可以更优选为5％以下(阴性率95％以上)、4％以下(阴性率96％以上)、3％以下(阴性率97％以上)、2％以下(阴性率98％以上)、1％以下(阴性率99％以上)，可以为0％(阴性率100％)。
[0088]
这里，cd324阳性、cd90阳性、cd326阳性、cd73阳性、cd166阳性、cd105阳性、cd45阳性及呈cd34阳性的细胞或间充质细胞分别是指cd324、cd90、cd326、cd73、cd166、cd105、cd45及cd34的表达为阳性的细胞或间充质细胞。
[0089]
在本发明的一个以上实施方式中，作为指标的表达标记(cd324、cd90、cd326、cd73、cd166、cd105、cd45或cd34)可以通过该技术领域中公知的任意检测方法进行检测。作为检测表达标记的方法，可以列举例如：流式细胞术或细胞染色，但并不限定于此。在使用荧光标记抗体的流式细胞术中，在检测到比阴性对照(同型对照)发出更强荧光的细胞时，判断该细胞为对该标志物呈“阳性”。荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体，可以列举利用例如异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)等进行了标记的抗体，但并不限定于此。在细胞染色中，在显微镜下观察到着色或发出荧光的细胞时，判断该细胞对该标志物呈“阳性”。细胞染色可以是使用抗体的免疫细胞染色，也可以是不使用抗体的非免疫细胞染色。对于免疫细胞染色中使用的抗体，没有特别限定，为了检测目标标记，可以使用通常已知的抗体，优选使用后述的实施例中使用的抗体。例如，为了检测cd324阳性而使用的抗体没有特别限定，可以使用由rea811、67a4、spm381的克隆制作的
抗体来检测cd324阳性，其中，在本发明的一个以上实施方式中，更优选使用由rea811的克隆制作的抗体来检测cd324阳性。需要说明的是，表达标记与表面抗原含义相同，两者可以置换使用。
[0090]
对于本发明的一个以上实施方式的细胞群而言，有无分化能力没有特别限定，优选具有分化为软骨组织的分化能力、且不具有分化为脂肪组织的分化能力或分化为脂肪组织的分化能力低，进一步优选分化为骨组织的分化能力低或不具有分化为骨组织的分化能力。
[0091]
本发明的一个以上实施方式的细胞群可以在冷冻状态下保存至即将使用之前。上述的细胞群除间充质细胞及其它细胞以外还可以包含任意的成分。作为这样的成分，可以列举例如：盐类、多糖类(例如，hes、葡聚糖等)、蛋白质(例如，白蛋白等)、dmso、培养基成分(例如，rpmi1640培养基中包含的成分等)等，但并不限定于此。
[0092]
[3]包含间充质细胞的细胞群的制造方法
[0093]
本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群的制造方法包括：对包含间充质细胞的细胞群进行培养的工序、从上述包含间充质细胞的细胞群中筛选具有以下特性的细胞群的工序：(a)在上述细胞群中，cd324呈阳性的细胞的比率为70％以上，(b)在上述细胞群中，cd90呈阳性的间充质细胞的比率为90％以上。
[0094]
根据本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群的制造方法，可以制备具有上述(a)及(b)的特性的包含间充质细胞的细胞群。上述特性作为得到能够从基材自发地剥离的包含间充质细胞的细胞群时的指标是有用的。另外，上述特性作为不使剥离后的间充质细胞群成为单个细胞的形态而以细胞片的形态获得时的指标是有用的。
[0095]
在上述细胞群的制造方法中，对包含间充质细胞的细胞群进行培养的工序与从上述包含间充质细胞的细胞群中筛选具有上述特性的细胞群的工序可以是不同的工序，也可以是一体的工序。作为上述两个工序为一体的工序的例子，例如，如后所述，在能够筛选满足上述(a)及(b)中一者或两者的特性的细胞群的特定条件下对包含间充质细胞的细胞群进行培养。
[0096]
在上述细胞群的制造方法中，筛选满足上述特性的细胞群的工序只要是能够筛选满足上述特性的细胞群的工序即可，没有特别限定。作为这样的工序，可以举出例如用细胞分选仪选择满足(a)的细胞群，接着，在能够对得到的细胞群筛选满足(b)的细胞群的条件下进行培养。另外，可以用细胞分选仪选择满足(b)的细胞群，接着，在能够对得到的细胞群筛选满足(a)的细胞群的条件下进行培养。另外，作为满足上述特性的细胞群的其它制备方法，可以举出在能够筛选满足上述(a)及(b)的细胞群的特定条件下对细胞群进行培养。对于培养条件、培养方法的详细情况，在以下进行说明。另外，也可以使用后述的细胞群的筛选方法中记载的方法，筛选满足上述特性的细胞群。
[0097]
本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群的制造方法可以优选进一步包括：通过对羊膜等胎儿附属物进行酶处理，获得作为原料的包含间充质细胞的细胞群的细胞群获得工序。
[0098]
羊膜由上皮细胞层和细胞外基质层形成，后者包含间充质细胞。上述的细胞群获得工序可以进一步包括通过剖宫产得到羊膜的工序。
[0099]
包含从胎儿附属物采集到的细胞的细胞群更优选为对从胎儿附属物采集到的试
样至少用胶原酶进行处理而得到的细胞群，所述试样包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层。
[0100]
从胎儿附属物采集到的试样(优选为包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的试样)的酶处理优选为利用能够使胎儿附属物的细胞外基质层中包含的间充质细胞游离、且不会分解上皮细胞层的酶(或其组合)进行的处理。作为这样的酶，没有特别限定，可以举出例如胶原酶和/或金属蛋白酶。作为金属蛋白酶，可以举出作为将非极性氨基酸的n末端侧切断的金属蛋白酶的嗜热菌蛋白酶和/或分散酶(dispase)，没有特别限定。
[0101]
胶原酶的活性浓度优选为50pu/ml以上、更优选为100pu/ml以上、进一步优选为200pu/ml以上。另外，胶原酶的活性浓度没有特别限定，例如为1000pu/ml以下、900pu/ml以下、800pu/ml以下、700pu/ml以下、600pu/ml以下、500pu/ml以下。这里，pu(protease unit)定义为在ph7.5、30℃下1分钟分解1ug的fitc-collagen的酶量。
[0102]
