用于特异性靶向及高效结合的硅的表面修饰的方法与流程

1.目前公开的标的一般涉及多个生物材料的加工，且更具体地涉及针对特定性靶向及高效结合的硅的表面修饰的方法；即，用于高效捕获一靶分析物的表面修饰的方法。


背景技术：

2.多个微流体装置可包括一或多个活性表面，其可为例如在一反应室中用于捕获一生物流体中的靶分析物的表面附着的多个微米柱阵列。示例性多个微流体装置包括美国专利第9,238,869号及第9,612,185号中所描述的彼等，此二篇专利的名称皆为“使用致动的表面附着的柱阵列以评估生物流体流变学的方法及系统”，其涉及使用致动的表面附着的柱阵列以评估生物流体流变学的方法、系统及计算机可读介质-用于评估生物流体流变学的附加帖子。根据一方面，一种用于测试一生物流体样本的特性的方法包括步骤：将所述样本放置在一微米柱阵列上，所述微米柱阵列具有从一基板向外延伸的多个微米柱阵列，其中各个微米柱阵列包括连接至所述基板的一近端及与所述近端相对的一远端，以及在所述微米柱阵列附近产生一致动力以致动所述多个微米柱阵列，从而迫使至少一些微米柱阵列展现运动。所述方法进一步包括步骤：响应所述致动力检测至少一微米柱阵列的运动，以及基于所检测的所述微米柱阵列中的至少一者的运动，确定所述样本的一特性。
3.尽管诸如上述彼等的多个微流体装置是已知的，但是仍存在相当大的与在一微流体装置的所述反应室内的一或多个活性表面(例如，表面附着的微米柱阵列)上提供多个靶向特异性结合特性相关的成本及复杂性。因此，需要新的方法来简化在用于捕获在一生物流体中的靶分析物的一微流体装置中提供多个靶向特异性结合特性的所述程序。


技术实现要素：

4.为了全部或部分地解决上述问题及/或本领域技术人员可能已经观察到的其他问题，本公开提供如下文所述的通过实例所描述的组合物及方法。
5.在一方面，提供一种用于官能化多个表面附着的微米柱阵列的方法，以产生用于靶向特异性分析物捕获的一微米柱阵列表面，所述方法包括步骤：
6.(a)提供一微米柱阵列处理平台，其中所述微米柱阵列处理平台包括多个微米柱阵列，所述多个微米柱阵列包括一硅基材料；以及
7.(b)将一或多个官能化剂掺入所述多个微米柱阵列的所述硅基材料中；从而产生用于靶向特异性分析物捕获的所述微米柱阵列表面。
8.在一些方面，步骤1(b)包括步骤：提供用于结合一靶向特异性捕获剂的一结合系统，其中所述结合系统包括一通用结合剂及一连接剂。
9.在其他方面，所述通用结合剂是生物素，以及所述连接剂是一抗生物素蛋白，且其中所述靶向特异性捕获剂是一生物素偶联物。在一些方面，所述抗生物素蛋白是一抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在一些方面，所述生物素偶联物是一生物素化抗体(ab)。
10.在一些方面，步骤1(b)包括步骤：部分地或完全地官能化所述多个表面附着的微米柱阵列。
11.在其他方面，部分地或完全地官能化所述多个表面附着的微米柱阵列包括步骤：将一或多个官能化剂锚定至所述多个微米柱阵列的所述硅基材料中。在其他方面，将所述一或多个官能化剂锚定至所述多个微米柱阵列的所述硅基材料中的步骤包括：接枝、键结，及/或物理吸收。在其他方面，部分地或完全地官能化所述多个表面附着的微米柱阵列的步骤包括步骤：提供所述一或多个官能化剂，使得所述一或多个官能化剂位于所述多个微米柱阵列的所述表面的顶部。在其他方面，所述多个微米柱阵列的所述硅基材料包括pdms。在其他方面，所述多个微米柱阵列的所述硅基材料包括一或多个胺官能团，其中所述胺官能团为随后添加所述一或多个官能化剂提供一锚定点。在其他方面，所述一或多个官能化剂包括一结合剂及/或一阻断剂。在其他方面，一通用结合剂是添加至所述多个微米柱阵列的所述硅基材料中。在其他方面，所述通用结合剂包括一含有生物素的试剂。在其他方面，所述结合剂是一经修饰的脂质，所述经修饰的脂质包括一生物素结合基团。在其他方面，所述结合剂是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(生物素酰基)(bio dope)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-(biotinyl)(bio dope))。在其他方面，所述硅基材料包括一聚合物基体，且其中一膨胀剂用于使所述聚合物基体膨胀。在其他方面，所述膨胀剂被移除，从而使所述官能化剂缠结并锚定在所述聚合物基质中。
12.在其他方面，所述方法进一步包括步骤：
13.(c)将所述多个表面附着的微米柱阵列上的多个官能团与一硅烷化试剂反应，以形成多个含有胺的基团，从而产生多个经胺修饰的微米柱阵列；以及
14.(d)引起一交联化学反应，以将所述一或多个官能化剂添加至所述多个经胺修饰的微米柱阵列的所述表面。
15.在其他方面，所述硅烷化试剂包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,aptes)及/或3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane,gopts)。在其他方面，步骤(d)包括使用n-羟基琥珀酰亚胺酯(n-hydroxysuccinimide ester,nhs)及/或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edac)。在其他方面，步骤(d)包括步骤：使用点击化学以将所述官能化剂结合至所述多个微米柱阵列的所述表面。在其他方面，步骤(d)包括使用包括一官能化剂的一硅烷化剂。在其他方面，所述包括一官能化剂的所述硅烷化剂包括硅烷聚乙二醇(silane polyethylene glycol，硅烷聚乙二醇)。在其他方面，所述官能化剂包括一结合基团，且进一步其中所述结合基团是一生物素，从而所述官能化剂包括硅烷聚乙二醇生物素(polyethylene glycol biotin，硅烷聚乙二醇生物素)。在其他方面，步骤(d)包括步骤：使用一等离子体活化程序来产生多个反应性基团，所述多个反应性基团可用于将所述官能化剂锚定至所述多个微米柱阵列的所述表面。在其他方面，所述多个反应性基团包括多个羟基。在其他方面，步骤(d)包括步骤：钝化所述多个微米柱阵列的所述表面，其中钝化所述多个微米柱阵列的所述表面的步骤包括步骤：使多个未结合的胺基团与一阻断剂反应。在其他方面，步骤(d)包括步骤：钝化所述多个微米柱阵列的所述表面，其中钝化所述多个微米柱阵列的所述表面的步骤包括步骤：将一阻断剂掺入用于制造所述多个微米柱阵列的所述硅基材料中。