金属蛋白酶(例如，嗜热菌蛋白酶和/或分散酶)的活性浓度优选为50pu/ml以上、更优选为100pu/ml以上、进一步优选为150pu/ml以上、进一步优选为190pu/ml以上。另外，金属蛋白酶的活性浓度优选为1000pu/ml以下、更优选为900pu/ml以下、进一步优选为800pu/ml以下、进一步优选为700pu/ml以下、进一步优选为600pu/ml以下、进一步优选为500pu/ml以下、进一步优选为300pu/ml以下。这里，在使用了分散酶作为金属蛋白酶的方式中，pu(protease unit)定义为在ph7.5、30℃下1分钟内从乳酸酪蛋白(casein lactate)游离出相当于1ug酪氨酸的氨基酸的酶量。在上述的酶浓度的范围，可以防止胎儿附属物的上皮细胞层中包含的上皮细胞的混入，同时可以使细胞外基质层中包含的间充质细胞效率良好地游离。胶原酶和/或金属蛋白酶的优选的浓度的组合可以通过酶处理后的胎儿附属物的显微镜观察、获得的细胞的流式细胞术来确定。
[0103]
从高效率地回收活细胞的观点考虑，优选将胶原酶及金属蛋白酶组合对胎儿附属物进行处理。进一步优选通过上述组合对胎儿附属物同时一并进行处理。作为该情况下的金属蛋白酶，可以使用嗜热菌蛋白酶和/或分散酶(dispase)，但并不限定于此。可以通过使用含有胶原酶及金属蛋白酶的酶液对胎儿附属物仅进行一次处理而简便地获得间充质细胞。另外，通过同时一并进行处理，可以减少细菌、病毒等的污染的风险。
[0104]
胎儿附属物的酶处理优选将使用生理盐水、hank’s平衡盐溶液等清洗液进行了清洗的羊膜浸渍于酶液，一边通过搅拌装置进行搅拌，一边进行处理。作为这样的搅拌装置，从使胎儿附属物的细胞外基质层中包含的间充质细胞效率良好地游离的观点考虑，可以使用例如搅拌器或振动器，但并不限定于此。搅拌速度没有特别限定，在使用了搅拌器或振动器的情况下，例如为5rpm以上、10rpm以上、20rpm以上、30rpm以上、40rpm以上或50rpm以上。另外，搅拌速度没有特别限定，在使用了搅拌器或振动器的情况下，例如为100rpm以下、90rpm以下、80rpm以下、70rpm以下或60rpm以下。酶处理时间没有特别限定，例如为10分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、40分钟以上、50分钟以上、60分钟以上、70分钟以上、80分钟以上或90分钟以上。另外，酶处理时间没有特别限定，例如为6小时以下、5小时以下、4小时以下、3小时以下、2小时以下、110分钟以下、100分钟以下。酶处理温度没有特别限定，例如为15℃以上、16℃以上、17℃以上、18℃以上、19℃以上、20℃以上、21℃以上、22℃以上、23℃以上、24℃以上、25℃以上、26℃以上、27℃以上、28℃以上、29℃以上、30℃以上、31℃以上、32℃以上、33℃以上、34℃以上、35℃以上或36℃以上。另外，酶处理温度没有特别限定，
例如为40℃以下、39℃以下、38℃以下或37℃以下。
[0105]
在本发明的一个以上实施方式的制造方法中，可以根据希望利用过滤器、离心分离、中空纤维分离膜、细胞分选仪等公知的方法从包含游离的间充质细胞的酶溶液中分离和/或回收游离的间充质细胞。优选利用过滤器对包含游离的间充质细胞的酶溶液进行过滤。在利用过滤器对上述酶溶液进行过滤的方式中，仅游离的细胞通过过滤器，未被分解的上皮细胞层无法通过过滤器而残留在过滤器上，因此不仅能够容易地分离和/或回收游离的间充质细胞，也可以减小细菌、病毒等污染的风险。作为过滤器，没有特别限定，可以举出例如筛网过滤器。筛网过滤器的孔径(筛孔的大小)没有特别限定，例如为40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、或90μm以上。另外，筛网过滤器的孔径没有特别限定，例如为200μm以下、190μm以下、180μm以下、170μm以下、160μm以下、150μm以下、140μm以下、130μm以下、120μm以下、110μm以下、或100μm以下。关于过滤速度，没有特别限定，通过使筛网过滤器的孔径为上述范围，可以通过使包含间充质细胞的酶溶液自然滴落来进行过滤，由此能够防止细胞生存率的降低。
[0106]
作为筛网过滤器的材质，优选使用尼龙。可以利用广泛用作研究用途的falcon细胞过滤器等具有40μm、70μm、95μm或100μm尼龙筛网过滤器的管。另外，可以利用血液透析等使用的医疗用网眼布(尼龙及聚酯)。另外，也可以利用体外循环时使用的动脉过滤器(聚酯筛网过滤器、孔径：40μm以上且120μm以下)。也可以使用其它材质，例如，不锈钢筛网过滤器等。
[0107]
在使间充质细胞通过过滤器时，优选为自然滴落(自由落下)。也可以为使用了泵等的抽吸等强制性的过滤器通过，为了避免对细胞造成损伤，优选设为尽量弱的压力。
[0108]
通过过滤器的包含间充质细胞的细胞群可以在用倍量或其以上量的培养基或平衡盐缓冲液将滤液稀释之后，通过离心分离进行回收。作为平衡盐缓冲液，可以使用dulbecco’s磷酸缓冲液(dpbs)、earle’s平衡盐溶液(ebss)、hank’s平衡盐溶液(hbss)、磷酸缓冲液(pbs)等，但并不限定于此。
[0109]
本发明的一个以上实施方式的制造方法包括：对包含间充质细胞的细胞群进行培养的工序。
[0110]
包含间充质细胞的细胞群的培养工序中的细胞的接种密度没有特别限定，例如可以以例如500～10,000细胞/cm2的密度进行接种。作为上述接种密度的下限，例如优选为500细胞/cm2以上、1,000细胞/cm2以上、2,000细胞/cm2以上、3,000细胞/cm2以上、4,000细胞/cm2以上、5,000细胞/cm2以上。另外，作为上述接种密度的上限，例如优选为10,000细胞/cm2以下、9,000细胞/cm2以下、8,000细胞/cm2以下、7,000细胞/cm2以下。
[0111]
需要说明的是，上述进行培养的工序可以包括传代工序，也可以包括在不同的培养条件下重复多次培养的工序。
[0112]
作为上述的1次培养的培养期间，可以举出例如4～10天，更具体可以举出4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
[0113]
上述的培养所使用的培养基可以通过以任意的动物细胞培养用液体培养基作为基础培养基并根据需要适当添加其它成分(血清、血清代替试剂、增殖因子等)而制备。需要说明的是，在上述基础培养基中添加增殖因子的方式中，可以通过向增殖因子中进一步添加用于使增殖因子在培养基中稳定化的试剂(肝素等)而制备，也可以预先用凝胶、多糖类
等使增殖因子稳定化，然后对上述基础培养基添加稳定化的增殖因子，从而制备。由此，为了对包含间充质细胞的细胞群进行培养，将在基础培养基中添加了血清、血清代替试剂或增殖因子而成的培养基定义为标准培养基。
[0114]
作为基础培养基，可以使用bme培养基、bgjb培养基、cmrl1066培养基、glasgow mem培养基、improved mem zinc option培养基、imdm培养基(iscove’s modified dulbecco’s medium)、medium 199培养基、eagle mem培养基、αmem(alpha modification of minimum essential medium eagle)培养基、dmem培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)、ham’s f10培养基、ham’s f12培养基、rpmi 1640培养基、fischer’s培养基、以及它们的混合培养基(例如，dmem/f12培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium/nutrient mixture f-12 ham))等培养基，没有特别限定。作为优选的基础培养基，可以示例出αmem培养基。
[0115]
作为可在基础培养基中添加的其它成分，可以列举例如：白蛋白、牛血清、血清代替试剂或增殖因子等，优选为血清代替试剂，特别优选为人血小板溶解物。其中，优选在包含血清代替试剂、且不包含白蛋白、牛血清及增殖因子的基础培养基中进行培养。作为人血小板溶解物在培养基中的浓度的下限，可以列举例如以最终浓度计为1重量％以上、2重量％以上、3重量％以上。另外，作为人血小板溶解物在培养基中的浓度的上限，例如优选为20重量％以下、10重量％以下、7重量％以下。
[0116]
另外，上述的培养所使用的培养基可以使用通常市售的无血清培养基。可以列举例如stk1、stk2(ds pharma biomedical公司)、exprep msc medium(biomimetics sympathies公司)、corning stemgro人间充质干细胞培养基(corning公司)等，没有特别限定。
[0117]
包含间充质细胞的细胞群的培养例如可以在以下的工序中进行。首先，将细胞悬浮液离心分离，去除上清，将得到的细胞粒悬浮于培养基。接着，将细胞接种于培养容器(例如塑料制培养容器)，在3％以上且5％以下的co2浓度、37℃的环境中使用培养基进行培养。通过上述培养获得的细胞是1次培养后的细胞。
[0118]
上述的1次培养后的细胞例如可以如下所述进一步进行传代、培养。首先，将第1次培养中培养至达到汇合度95％以下的细胞用乙二胺四乙酸(edta)处理后，用胰蛋白酶进行处理，使其从培养容器(例如塑料制培养容器)剥离。本发明的一个以上实施方式中制造的细胞群是能够形成可以在平稳的条件下从基材剥离的细胞培养物的细胞群，在利用胰蛋白酶处理从培养容器剥离时也能够容易地剥离，因此可以减轻由胰蛋白酶处理对细胞造成的损伤。另外，在细胞群在基材上形成了细胞片的情况下，可容易地将细胞片从基材剥离，并且容易地利用酶处理使细胞片溃散而得到细胞悬浮液，因此能够减轻对细胞的损伤。接者，将得到的细胞悬浮液离心分离，去除上清，将得到的细胞粒悬浮于培养基。最后，将细胞接种于培养容器(例如塑料制培养容器)，在3％以上且5％以下的co2浓度、37℃环境中使用培养基进行培养。通过上述的传代及培养获得的细胞是1次传代后的细胞。通过进行同样的传代及培养，可以获得n次传代后的细胞(n表示1以上的整数)。在进行传代培养的情况下，可以将细胞培养至达到汇合度95％以下，按照上述的步骤将细胞剥离、回收，用于下一代的培养。从大量制造细胞的观点考虑，传代次数n的下限例如为1次以上、优选为2次以上、更优选为3次以上、进一步优选为4次以上、进一步优选为5次以上。另外，从抑制细胞的老化的观点
考虑，传代次数n的上限例如优选为50次以下、45次以下、40次以下、35次以下、30次以下。在不进行进一步传代培养而将培养细胞回收的情况下，可以将细胞培养至达到汇合度100％以上，使其在基材上形成细胞片，进一步继续培养，使细胞片从基材自发地剥离。
[0119]
本发明的一个以上实施方式的制造方法可以包括筛选具有以下所示的(a)及(b)的特性的细胞群的工序。
[0120]
(a)呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上，
[0121]
(b)呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上。
[0122]
作为以上述特性为指标筛选细胞群的方法，可以使用如下方法，所述方法包括如上所述用细胞分选仪筛选满足上述(a)和/或(b)的特性的细胞群的工序，进一步根据需要包括在能够筛选满足上述工序中未筛选的特性的细胞群的条件下进行培养的工序。另外，作为除细胞分选仪以外的筛选方法，可以使用例如facs、基于磁珠的分取等物理方法。
[0123]
另外，作为其它的筛选工序，可以举出在能够筛选满足上述(a)及(b)的特性的细胞群的特定条件下对细胞群进行培养的工序。例如，在上述的细胞群的培养工序中，将优选的培养条件适当组合，也能够得到满足上述(a)及(b)的特性的细胞群。在该情况下，上述的细胞群的培养工序的一部分或全部也是筛选满足上述(a)及(b)的特性的细胞群的工序。作为一例，可以举出在添加了人血小板溶解物等血清代替试剂的培养基中对包含间充质细胞的细胞群进行培养。具体可以列举：通过使用添加了人血小板溶解物的基础培养基等适当的培养条件淘汰不满足指标的细胞，以满足上述指标的方式对包含间充质细胞的细胞群进行纯化的化学方法；或者通过选择添加了人血小板溶解物的基础培养基等适当的标准培养基进行培养而使其变化为满足上述指标的细胞群的方法。但是，其方法没有特别限定，可以根据培养方法等适当选择。
[0124]
需要说明的是，在上述筛选之前，可以包括以上述特性作为指标识别包含多能性干细胞的细胞群的工序。
[0125]
筛选具有上述(a)及(b)的特性的细胞群的时机没有特别限定，可以列举例如：培养前、培养的过程中、培养后、细胞群回收前、细胞群回收后、将细胞制成冷冻保存原液前、将细胞的冷冻保存原液解冻后等。
[0126]
对于筛选具有上述(a)及(b)的特性的细胞群的方法，更详细地进行说明。
[0127]
作为通过细胞群的培养来筛选具有上述(a)及(b)的特性的细胞群的方法，可以列举例如：将包含间充质细胞的细胞群接种于培养基材，在培养基材上进行增殖培养，由此，对呈cd324阳性且呈cd90阳性的间充质细胞进行阳性选择，对呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的细胞群进行剥离/回收的方法。此时，可以使用涂布了抗cd324抗体、抗cd90抗体的培养基材进行培养。从包含间充质细胞的细胞群中通过培养呈cd324阳性且呈cd90阳性的间充质细胞来进行筛选的时机没有特别限定，可以在任意的传代培养中进行筛选，优选在初代培养中从包含间充质细胞的细胞群中筛选呈cd324阳性且呈cd90阳性的间充质细胞。