16.在其他方面，所述阻断剂是选自由以下所组成的群组：聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)；聚环氧乙烷(polyethylene oxide,peo)；脂质；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)；聚丙烯；聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,ptfe)。在其他方面，进行一第一次官能化反应，以在所述经修饰的多个微米柱阵列的所述表面添加一通用结合剂。在其他方面，一第一官能化试剂的一溶液是经由多个流体端口流入所述反应室或直接地流入所述间隙。在其他方面，所述第一官能化试剂是一聚乙二醇化胺反应性生物素试剂(n-羟基琥珀酰亚胺酯(n-hydroxysuccinimide ester,nhs))-聚乙二醇-生物素。在其他方面，所述聚乙二醇间隔臂被配置作为一“瓶刷(bottlebrush)”聚合物，所述瓶刷聚合物限制接近所述多个微米柱阵列的所述表面，从而减少与所述多个微米柱阵列的所述表面的非特异性结合。在其他方面，使用所述第一官能化试剂及多个反应条件，足以在所述多个微米柱阵列的所述表面上提供多个聚乙二醇-生物素结合位点的一密度，所述密度足以随后高效捕获一靶分析物，以进行所述第一官能化反应。在其他方面，所述第一官能化试剂是一聚乙二醇化胺反应性生物素试剂(pegylated amine-reactive biotin reagent)，且其中所述试剂与所述多个经修饰的微米柱阵列的多个表面上的多个胺基团反应，以形成多个稳定的酰胺键。在其他方面，所述聚乙二醇间隔物的所述链长被选择为向所述末端结合的生物素基团提供足够的移动性。在其他方面，所述聚乙二醇间隔臂被配置为具有介于500与5000之间的一分子量。在其他方面，所述阻断的聚乙二醇分子的所述链长被选择为足够短于所述聚乙二醇-生物素结合剂的所述链长，以允许在所述聚乙二醇臂的所述末端处的所述生物素结合基团的移动性。
17.在其他方面，提供一种微米柱阵列处理平台，所述微米柱阵列处理平台包括一硅基材料，且被配置用于进行如本文所述的任何的所述方法。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括一微流体系统，所述微流体系统包括：
18.(i)至少一微流体装置，包括一反应室，其中所述反应室包括一微米柱阵列场，其中所述微米柱阵列场包括多个表面附着的磁响应微米柱阵列；以及
19.(ii)在紧邻所述磁响应微米柱阵列中提供至少一基于磁性的致动机构，其中所述至少一基于磁性的致动机构被配置为产生一致动力，所述致动力足以迫使至少一些所述磁响应微米柱阵列展现运动。
20.在其他方面，所述反应室包括至少一包含的微流体通道，其中一界定的流体的体积的可通过多个流体端口流入及流出所述微米柱阵列处理平台，以用于多个基于溶液的官能化反应。在其他方面，所述反应室包括多个微流体通道。在其他方面，所述方法进一步包括步骤：使所述多个微米柱阵列的所述硅基材料的所述表面上的多个官能团与3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应，以在多个经胺修饰的微米柱阵列上形成多个含有胺的基团，之后使用一或多个胺-酯(nhs)化学反应，以将一或多个官能团添加至所述多个经胺修饰的微米柱阵列的所述表面。在其他方面，在组装所述微米柱阵列处理平台以形成一反应室之前，进行所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰反应，且其中将一或多个官能团添加至所述多个经胺修饰的微米柱阵列的所述表面的所述一或多个胺-酯(nhs)化学反应是在所述经组装的微米柱阵列处理平台的所述反应室中进行。
21.在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括多个官能化表面附着的微米柱阵列的两个面对的基板。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括至少两个单独的微流体装置，
所述微流体装置被配置为多个插入式就绪模块(drop-in ready module)，所述多个插入式就绪模块用于集成至一最终使用者的一流体盒或系统中。在其他方面，根据最终使用者的多个需求，多个官能化表面附着的微米柱阵列被配置为在所述官能化程序的不同阶段提供给所述最终使用者。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括多个官能化表面附着的微米柱阵列的一对相对的基板，其中所述一对的相对的基板被一间隙隔开，从而在所述一对的相对的基板之间形成一反应室。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括一间隔物或衬垫，所述间隔物或衬垫设置在所述一对的基板之间，以形成所述间隙。在其他方面，所述间隙的高度从约50μm至约1mm。
22.在其他方面，所述微米柱阵列处理平台被配置为通过将流体直接地供应至所述间隙，以允许大量流体流过所述反应室。在其他方面，所述反应室的一端为一入口，及所述反应室的另一端为一出口。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括多个流体端口，所述多个流体端口设置在一或两个基板中。在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括设置在一基板中的两个流体端口，其中一流体端口是一入口，且另一入口端口是一出口。
23.在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括：
24.(i)至少一微流体装置，包括一反应室，其中所述反应室包括一微米柱阵列场，其中所述微米柱阵列场包括多个表面附着的磁响应微米柱阵列；以及
25.(ii)在紧邻所述多个磁响应微米柱阵列中提供至少一基于磁性的致动机构，其中所述至少一基于磁性的致动机构被配置为产生一致动力，所述致动力足以迫使至少一些所述磁响应微米柱阵列展现运动。
26.在其他方面，所述至少一微流体装置中的各个包括由一间隙隔开的一底部基板及一顶部基板，从而在所述底部基板与所述顶部基板之间形成所述反应室。在其他方面，在所述底部基板与所述顶部基板之间提供一间隔物或衬垫，以形成所述间隙及界定所述反应室。在其他方面，所述顶部基板包括一入口端口及一出口端口。在其他方面，所述反应室的尺寸被设计为容纳一所需体积的流体。在其他方面，所述间隙具有从约50μm至约1mm的一高度。