[0128]
另外，也可以通过流式细胞术、使用了磁珠的细胞分离法从包含间充质细胞的细胞群中筛选呈cd324阳性且呈cd90阳性的间充质细胞。
[0129]
在细胞群的筛选中，优选进一步筛选呈cd326阳性的细胞的比率为10％以下的细胞群；优选进一步筛选满足呈cd73阳性的间充质细胞的比率为80％以上、呈cd166阳性的间
充质细胞的比率为80％以上、呈cd105阳性的间充质细胞的比率为70％以上、呈cd45阳性的细胞的比率为10％以下中的1项以上的细胞群，更优选筛选满足上述全部的细胞群；优选进一步筛选满足呈cd34阳性的细胞的比率为10％以下的细胞群。可以进一步用上述的方法对筛选后的细胞群进行培养。另外，筛选具有这些追加的特性的细胞群的工序可以是与培养细胞群的工序成为一体的工序，也可以是另外的工序。筛选具有这些追加的特性的细胞群的工序可以是与筛选具有上述(a)及(b)的特性的细胞群的工序成为一体的工序，也可以是另外的工序。
[0130]
另外，本发明的一个以上实施方式的制造方法可以包括：将包含上述间充质细胞的细胞群进行冷冻保存的工序。在包括将上述细胞群进行冷冻保存的工序的方式中，可以在将上述细胞群解冻后，根据需要对上述细胞群进行分离、回收和/或培养。另外，也可以在将上述细胞群解冻后直接使用。
[0131]
用于将包含上述间充质细胞的细胞群进行冷冻保存的方式没有特别限定，可以列举例如：程序冷冻仪、深度冷冻仪、浸渍于液氮等。冷冻时的温度优选为-30℃以下、-40℃以下、-50℃以下、-60℃以下、-70℃以下、-80℃以下、-90℃以下、-100℃以下、-110℃以下、-120℃以下、-130℃以下、-140℃以下、-150℃以下、-160℃以下、-170℃以下、-180℃以下、-190℃以下、或-196℃(液氮温度)以下。冷冻时优选的冷冻速度例如为-1℃/分、-2℃/分、-3℃/分、-4℃/分、-5℃/分、-6℃/分、-7℃/分、-8℃/分、-9℃/分、-10℃/分、-11℃/分、-12℃/分、-13℃/分、-14℃/分或-15℃/分。在使用了程序冷冻仪作为上述冷冻方式的情况下，例如可以以-2℃/分以上且-1℃/分以下的冷冻速度将温度降至-50℃以上且-30℃以下之间的温度(例如，-40℃)，进一步以-11℃/分以上且-9℃/分以下(例如，-10℃/分)的冷冻速度将温度降至-100℃以上且-80℃以下的温度(例如，-90℃)。
[0132]
通过上述冷冻方式进行冷冻时，上述的细胞群可以在装入任意保存容器的状态下进行冷冻。作为这样的保存容器，可以列举例如：冻存管、冻存小瓶、冻存小瓶、输液袋等，但并不限定于此。
[0133]
从提高增殖能力相对高的间充质细胞的生存率的观点考虑，冷冻用保存液优选含有多于0质量％的给定浓度的白蛋白。白蛋白的优选浓度例如为0.5质量％以上、1质量％以上、2质量％以上、3质量％以上、4质量％以上、5质量％以上、6质量％以上、7质量％以上或8质量％以上。另外，白蛋白的优选浓度例如为40质量％以下、35质量％以下、30质量％以下、25质量％以下、20质量％以下、15质量％以下、10质量％以下或9质量％以下。作为白蛋白，可以列举例如：牛血清白蛋白、小鼠白蛋白、人白蛋白等，但并不限定于此。
[0134]
[4]医药组合物
[0135]
本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群可以作为医药组合物使用。即，根据本发明的一个以上实施方式，可以提供一种医药组合物，其包含上述细胞群和药学上可接受的介质。
[0136]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以作为细胞治疗剂、例如难治性疾病治疗剂来使用。
[0137]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以用作选自免疫相关疾病、缺血性疾病、下肢缺血、脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、神经系统疾病、移植物抗宿主病(gvhd)、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、放射性肠炎、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、胶原性疾病、脑卒
中、脑梗塞、脑血肿、脑血管麻痹、脑肿瘤、肝硬化、特应性皮炎、多发性硬化症、牛皮癣、大疱性表皮松解症、糖尿病、蕈样真菌病(alibert-bazin综合征)、硬皮病、由软骨等结缔组织的变性和/或炎症引起的疾病、关节软骨缺损、半月板损伤、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死、膝骨性关节炎、炎性关节炎、类风湿性关节炎、眼病、血管新生相关疾病、缺血性心脏病、冠心病、心肌梗塞、心绞痛、心力衰竭、心肌病、心瓣膜病、创伤、上皮损伤、纤维症、肺病、肌肉萎缩症、慢性胰腺炎、慢性肾炎、以及癌中的疾病的治疗剂。通过对治疗部位给药能够测量效果的量的本发明的一个以上实施方式的医药组合物，可以治疗上述疾病。
[0138]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供用于医药组合物的本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群。
[0139]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供用于细胞治疗剂的本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群。
[0140]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供用于上述疾病的治疗的本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群。
[0141]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供用于对患者或受试者给药而进行心肌的再生、心肌细胞的产生、血管新生、血管的修复、或免疫应答的抑制的本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群。