27.在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括一微米柱阵列场，所述微米柱阵列场设置在所述底部基板的所述内表面上。在其他方面，所述微米柱阵列场设置在所述顶部基板的所述内表面上。在其他方面，所述微米柱阵列场设置在所述底部基板的所述内表面及所述顶部基板的所述内表面上。在其他方面，所述反应室内的所述多个微米柱阵列是使用多个靶向特异性分析物捕获元件进行官能化。在其他方面，所述多个微米柱阵列是使用一表面官能化程序进行官能化。在其他方面，在组装所述两个基板以形成所述反应室之前，进行所述多个微米柱阵列的表面官能化。
28.在其他方面，所述微米柱阵列处理平台包括相对的多个微米柱阵列，其中所述相对的多个微米柱阵列被配置为使得在所述相对的多个微米柱阵列的多个顶端之间未设有间隔或间隙。在其他方面，所述相对的多个微米柱阵列是叉指型。在其他方面，所述叉指型相对的多个微米柱阵列被配置成使得所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端被设置在不同的平面上，使得它们重叠。在其他方面，一第一组的所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端设置在一平面p1上，及与所述第一组的所述多个微米柱阵列相对的一组的所述多个微米柱阵列的所述多个顶端设置在一平面p2上。在其他方面，所述叉指型相对的多个
微米柱阵列被配置成使得所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端设置为基本上未重叠。在其他方面，所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端设置在同一平面上。在其他方面，所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端通过一间隔或间隙隔开。在其他方面，所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端被配置为使得在所述相对的多个微米柱阵列的所述多个顶端之间的所述间隔或间隙，通过所述反应室的所述中心提供一低阻力流动路径，所述多个靶向可通过所述低阻力流动路径行进，且不会遇到一微米柱阵列。
29.本发明的其他组合物、方法、特征及优点对于本领域技术人员在检验以下附图及详细的描述时，将是显而易见的。旨在将所有此种额外的组合物、方法、特征及优点包括在本说明书中、包括在在本发明的范围内，并受到所附权利要求的保护。
附图说明
30.本发明的特征及优点将从以下结合附图的描述中更清楚地理解，附图不一定按比例绘制，其中：
31.图1a及图1b说明在一多个微米柱阵列处理平台的一实例的剖面图，其中所述多个微米柱阵列处理平台提供用于处理多个微米柱阵列的排列的一反应(或分析)室；
32.图1c说明图1a的一细节a的实例，其显示所述多个微米柱阵列处理平台的更多细节；
33.图2a及图2b说明一多个微米柱阵列处理平台的另一实例的剖面图，其中所述多个微米柱阵列处理平台提供用于处理多个微米柱阵列的排列的一反应(或分析)室；
34.图3a及图3b分别说明在一基板上形成多个表面附着的微米柱阵列的所述基板的一实例的透视图及剖面图；
35.图4a及图4b说明所述多个微米柱阵列处理平台的基于所述微米柱阵列的反应室的多个微米柱阵列的一实例的侧视图；
36.图5a及图5b说明一微米柱阵列的侧视图，以及显示其致动运动的实例；
37.图6说明目前所公开的用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的方法的一实例的流程图；
38.图7a及图7b显示用图表示图6的方法的一些步骤；
39.图8说明目前所公开的用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的方法的另一实例的流程图；
40.图9说明目前所公开的用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的方法的又一实例的流程图；
41.图10a及图10b分别是使用悬浮在一简单的缓冲基质中的多个珠粒及掺入全血中的细菌(即，大肠杆菌(e.coli))进行的分析物捕获实验的照片；以及
42.图11、图12及图13是根据目前所公开的用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的方法，显示多个经加工的微米柱阵列平台的各种实例的视图，所述多个经加工的微米柱阵列平台包括多个官能化的微米柱阵列。
具体实施方式
43.现在将在下文中参考附图以更全面地描述目前所公开的标的，其中显示目前所公
开的标的的一些但非所有的实施例。相同的数字始终代表相同的元件。目前所公开的标的可以许多不同的形式实施且不应被解释为限于本文所阐述的实施例；相反的，提供此等实施例使得本公开将满足适用的法律要求。实际上，目前所公开的标的所属领域的技术人员在受益于前述描述及相关的附图中所呈现的教导的情况下，将想到本文所阐述的目前所公开的标的的许多修饰及其他的实施例。因此，应当理解，目前所公开的标的不限于所公开的具体实施例，且修改及其他的实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。
44.一般定义：
45.如本文中所使用，“活性表面”是指可用于处理样品的任何表面或区域，包括但不限于生物材料、流体、环境样品(例如，水样品、空气样品、土壤样品、固体废弃物及液体废弃物，及动物组织及植物组织)，以及工业样品(例如食品、试剂等)。活性表面可在一反应室或分析室的内部。例如，活性表面可为具有设计用于操作所述室的内部的流体的特性的任何表面。操作可包括，例如，产生流体流动、改变一外部驱动流体的流动分布、将所述样品分级成多个组分部分、建立或消除所述室内的浓度梯度等。可能具有此种效果的表面特性可包括，例如，后技术-无论是静态的或是致动的(即，激活的)。所述表面特性可亦包括在表面的微尺度结构或形貌、通过振动或变形对所述表面的物理扰动；在表面上或表面内的电气、电子、电磁及/或磁系统；光学活性(例如，透镜)表面，例如与外部光源相互作用的嵌入式led或材料等。
46.如本文中所使用，术语“表面附着的柱阵列”或“表面附着的微米柱阵列”或“表面附着的结构”可互换使用。通常，表面附着的结构具有两个相对的端部：一固定端及一自由端。取决于所采用的制造技术及材料，所述固定端可通过任何合适的方式附着至一基板。所述固定端可通过与所述基板一体形成或邻接于所述基板而进行“附着(attached)”，例如通过一微制造程序。或者，所述固定端可通过一结合、粘合、熔合或焊接程序进行“附着”。所述表面附着的结构具有从所述固定端至所述自由端所界定的一长度，以及位于与所述长度正交的平一面内的剖面。例如，使用笛卡尔坐标系(cartesian coordinate system)做为一参照架构，以及将所述表面附着的结构的长度与z轴(可能为一曲线轴)相关联，所述表面附着的结构的剖面位于xy平面内。