[0142]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供对患者或受试者移植细胞的方法、以及患者或受试者的疾病的治疗方法，该方法包括：对患者或受试者给药治疗有效量的本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群的工序。
[0143]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群在医药组合物的制造中的用途。
[0144]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群在细胞治疗剂的制造中的用途。
[0145]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群在上述疾病的治疗剂的制造中的用途。
[0146]
根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群在对患者或受试者给药而进行心肌的再生、心肌细胞的产生、血管新生、血管的修复、或免疫应答的抑制所需要的治疗剂的制造中的用途。
[0147]
作为本发明的一个以上实施方式的医药组合物的给药量，在对患者或受试者给药的情况下，为与未给药的患者或受试者相比能够获得对于疾病的治疗效果的细胞的量。具体的给药量可以根据给药方式、给药方法、使用目的、以及患者或受试者的年龄、体重及症状等而适当确定。给药量没有特别限定，例如，以间充质细胞的细胞数计为104个/kg体重以上、105个/kg体重以上或106个/kg体重以上。另外，给药量没有特别限定，例如，以间充质细胞的细胞数计为109个/kg体重以下、109个/kg体重以下或109个/kg体重以下。此外，作为1次的给药量，以间充质细胞的细胞数计优选为10
12
个以下、更优选为10
11
个以下、更优选为10
10
个以下。
[0148]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物的给药方法没有特别限定，可以列举例如：皮下注射、淋巴结内注射、静脉内注射、腹腔内注射、胸腔内注射或对局部的直接注射、或者对局部进行直接移植等。
[0149]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物也可以以用于其它疾病治疗的注射用制剂、或者细胞团块或片状结构的移植用制剂、或者与任意凝胶混合而成的凝胶制剂的形式使用。如上所述，在本发明的优选方式中，由于得到的细胞群能够以细胞片的形态从基材剥离，因此也可以将得到的片形态的细胞群直接(或经最低限度的加工)用作片状的移植用制剂。即，片状的包含间充质细胞的细胞群也是本发明的一个方式。
[0150]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物的作为对象的患者或受试者代表性地为人，也可以为其它动物。作为其它动物，可以列举：犬、猫、牛、马、猪、山羊、猴、雪貂等哺乳动物、鸡等鸟类。
[0151]
本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以在冷冻状态下保存至即将使用前。本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以包含对人治疗时所使用的任意成分。作为这样的成分，可以列举例如：盐类、多糖类(例如，hes、葡聚糖等)、蛋白质(例如，白蛋白等)、dmso、培养基成分(例如，rpmi1640培养基中包含的成分等)等，但并不限定于此。
[0152]
另外，本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以是利用作为药学上可接受的介质而使用的输液制剂将包含间充质细胞的细胞群稀释后的医药组合物。作为本说明书中的“输液制剂(药学上可接受的介质)”，只要是对人治疗时所使用的溶液即可，没有特别限定，可以列举例如：生理盐水、5％葡萄糖液、林格液、乳酸林格液、乙酸林格液、开始液(1号液)、脱水补给液(2号液)、保持输液(3号液)、术后恢复液(4号液)等。
[0153]
可以对患者或受试者使用包含间充质细胞的细胞群进行治疗的疾病等的其它例子、上述疾病等的其它具体例子、以及治疗的具体步骤可以参照hare et al.,j.am.coll.cardiol.,2009 december 8；54(24):2277-2286、honmou et al.,brain 2011:134；1790-1807、makhoul et al.,ann.thorac.surg.2013；95:1827-1833、日本特许第590577号公报、日本特表2010-518096号公报、日本特表2012-509087号公报、日本特表2014-501249号公报、日本特开2013-256515号公报、日本特开2014-185173号公报、日本特表2010-535715号公报、日本特开2015-038059号公报、日本特开2015-110659号公报、日本特表2006-521121号公报、日本特表2009-542727号公报、日本特开2014-224117号公报、日本特开2015-061862号公报、日本特表2002-511094号公报、日本特表2004-507454号公报、日本特表2010-505764号公报、日本特表2011-514901号公报、日本特开2013-064003号公报、日本特开2015-131795号公报等中记载的事项。
[0154]
通过以下的实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于实施例。
[0155]
实施例
[0156]
＜比较例1＞
[0157]
(工序1-1：羊膜的采集)
[0158]
从获得知情同意的择期剖宫产病例的孕妇(供体#1)无菌采集作为胎儿附属物的胎膜及胎盘。将得到的胎膜及胎盘容纳于装有生理盐水的灭菌盆，手工将羊膜从胎膜的断端剥离。用hank’s平衡盐溶液(不含ca/mg)清洗羊膜，去除附着的血液及血块。
[0159]
(工序1-2：羊膜的酶处理及间充质细胞的回收)
[0160]
将包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的羊膜浸渍于含有240pu/ml胶原酶及200pu/ml分散酶(dispase)i的hank’s平衡盐溶液(含有ca/mg)，在37℃、90分钟、50rpm的条件下进行振荡搅拌，由此对羊膜进行了酶处理。通过用网眼95μm的尼龙筛网