47.通常，所述表面附着的结构的剖面可具有任何的形状，例如圆形的(例如，圆形、椭圆形等)、多边形的(或棱柱形、直线形等)、具有圆形特征的多边形的(例如，具有圆角的直线)或不规则的。所述表面附着的结构的剖面在x-y平面中的剖面尺寸可由所述剖面的“特征尺寸”定义，其与形状有关。例如，特征尺寸在一圆形剖面的情况下可为直径，在一椭圆形剖面的情况下可为主轴，或者在多边形剖面的情况下可为最大长度或宽度。一不规则形状的剖面的特征尺寸可被认为是一规则形状剖面的尺寸特征，所述规则形状剖面最接近近似的一不规则形状的剖面(例如，圆的直径、椭圆的主轴、多边形的长度或宽度等)。
48.如本文所述的一相对于其固定端或与所述基板的附着的点是不可移动的(静态的、刚性的等)或可移动的(柔性的、可偏转的、可弯曲的等)。为促进可移动的表面附着的结构的可移动性，所数表面附着的结构可包括由一弹性(柔性)材料所组成的一柔性本体，以及可具有长条形的几何形状，即所数表面附着的结构的主要尺寸是其长度-即，所述长度显着大于特征尺寸。所述柔性本体的组成物的实例包括，但不限于，弹性材料，例如水凝胶及其他活性表面材料(例如，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms))。
49.可移动的表面附着的结构被配置成使得所述表面附着的结构相对于其固定端的运动可以非接触的方式被致动或诱导，具体地通过一施加的具有期望强度的磁场或电场、场线方向及频率(在一静磁场或静电场的情况下可能为零)。为了通过一施加的磁场或电场使所述表面附着的结构可移动，所述表面附着的结构可包括设置在所述表面附着的结构的柔性本体上或柔性本体中的一合适的金属成分。为了使所述表面附着的结构响应于一磁场，金属成分可为一铁磁材料，例如铁、镍、钴或其磁性合金，一非限制性实例是“铝镍钴合金(alnico)”(含有铝、镍级钴的一铁合金)。为了使所述表面附着的结构响应于一电场，金属成分可为展现出良好导电性的金属，例如铜、铝、金及银，以及各种其他的金属及金属合金。取决于所使用的制造技术，金属成分可在柔性本体的选定区域沿其长度形成作为所述柔性本体的外表面上的一层(或涂层、膜等)。所述层可为连续层或多个颗粒的密集组合排列。或者，金属成分可形成为在所述柔性本体的一选定区域处嵌入所述柔性本体中的多个颗粒的排列。
50.如本文中所使用，术语“致动力”是指施加至所述多个微米柱阵列的力。例如，所述致动力可包括磁力、热力、声力或电力。值得注意的是，所述致动力可作为频率或幅度的一函数或作为一脉冲力(即，一阶跃函数)而被施加。类似地，在不脱离本标的的范围的情况下，可使用其他的致动力，例如流体流过所述微米柱阵列(例如，经由使用一光学系统监控其倾斜角而用作多个流量传感器的多个柔性微米柱阵列)。
51.据此，一致动力的施加将可移动的多个表面附着的微米柱阵列进行致动，以使其移动。例如，所述致动通过将细胞处理室与包括提供一致动力的元件的控制仪器接触而发生，所述致动力例如一磁场或电场。据此，所述控制仪器包括例如用于致动所述多个微米柱阵列的任何机构(例如，磁系统)、用于计数细胞的任何机构(例如，成像系统)、用于泵送所述流体的气动装置(例如泵、流体端口、阀)，以及一控制器(例如微处理器)。
52.如本文中所使用，“流动池(flow cell)”是包括一固体表面的任何室，一或多种液体可流过所述固体表面，其中所述室具有至少一入口及至少一出口。
53.术语“微米柱阵列(micropost array)”在本文中用于描述从一基板向外延伸的多个小柱阵列，其高度通常在1至100微米的范围内。在一实施例中，一微米柱阵列的多个微米柱阵列可垂直地排列。值得注意的是，各个微米柱阵列包括附着至所述基板基座的一近端及与所述近端相对的一远端或顶端。多个微米柱阵列可排列成阵列，例如，在2016年1月19日发行的标题为“使用多个致动的表面附着的柱阵列来评估生物流体流变学的方法及系统”的美国专利第9,238,869号中所描述的所述多个微米柱阵列；其全部公开内容以引用方式并入本文中。美国专利第9,238,869号描述使用多个致动的表面附着的柱阵列来评估生物流体流变学的方法、系统及计算机可读介质。美国专利第9,238,869号中所描述的一种方法涉及测试一生物流体样本的特性，所述方法包括将所述样本放置在一微米柱阵列上，所述微米柱阵列具有从一基板向外延伸的多个微米柱阵列，其中各个微米柱阵列包括附接至所述基板的一近端及与所述近端相对的一远端，以及在所述多个微米柱阵列附近产生一致动力，以致动所述多个微米柱阵列，从而迫使至少一些所述多个微米柱阵列展现运动。此方法进一步包括响应于所述致动力检测所述微米柱阵列中的至少一者的运动，以及基于所检测的所述微米柱阵列中至少的至少一者的运动，确定所述样本的特性。
54.美国专利第9,238,869号亦指出，所述微米柱阵列的多个微米柱阵列及微米柱阵
列基板可由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)形成。此外，多个微米柱阵列可包括柔性本体及设置在所述本体上或所述本体内的一金属成分，其中一磁场或电场的施加促使所述多个微米柱阵列相对于其所附着的表面致动(例如，其中由所述致动机构所产生的致动力是一磁致动力及/或电致动力)。
[0055]“磁响应”是指响应于一磁场。“磁响应多个微米柱阵列”包括多个磁响应材料或由多个磁响应材料所组成。多个磁响应材料的实例包括，但不限于，多个顺磁性材料、多个铁磁性材料、多个亚铁磁性材料及多个变磁性材料。合适的顺磁性材料的实例包括铁、镍及钴，以及金属氧化物，例如，但不限于氧化铁(fe3o4)、六铁酸钡(bafe
12o19
)、氧化钴(ii)(coo)、氧化镍(ii)(nio)、氧化锰(iii)(mn2o3)、氧化铬(iii)(cr2o3)及磷化钴锰(comnp)。
[0056]
依循长期存在的专利法惯例，术语“一(a)”、“一(an)”及“所述”在本技术(包括权利要求书)中使用时是指“一或多个”。因此，例如，提及“一标的”包括多个标的，除非上下文明显相反(例如，多个标的)等。
[0057]
贯穿本说明书及权利要求书，除非上下文另有要求，否则以一非排他的意义使用术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”及“包括(comprising)”。同样的，术语“包括(include)”及其语法变体旨在是非限制性的，使得在一列表中的列举的项目不排除可替换或添加至所列项目的其他类似的项目。