select，在37℃下孵育3分钟，结果是3成左右的细胞群未剥离而以粘附于cellstack(注册商标)的状态残留在培养容器中。因此，追加孵育5分钟(总计8分钟)，使上述细胞群完全剥离，对残留的细胞群也进行了回收。这里得到的细胞群为第4次传代的细胞群。然后，将上述细胞群的1/5量的细胞群接种于与先前培养相同规模的cellstack(注册商标)，由此在包含以最终浓度计10％的fbs及10ng/ml的bfgf的αmem中进行了传代培养。培养基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，结果是3成左右的细胞群未剥离而以粘附于cellstack(注册商标)的状态残留在培养容器中。因此，追加孵育5分钟(总计8分钟)，使上述细胞群完全剥离，对残留的细胞群也进行了回收。这里得到的细胞群为第5次传代的细胞群。然后，添加rpmi1640，使得细胞浓度达到4
×
106cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存。
[0163]
(工序1-4：间充质细胞的表面抗原分析)
[0164]
关于通过上述的培养方法培养的第5次传代的细胞群，使用流式细胞仪对各种表面抗原(cd324的阳性率、cd73的阳性率、cd90的阳性率、cd105的阳性率、cd166的阳性率、cd45的阴性率、cd326的阴性率)进行了分析。其结果是，cd324的阳性率小于70％(具体为33％)，cd105的阳性率为70％以上(具体为93％)，cd73、cd90、cd166的阳性率均为90％以上(具体为cd73：99％、cd90：93％、cd166：97％)。cd45、cd326的阴性率均为95％以上(具体为cd45：100％、cd326：100％)。根据以上的结果可知，通过上述的培养方法培养的细胞群是包含间充质细胞的细胞群。另外可知，比较例1的第5次传代的细胞群是尽管满足呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的条件，但不满足呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上的条件的细胞群。
[0165]
需要说明的是，在本测定中，作为同型对照用抗体，使用了reacontrol(s)apc(miltenyi biotec公司、克隆：rea293、型号：130-113-434)，作为对cd324抗原的抗体，使用了cd324-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea811、型号：130-111-840)，作为对cd73抗原的抗体，使用了cd73-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea804、型号：130-111-909)，作为对cd90抗原的抗体，使用了cd90-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea897、型号：130-114-861)，作为对cd105抗原的抗体，使用了cd105-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea794、型号：130-112-166)，作为对cd166抗原的抗体，使用了cd166-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea442、型号：130-106-576)，作为对cd45抗原的抗体，使用了cd45-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea747、型号：130-110-633)，作为对cd326抗原的抗体，使用了cd326-apc、human(miltenyi biotec公司、克隆：rea764、型号：130-111-000)。表面抗原分析使用了merck公司的guava easycyte，测定条件设为分析细胞数30,000cells，流速设定为35.4μl/min。另外，阳性细胞对于各抗原的比率(阳性率)按照以下的步骤计算。
[0166]
(1)以纵轴为ssc、横轴为fsc的点图的形式绘制同型对照的测定结果。
[0167]
(2)设定符合间充质细胞的细胞群的门，对于该细胞群，以纵轴为计数、横轴为apc的荧光强度的柱状图的形式进行绘制。
[0168]
(3)在(2)的柱状图中，在利用同型对照用抗体进行了测定的全部细胞中，选择荧
光强度更强的细胞群为0.5％以下的所有区域(门)。
[0169]
(4)计算出(3)所选择出的门内包含的细胞在利用与表面抗原标记相对应的抗体进行了测定的全部细胞中的比例。
[0170]
＜实施例1＞
[0171]
(工序2-1：羊膜的采集)
[0172]
从与比较例1相同的供体(供体#1)用与比较例1相同的方法得到了羊膜。
[0173]
(工序2-2：羊膜的酶处理及间充质细胞的回收)
[0174]
通过与比较例1相同的方法得到了包含间充质细胞的细胞群。
[0175]
(工序2-3：间充质细胞的培养)
[0176]
将通过上述的“工序2-2：羊膜的酶处理及间充质细胞的回收”得到的包含间充质细胞的细胞群接种于培养容器cellstack(注册商标)(corning公司制)。接种密度为6,000cells/cm2的密度。在细胞接种后，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养至近汇合。在培养后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第0次传代的细胞群。然后，将上述细胞群的1/5量的细胞群接种于与先前培养相同规模的cellstack(注册商标)，由此在包含最终浓度为5％的hpl的αmem中进行了传代培养。培养基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第1次传代的细胞群。然后，添加rpmi1640，使得细胞浓度达到2
×
107cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存1天。然后，将上述冷冻保存的细胞群解冻，以约15,000～18,000cells/cm2的密度将上述第1次传代的细胞群接种于cellstack(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养至近汇合。然后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第2次传代的细胞群。接着，将上述细胞群的1/5量的细胞群接种于与先前培养相同规模的cellstack(注册商标)，由此在包含最终浓度为5％的hpl的αmem中进行了传代培养。培养基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的trypleselect，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第3次传代的细胞群。然后，添加rpmi1640，使得细胞浓度达到4
×
106cells/ml。向其中加入等量的cp-1溶液(注册商标)(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存1天。然后，将上述冷冻保存的细胞群解冻，以约6,000cells/cm2的密度将上述第3次传代的细胞群接种于cellstack(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养至近汇合。然后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第4次传代的细胞群。接着，将上述细胞群的1/5量的细胞群接种于与先前培养相同规模的cellstack(注册商标)，由此在包含最终浓度为5％的hpl的αmem中进行了传代培养。培养基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完
全剥离。这里得到的细胞群为第5次传代的细胞群。对于上述细胞群，添加rpmi1640，使得细胞浓度达到4
×
106cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存。
[0177]
(工序2-4：间充质细胞的表面抗原分析)
[0178]
关于通过上述的培养方法培养的第5次传代的间充质细胞群，使用流式细胞仪对各种表面抗原(cd324的阳性率、已知为msc标记的cd73的阳性率、cd90的阳性率、cd105的阳性率、cd166的阳性率、cd45的阴性率、cd326的阴性率)进行了分析。其结果是，cd324、cd105的阳性率为70％以上(具体为cd324：91％、cd105：95％)，cd73、cd90、cd166的阳性率均为90％以上(具体为cd73：100％、cd90：100％、cd166：99％)。cd45、cd326的阴性率均为95％以上(具体为cd45：100％、cd326：99％)。根据以上的结果可知，通过上述的培养方法培养的细胞是包含间充质细胞的细胞群。另外，确认了实施例1中记载的细胞群是呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上、且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的细胞群。
[0179]
需要说明的是，本测定的方法、试剂与比较例1相同。
[0180]
＜实施例2＞
[0181]
与比较例1、实施例1相比，在以下示出的实施例2中得到了供体、酶处理条件、培养条件不同的间充质细胞群。
[0182]
与比较例1、实施例1不同的是从获得知情同意的择期剖宫产病例的3名孕妇(供体#2～#4)无菌采集了作为胎儿附属物的胎膜及胎盘。
[0183]
(工序3-1：羊膜的采集)
[0184]
通过与比较例1及实施例1相同的方法得到了羊膜。
[0185]
(工序3-2：羊膜的酶处理及间充质细胞的回收)
[0186]
将包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的羊膜浸渍于含有480pu/ml胶原酶及400pu/ml分散酶i的hank’s平衡盐溶液(含有ca/mg)，在37℃、90分钟、50rpm的条件下进行振荡搅拌，由此对羊膜进行了酶处理。通过用网眼95μm的尼龙筛网对酶处理后的溶液进行过滤，去除羊膜的未消化物，回收了包含间充质细胞的细胞悬浮液。
[0187]
(工序3-3：间充质细胞的培养)
[0188]
将通过上述的“工序3-2：羊膜的酶处理及间充质细胞的回收”得到的包含间充质细胞的细胞群接种于培养容器cellstack(注册商标)。接种密度设为1,000cells/cm2。在细胞接种后，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养至近汇合。培养基更换以3～5天1次的频率实施。在培养后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第0次传代的细胞群。然后，添加生理盐水，使得细胞浓度达到2
×
107cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存1天。然后，将上述冷冻保存的细胞群解冻，以约1,000cells/cm2的密度将第1次传代的细胞群接种于cellstack(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养5天至近汇合。然后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的trypleselect，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第1次传代的细胞群。接着，添加生
理盐水，使得细胞浓度达到2
×
107cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存1天。然后，将上述冷冻保存的细胞群解冻，以约1,000cells/cm2的密度将第2次传代的细胞群接种于cellstack(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中贴壁培养5天至近汇合。然后，每1层cellstack(注册商标)添加15ml的tryple select，在37℃下孵育3分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第2次传代的细胞群。对于上述细胞群，添加生理盐水，使得细胞浓度达到4
×
106cells/ml。向其中加入等量的cp-1溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存。
[0189]
(工序3-4：间充质细胞的表面抗原分析)
[0190]