[0058]
为了本说明书及所附权利要求书的目的，除非另有说明，所有表示数量、大小、尺寸、比例、形状、配方、参数、百分比、数量、特性及在说明书及权利要求书中所使用的其他数值的数字应理解为在所有情况下皆被术语“约”修饰，即使术语“约”可能未与所数值、数量或范围明确一起出现。因此，除非有相反的指示，在以下说明书及所附权利要求书中所阐述的数值参数并非且未必是精确的，而是可为近似的及/或根据需要更大或更小、反映容差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的取决于目前所公开的标的所寻求获得的期望特性的其他因素。例如，术语“约”在提及一数值时，可意味着从指定的量涵盖以下的变化：在一些实施例中
±
100％、在一些实施例中
±
50％、在一些实施例中
±
20％、在一些实施例中
±
10％、在一些实施例中
±
5％、在一些实施例中
±
1％、在一些实施例中
±
0.5％，以及在一些实施例中
±
0.1％，因为此种变化适合于执行所公开的方法或使用所公开的组合物。
[0059]
此外，术语“约”当与一或多个数字或数字范围结合使用时，应被理解为指所有的此类数字，包括范围内的所有的数字，及通过扩展数值以上及以下的边界来修改此范围。端点对数值范围的引用包括所有的数字，例如整数，包括其分数，包含在此范围内(例如，1至5的引用包括1、2、3、4及5，以及其分数(例如，1.5、2.25、3.75、4.1等)以及此范围内的任何范围。
[0060]
用于特异性靶向及高效结合的硅的表面修饰的方法：
[0061]
在一些实施例中，目前所公开的标的提供用于特定异性靶向及高效结合的硅的表面修饰的多个方法。即，一表面官能化程序使用一多个微米柱阵列处理平台来官能化多个微米柱阵列，以高效捕获一靶分析物。高效结合可意指例如与大多数结合位点快速的结合及/或成功的结合。例如，提供一多个微米柱阵列处理平台以促进一微米柱阵列表面官能化程序。所述微米柱阵列处理平台例如基于由形成一反应(或分析)室的两个相对的基板所形成的一微流体流动池结构，且其中所述两个基板中的一者或两者的表面包括所述多个表面
附着的微米柱阵列进行官能化的排列(例如，一场或阵列)。所述多个表面附着的微米柱阵列由一硅基材料(例如，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms))形成，并使用一结合剂进行官能化以捕获靶向特定的分析物。
[0062]
在一些实施例中，在所述相对的基板上的所述相对的微米柱阵列以具有一重叠的“叉指型(interdigitated)”方式排列。即，所述相对的多个微米柱阵列的多个顶端以“叉指型”方式排列，其间基本上无间隔或间隙。在此实施例中，在所述相对的微米柱阵列之间基本上无低阻力流动路径。然而，在其他的实施例中，在所述相对的基板上的所述相对的微米柱阵列的多个顶端被设置为在其之间具有一间隔或间隙。在此实施例中，在所述相对的微米柱阵列之间存在一低阻力流动路径。
[0063]
在一些实施例中，使用所述多个微米柱阵列处理平台以官能化所述表面附着的多个微米柱阵列的方法包括一或多个修饰/官能化步骤，其中使用一或多个官能化(例如结合或阻断)剂的掺入，以提供用于靶向特异性分析物捕获的一微米柱阵列表面。
[0064]
在一些实施例中，微米柱阵列表面官能化程序包括提供一结合系统，其中所述结合系统包括用于结合靶向特异性捕获剂的一通用结合剂及一连接剂。在一实例中，所述通用结合剂是生物素以及所述连接剂是抗生物素蛋白(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白)，以及所述靶向特异性捕获剂是一生物素偶联物(例如，一生物素化抗体(biotinylated antibody,ab))。
[0065]
在一些实施例中，可通过将一官能团整合(锚定)至用于制造所述多个微米柱阵列的硅基材料(例如，pdms)中，以部分地或完全地官能化所述多个表面附着的微米柱阵列。例如，用于制造多个微米柱阵列的所述硅基材料(例如，pdms)可包括作为聚合物链一部分的一官能团。在一实例中，用于制造所述多个微米柱阵列的硅基材料(例如，pdms)可包括多个胺官能团，其中所述胺官能团为随后添加一官能化剂(例如，结合剂及/或阻断剂)。在另一实例中，可将包括一通用结合剂(例如，一含有生物素的试剂)的一锚定分子添加(掺杂)至用于制造所述多个微米柱阵列的硅基材料(例如，pdms)中。在一实例中，所述锚定分子是包括一生物素结合基团的一经修饰的脂质(例如，1-油酰基-2-[12-生物素基(氨基十二酰基)]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-oleoyl-2-[12-biotinyl(aminododecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphocholine)，其可从avanti lipids购得)，其中所述经修饰的脂质被掺入至所述微米柱阵列pdms基质中。在又一实例中，膨胀剂，例如二氯甲烷是用于膨胀所述硅基材料(例如，pdms)的聚合物基质，以在聚合物链之间产生间隔，其中在移除所述膨胀剂时，一官能化剂(例如，一结合剂及/或阻断剂)缠结并锚定在所述聚合物基质中。
[0066]
在一些实施例中，可使用一表面官能化程序来官能化多个表面附着的微米柱阵列的排列。即，一官能化剂(例如，一结合剂及/或阻断剂)是附着(锚定)至(例如，接枝、键结、物理吸收等)或位于一微米柱阵列的表面的顶部。
[0067]
在一些实施例中，一微米柱阵列表面官能化程序包括步骤：使在多个天然的微米柱阵列(例如，多个pdms微米柱阵列)的表面上的多个官能团(例如，多个硅烷醇基团及多个自由基基团)与一硅烷化试剂反应，以形成含有胺的基团，且之后使用一或多个交联(共轭)化学物质，以将一或多个官能化剂(例如，结合剂及/或阻断剂)添加(锚定)至多个经胺修饰的微米柱阵列的表面。硅烷化剂的非限制性实例包括：3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,aptes)、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(3-aminopropyl)
trimethoxysilane,aptms)，以及3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane,gopts)。交联剂(共轭)化学的非限制性实例包括：n-羟基琥珀酰亚胺酯(n-hydroxysuccinimide ester,nhs)及1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edac)。