关于通过工序3-3中记载的培养方法培养的第2次传代的细胞群(#2～#4)，使用流式细胞仪对各种表面抗原(cd324的阳性率、cd73的阳性率、cd90的阳性率、cd105的阳性率、cd166的阳性率、cd45的阴性率、cd326的阴性率)进行了分析。其结果是，cd324、cd105的阳性率为70％以上(具体按照#2、#3、#4的顺序分别为cd324：90％、87％、87％、cd105：89％、91％、74％)，cd73、cd90及cd166的阳性率均为90％以上(具体按照#2、#3、#4的顺序分别为cd73：100％、99％、100％、cd90：100％、99％、100％、cd166：99％、97％、98％)。cd45、cd326的阴性率均为95％以上(具体按照#2、#3、#4的顺序分别为cd45：99％、100％、100％、cd326：99％、100％、100％)。根据以上的结果可知，通过上述的培养方法培养的#2、#3、#4的细胞群均为包含呈cd324阳性的细胞的细胞群。另外，确认了实施例2中记载的细胞群是呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上、且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的细胞群。需要说明的是，本测定的方法、试剂与比较例1相同。
[0191]
＜评价实验：间充质细胞从培养基材剥离的剥离能力的评价＞
[0192]
(评价1：比较例1中得的细胞群的评价)
[0193]
将通过比较例1的工序1-3中记载的培养方法培养的第5次传代的细胞群(#1)解冻，以约10,000cells/cm2的密度将第5次传代的细胞群接种于6孔板，在包含以最终浓度计10％的胎牛血清(fbs)及10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的αmem(alpha modification of minimum essential medium eagle)中开始贴壁培养。培养基更换以3～5天1次的频率实施。虽然在培养第5天汇合度达到了100％，但未进行剥离处理，继续进行培养。使用olympus公司的相位差显微镜观察了培养第4、5、6、7、10、11、12、13、14、17、21天的细胞形态。在培养第7天达到过度汇合(overconfluency)，处于细胞无间隙地密合的状态。然而，随后细胞形态没有明显的变化，开始培养起经过21天细胞也没有自发地从6孔板剥离(图1：培养第21天的细胞形态)。
[0194]
(评价2：实施例1及2中得到的细胞群的评价)
[0195]
将通过实施例1的工序2-3中记载的培养方法培养的第5次传代的细胞群(#1)及通过实施例2的工序3-3中记载的培养方法培养的第2次传代的细胞群(#3)解冻，以约10,000cells/cm2的密度接种于培养容器(6孔板)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hpl)的αmem中开始贴壁培养。培养基更换以3～5天1次的频率实施。虽然在培养第4天汇合度达到了100％，但未进行剥离处理，继续进行培养。使用olympus公司的相位差显微镜观察
了培养第4、5、6、7、10、11、12、13、14、17、21天的细胞形态。在培养第5天达到过度汇合，处于细胞彼此无间隙地密合、且在局部细胞彼此重叠的状态。在培养第10天，细胞群的一部分自发地从培养容器剥离(图2、图3：在培养第10天观察到的部分细胞的剥离)。剥离后的细胞群的一部分为片状的形态。在培养第11天，细胞群全体自发地从培养容器剥离，成为一片细胞片(图4：由供体#3制备的实施例2的第2次传代的细胞群在培养第11天观察到的剥离后的细胞片聚集而成的块状结构物)。
[0196]
以上的结果表明，呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上、且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的细胞群自发地从培养容器剥离下来。即，满足上述条件的细胞群可以在不采用添加剥离剂等化学方法、或者使用细胞刮刀将细胞群物理性回收的物理方法的情况下，容易地回收培养后的细胞群。由此，本发明的细胞群不需要现有方法中必需的剥离工序，能够减轻或抑制对细胞的损伤。
[0197]
另外，满足呈cd324阳性的细胞的比率为70％以上、且呈cd90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的条件的细胞群可以以细胞片的形态得到剥离后的细胞群。即，根据本发明中记载的方法，可以在不使用上述的化学方法或物理方法且不对培养容器进行特殊处理的情况下制成细胞片。从操作性的观点考虑，细胞片是适于临床使用的制剂形式，是有用的。
[0198]
＜医药组合物的制备＞
[0199]
将上述的实施例2中得到的间充质细胞群(#2～4)的一部分供于医药组合物的制备。制备了含有间充质细胞2.0
×
108个、6.8ml的cp-1溶液(注册商标)、3.2ml的25％人血清白蛋白溶液、以及10ml的生理盐水的医药组合物(细胞制剂)。将该医药组合物封入冷冻用袋，在冷冻状态下保存。需要说明的是，可以在使用时将医药组合物解冻，供于患者。
[0200]
＜表面抗原的阴性率、阳性率的总结＞
[0201]
表1中总结了比较例1、实施例1及实施例2的表面抗原分析、传代时的酶处理时间、以及细胞片形成能力的结果。
[0202]
表1
[0203]
[0204]
＜参考例＞
[0205]
(工序4-1：骨髓来源的间充质干细胞的培养)
[0206]
购入人骨髓来源的间充质干细胞(hmsc间充质干细胞、lonza公司制)，解冻后以6,000cells/cm2的密度接种于φ15cm的培养皿，在lonza公司制的专用培养基中贴壁培养至近汇合。培养基更换以3～5天1次的频率实施。然后，使用tryple select将细胞群剥离，添加生理盐水，使得细胞浓度达到2
×
106cells/ml。向其中加入等量的cp-1(注册商标)溶液(以cp-1(注册商标)∶25％人血清白蛋白＝34∶16的比例混合而成的溶液)，以每份1ml转移至冻存小瓶后，缓慢冷冻至-80℃，然后在液氮中冷冻保存。
[0207]
(工序4-2：骨髓来源的间充质干细胞的表面抗原分析)
[0208]
关于通过工序4-1中记载的培养方法培养的骨髓来源的间充质干细胞群，使用流式细胞仪对各种表面抗原(cd324的阳性率、已知为msc标记的cd73的阳性率、cd90的阳性率、cd105的阳性率、cd166的阳性率、cd45的阴性率、cd326的阴性率)进行了分析。其结果是，cd324的阳性率为70％以下(具体为1％)，cd73、cd90、cd105、cd166的阳性率均为90％以上(具体为cd73：97％、cd90：98％、cd105：97％、cd166：95％)。cd45、cd326的阴性率均为95％以上(具体为cd45：100％、cd326：100％)。
[0209]
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用引入本说明书。