[0068]
在一些实施例中，可使用“点击(click)”化学将一官能化剂(例如，结合剂及/或阻断剂)耦合至所述多个微米柱阵列的表面，以进行一微米柱阵列表面官能化程序。用于耦合的点击化学的非限制性实例包括一叠氮化物与一炔基的反应。
[0069]
在一些实施例中，可使用包括一官能化剂(例如结合剂及/或阻断剂)的一硅烷化剂来进行一微米柱阵列表面官能化程序。在一实例中，包括一结合基团，例如生物素(即，硅烷聚乙二醇生物素)的硅烷聚乙二醇(silane polyethylene glycol)(硅烷聚乙二醇)可用于将一结合基团锚定在所述多个微米柱阵列的表面上。
[0070]
在一些实施例中，可使用等离子体活化程序来进行一微米柱阵列表面官能化程序，以产生可被用于将一官能化剂(例如，结合剂及/或阻断剂)锚定在所述多个微米柱阵列的表面上。
[0071]
在一些实施例中，所述微米柱阵列表面官能化程序包括步骤：钝化所述多个微米柱阵列的表面。在一实例中，所述微米柱阵列表面官能化程序包括步骤：使多个未结合的胺基团与一阻断(钝化)剂反应。在另一实例中，点击化学可用于将一阻断剂结合至所述多个微米柱阵列的表面。在另一实例中，可通过将阻断(钝化)剂掺入(掺杂)至用于制造所述多个微米柱阵列的硅基材料(例如，pdms)中，以进行所述多个微米柱阵列的表面的钝化。阻断(钝化)剂的非限制性实例包括：聚乙二醇(polyethylene glycol,peg；或聚环氧乙烷(polyethylene oxide,peo))、脂质、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)、聚丙烯及聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,ptfe)。
[0072]
在一些实施例中，所述微米柱阵列表面官能化程序可包括在组装所述多个微米柱阵列处理平台的反应(或分析)室之前所进行的一或多个步骤，以及在所述经组装的多个微米柱阵列处理平台的反应(或分析)室中的一或多个基于溶液的步骤。所述反应室提供一包含的微流体通道，其中一界定体积的流体可经由多个流体端口流入及流出所述多个微米柱阵列处理平台，以用于基于溶液的官能化反应。所述基于溶液的官能化反应可使用一单一微流体通道进行，或可使用多个微流体通道以比例放大。由于基于溶液的官能化反应是在一微流体通道(室)的经界定的间隔中进行，因此只有在反应室内的多个微米柱阵列会暴露于所述多个官能化试剂，从而将试剂量及成本保持在最低水平。
[0073]
在一些实施例中，一微米柱阵列表面官能化程序包括步骤：使在多个天然的微米柱阵列(例如，多个pdms微米柱阵列)的表面上的多个官能团(例如，多个硅烷醇基团及多个自由基基团)与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)反应，以形成含有胺的基团，且之后使用一或多个胺-酯(nhs)化学反应，以将一或多个官能团(例如，结合基团或阻断基团)添加(锚定)至多个经胺修饰的微米柱阵列的表面。在一实例中，在组装所述多个微米柱阵列处理平台之前进行3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)修饰反应，以形成一反应(或分析)室，以及将一或多个官能团(例如，多个结合基团或多个阻断基团)添加至所述多个经胺修饰的微米柱阵列的表面的一或多个胺酯(nhs)化学反应是在所述经组装的多个微柱处理平台的反应(或测定)室中进行。
[0074]
在一些实施例中，其中具有多个官能化表面附着的微米柱阵列的目前所公开的微米柱阵列处理平台可为整体性提供给最终使用者(1)；即，作为一完整的多个微米柱阵列处理平台，包括多个官能化表面附着的微米柱阵列的两个面对的基板，或(2)作为单独的微流体装置(例如，从较大的多个微米柱阵列处理平台切块)，可为一插入式就绪模块(drop-in ready module)集成至一最终使用者的任何流体盒或系统中。此外，根据最终使用者的需求，可在官能化程序的不同阶段向所述最终使用者提供具有所述多个官能化表面附着的微米柱阵列的所述多个微米柱阵列处理平台或具有所述多个官能化表面附着的微米柱阵列的个别的微流体装置。
[0075]
现在参见图1a及图1b是用于处理目前所公开的多个官能化表面附着的微米柱阵列以捕获靶分析物的一多个微米柱阵列处理平台100的一实例的剖面图。多个微米柱阵列处理平台100具有用于处理多个微米柱阵列的一反应(或分析)室。例如，多个微米柱阵列处理平台100包括由一间隙114隔开的一对相对的基板110，从而在所述相对的基板110之间形成所述反应(或分析)室118。一间隔物或衬垫116(参见图1b)可被设置在所述相对的基板110之间，以形成间隙114，并界定反应(或分析)室118的区域。据此，在所述相对的基板110之间的所述间隔中形成一反应(或分析)室118。多个微米柱阵列处理平台100的反应(或分析)室118的尺寸可被设计为容纳任何体积的流体。反应(或分析)室118的间隙114的高度可为例如从约50μm至约1mm。
[0076]
在一实例中，且现在参见图1a，通过将流体直接地供应至反应(或分析)室的间隙114，大量流体可流过反应(或分析)室118。例如，反应(或分析)室118的一端(或一侧)可为所述入口，而另一端(或一侧)则可为所述出口。在另一实例中，且现在参见图1b，多个流体端口120可被设置在一个或两个基板110中。例如，在一基板110中设置两个流体端口120，各个端(例如，一入口及一出口)中的一者用于将流体加载至反应(或分析)室118中。在此实例中，多个微米柱阵列处理平台100提供一简单的“流动池(flow cell)”类型的室。例如，一流动池可为包括一固体表面的任何室，其中一或多个液体可流过所述固体表面，其中所述室具有至少一入口和至少一出口。
[0077]
在所述两个基板110二者的内表面上以及在反应(或分析)室118内提供在一基板124上的多个表面附着的微米柱阵列122的设置(例如，一场或阵列)。然而，在其他的实施例中，多个表面附着的微米柱阵列122可仅提供在一基板110上(见图12)。微米柱阵列122可为例如多个磁响应微米柱阵列。一磁致动机构(未示出)可被设置在多个微米柱阵列处理平台100的反应(或分析)室118附近，其中来自所述致动机构的一磁场可被用于致动所述多个磁响应微米柱阵列122。更多的磁致动机构描述于美国专利申请第62/654,048号，标题为“在一反应室中驱动多个磁响应微米柱阵列的多个基于磁性的致动机构及方法”。下文参考图4a、图4b、图5a及图5b显示且描述多个微米柱阵列122的更多的细节。
[0078]
在图1a及图1b所显示的实例中，在相对的微米柱阵列122的多个顶端之间并无间隔或间隙。实现此点的一种方式是相对于第二基板110的多个微米柱阵列122以“叉指型(interdigitated)”方式设置第一基板110的多个微米柱阵列122。图图1a的细节a表示多个微米柱阵列处理平台100的一部分。图1c是图1a的细节a的两个实例，即，多个微米柱阵列处理平台100的一放大的部分，并显示其更多的细节。在实例1中，所述相对的微米柱阵列122以一重叠的“叉指型”方式设置。即，所述相对的微米柱阵列122的多个顶端被设置在不同的
平面上，使得它们重叠。例如，一组的微米柱阵列122的多个顶端设置在一平面p1上，而相对的一组的微米柱阵列122的多个顶端设置在一平面p2上。在实例2中，所述相对的微米柱阵列122同样以“叉指型”方式设置，但基本上并未重叠，且在其之间基本上无间隙。即，所述相对的微米柱阵列122的多个顶端被设置在基本上相同的平面上。例如，一组的微米柱阵列122的多个顶端被设置在平面p1上，而相对的一组的微米柱阵列122的多个顶端设置在同一平面p1上。
[0079]
在实例1和实例2中，所述相对的微米柱阵列122的多个顶端之间基本上无间隔或间隙。此等配置确保在反应(或分析)室118内无低阻力流动路径，且确保有效的处理操作。其中，例如，多个珠粒/捕获靶向可在处理期间流动。即，此配置确保基本上所有的流体及其成分流过(而非围绕)多个微米柱阵列122的场。
[0080]
在另一配置中，在所述相对的微米柱阵列122的多个顶端之间可存在一间隔或间隙。现在参见图2a及图2b是一微米柱阵列处理平台100的另一实例的剖面图，其中在相对的微米柱阵列122的顶端之间存在间隔或间隙。其中此配置相较于图1a、图1b及图1c的配置可能效率较低。在此实例中，在所述相对的微米柱阵列122的多个顶端之间的间隔或间隙提供通过反应(或分析)室118的中心(其中流体速度最高)的低阻力流动路径，其中多个靶向(例如，多个珠粒/捕获靶向)可行进，且不会在x/y中遇到一微米柱阵列122。
[0081]
现在参考图3a及图3b分别是在一基板110上形成多个表面附着的微米柱阵列122的所述基板110的一实例的透视图及剖面图。即，图3b是沿图3a的线a-a截取的剖面图。基板110可为例如直径为6英寸或12英寸的晶片，所述晶片在其区域上具有基本上连续的场或自立式多个微米柱阵列122的阵列。基板110可为一刚性或半刚性基板，例如由玻璃、塑料、硅或硅树脂形成。在一实例中，各个基板110是一塑料基板，例如由可从杜邦帝人薄膜(dupont teijin films)(切斯特，va)购得的半刚性商标聚酯膜所形成的一基板。所述基板110的厚度在一实例中可为从约100μm至约300μm，或者在另一实例中是约250μm。
[0082]
现在参见图4a及图4b是反应(或分析)室118的一部分的一实例的侧视图，其中多个微米柱阵列122可被设置在一微米柱阵列场或阵列。术语“微米柱阵列场(micropost field)”或“微米柱阵列(micropost array)”在本文中用于描述一基板向外延伸的多个小柱阵列的一场或阵列，其高度通常在1至100微米的范围内。在一实施例中，一微米柱阵列场或阵列的多个微米柱阵列可垂直地排列。值得注意的是，各个微米柱阵列包括附着至所述基板基座的一近端及与所述近端相对的一远端或顶端。据此，在一基板124上提供多个微米柱阵列122的排列。
[0083]
多个微米柱阵列122及基板124可由例如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)形成。在所述场或阵列中的多个微米柱阵列122的长度、直径、几何形状、取向及间距可变化。例如，多个微米柱阵列122的长度可在约1μm变化至约100μm之间变化。多个微米柱阵列122的直径可在约0.1μm至约10μm之间变化。此外，多个微米柱阵列122的剖面形状可变化。例如，多个微米柱阵列122的剖面形状可为圆形、卵形、正方形、矩形、三角形等。多个微米柱阵列122的取向可变化。例如，图4a显示基本上垂直于基板124的平面所定向的多个微米柱阵列122，而图4b显示相对于基板124的平面的法线，以角度α所定向的多个微米柱阵列122。在未施加致动力的一中间位置，角度α可为例如从约0度至约45
度。此外，在一微米柱阵列场或阵列内的多个微米柱阵列122的节距可变化，例如从约0μm至约50μm。此外，在所述微米柱阵列场或阵列内的多个微米柱阵列122相对位置可变化。
[0084]
图5a及图5b显示一微米柱阵列122的侧视图，以及显示其致动运动的实例。即，图5a显示基本上垂直于基板124的平面所定向的一微米柱阵列122的一实例。图5a显示所述微米柱阵列122的远端可(1)以仅相对于固定的近端的侧对侧2d运动(side-to-side 2d motion)或(2)以相对于固定的近端的圆周运动，其为一锥形运动进行移动。相较之下，图5b显示相对于基板124的平面以一角度所定向的一微米柱阵列122的一实例。图5b显示所述微米柱阵列122的远端可(1)以仅相对于固定的近端的倾斜的侧对侧2d运动或(2)以相对于固定的近端的倾斜的圆周运动，其为一倾斜的锥形运动进行移动。在任何多个微米柱阵列处理平台100中，通过致动多个微米柱阵列122及引起其运动，反应(或分析)室118中的任何流体实际上被搅拌或引起流动或循环。此外，在图5a中所显示的微米柱阵列122的锥形运动，以及在图5b中所显示的微米柱阵列122的倾斜的锥形运动，可使用一旋转磁场来实现。一旋转磁场是一多个微米柱阵列致动机构的“致动力(actuation force)”的一实例。
[0085]
仍然参见图1a至图5b，多个微米柱阵列122基于例如美国专利第9,238,869号中所描述的多个微米柱阵列，标题为“使用多个致动的表面附着的柱阵列来评估生物流体流变学的方法及系统”，其全部公开内容通过引用方式并入本文中。在一实例中，根据’869专利，多个微米柱阵列122及基板124可由pdms形成。
[0086]
在各种实施例中，多个微米柱阵列处理平台100的反应(或分析)室118内的多个微米柱阵列122可使用多个靶向特异性分析物捕获元件进行官能化。例如，如所述，多个微米柱阵列122可使用多个分析物捕获元件进行官能化，例如参考美国专利申请第62/220,906号，标题为“利用多个表面附着的结构的流动池以及相关的系统及方法”；其全部公开内容通过引用方式并入本文中。据此，通过使用多个分析物捕获元件以官能化多个微米柱阵列122，多个微米柱阵列处理平台100可用于基于亲和力的结合或分离操作。
[0087]
在一些实施例中，微米柱阵列122可使用一表面官能化程序来进行官能化。即，所述官能团(例如，结合基团或阻断基团)是附接至(例如，接枝、键结等)或位于多个微米柱阵列122的表面上。在一实例中，在多个微米柱阵列处理平台100中的多个微米柱阵列122的场或阵列的表面官能化可在组装所述两个基板110以形成其中具有多个微米柱阵列122的反应(或分析)室118之前进行。在另一实例中，多个微米柱阵列122的表面官能化程序可包括在组装所述两个基板110以形成其中具有多个微米柱阵列122的反应(或分析)室118之前执行的一或多个步骤。
[0088]
图6说明目前所公开的用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的方法200的一实例的流程图。即，方法200使用一表面官能化程序来官能化多个微米柱阵列处理平台100的多个微米柱阵列122，以使用一生物素-抗生物素蛋白结合系统来高效捕获靶分析物。方法200可包括，但不限于，以下的步骤。
[0089]
在步骤210，提供包括多个表面附着的微米柱阵列的一或多个基板。例如，且现在参见图1a至图2b，提供一或多个基板110，其中至少一基板110包括多个未经处理的表面附着的微米柱阵列122。在一实例中，多个微米柱阵列122是由pdms形成。
[0090]
在步骤215，进行一修饰反应，以修饰所述多个pdms微米柱阵列122的多个表面。例如，使用一气相沉积程序，将具有多个表面附着的微米柱阵列122的一或多个基板110放置
于一反应室中，且暴露于硅烷化剂，以将在多个pdms微米柱阵列122的多个表面上的多个官能团(例如，多个硅烷醇基团及多个自由基基团)转化为多个含有胺的基团。在一实例中，硅烷化剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,aptes)。进行所述修饰反应，使得全部的或基本上全部的所述多个微米柱阵列122表面皆暴露于硅烷化剂(即，3-氨基丙基三乙氧基硅烷，aptes)，以及所述多个pdms官能团(例如，多个硅烷醇基团及多个自由基基团)被转化为多个含有胺的基团(即，胺-官能化)。
[0091]
在步骤220，将所述两个基板进行组装，以形成其中具有多个经修饰的表面附着的微米柱阵列的一微流体室。例如且仍参见图1a至图2b，所述两个基板110及间隔物或衬垫116以一分层的方式进行组装，以形成多个微米柱阵列处理平台100的反应(或分析)室118。反应室118提供一包含的微流体通道，其中一界定的流体的体积的可流入及流出多个微米柱阵列处理平台100(例如，经由多个流体端口120或直接地进入间隙114)以用于随后的基于溶液的官能化反应。
[0092]
在步骤225，进行一第一官能化反应，以在所述多个经修饰的微米柱阵列的表面上添加一通用结合剂。例如且仍然参见图1a至图2b，所述第一官能化试剂的一溶液流入反应(或分析)室118(例如，经由多个流体端口120或直接地流入间隙114)。所述第一官能化试剂是例如聚乙二醇化胺反应性生物素试剂，即胺酯-聚乙二醇-生物素。所述胺酯-聚乙二醇-生物素试剂的n-羟基琥珀酰亚胺酯(n-hydroxysuccinimide ester,nhs)的基团与多个所述经修饰的微米柱阵列122的多个表面上的多个胺基团反应，以形成多个稳定的酰胺键。所述两亲性聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)间隔臂促进含有生物素的分子在一水溶液中的溶解，且最大限度地减少后续生物素结合反应的间隔位阻。此外，在多个微米柱阵列122的表面上的多个聚乙二醇分子的存在实质上改善一反应(或分析)室118的润湿性，即，在所述多个pdms微米柱阵列的表面上的多个聚乙二醇分子实质上降低介于所述多个pdms微米柱阵列与多个水溶液之间的接触角。所述聚乙二醇间隔臂亦充当一“瓶刷(bottlebrush)”聚合物，限制接近多个微米柱阵列122的表面，从而减少对所述多个柱阵列表面的非特异性结合。在所述聚乙二醇间隔臂的一末端的生物素官能团为一生物素化靶向特异性捕获剂的后续附接提供一通用结合部分。选择所述聚乙二醇间隔物的链长以向末端结合的生物素基团提供足够的移动性。针对此聚乙二醇间隔臂的示例性分子量(molecular weight,mw)为500至5000。进行所述第一官能化反应，例如，使用一特定浓度的所述第一官能化试剂及多个反应条件，以在多个微米柱阵列122的表面上提供足以用于随后高效捕获一靶分析物的多个聚乙二醇-生物素结合位点的一密度。在一实例中，所述第一官能化试剂是生物素-聚乙二醇-scm，其分子量为2000，且可从creative pegworks购得。
[0093]
在步骤230，进行一阻断(钝化)反应，以阻断(钝化)在所述多个生物素官能化的微米柱阵列上多个未结合的胺位点。例如且仍然参见图1a至图图2b，所述阻断(钝化)试剂的溶液流入反应(或分析)室118(例如，经由多个流体端口120或直接地流入间隙114)。所述阻断剂是例如一胺反应性聚乙二醇试剂，例如胺酯-聚乙二醇，其与所述多个未结合的胺位点反应，以及在空间上阻断与多个微米柱阵列122的表面的非特异性结合。在多个微米柱阵列122的表面上所存在的多个阻断聚乙二醇分子亦有助于改善反应(或分析)室118的润湿性。所述多个阻断聚乙二醇分子的链长被选择为足够短于所述聚乙二醇-生物素结合剂的链长(即，所述第一官能化试剂，胺酯-聚乙二醇-生物素)，例如分子量为100至1000的范围。由于
所述阻断聚乙二醇分子的链长足够短于所述聚乙二醇-生物素结合剂的链长，因此保持在所述聚乙二醇臂的末端处的生物素结合基团的移动性。进行所述阻断(钝化)反应，例如使用所述阻断试剂的浓度及反应条件来有效地阻断(钝化)多个微米柱阵列122的表面。在一实例中，所述阻断(钝化)试剂是可从creative pegworks(mw 1000)购得的ss-peg-ss。
[0094]
在步骤235，进行一第二官能化反应，以将一结合连接子添加至所述多个生物素官能化的微米柱阵列。例如且仍然参见图1a至图2b，所述第二官能化试剂的一溶液流入反应(或分析)室118(例如，经由多个流体端口120或直接地流入间隙114)。所述第二官能化试剂是一生物素结合试剂，例如一抗生物素蛋白试剂(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白；其可从thermofisher或sigma购得)。所述生物素结合试剂(例如，抗生物素蛋白)结合至所述多个生物素官能化的微米柱阵列122上的生物素基团，以及提供用于将一靶向特异性生物素化捕获剂(例如，一生物素化抗体)与多个微米柱阵列122结合的一连接子
[0095]
在步骤240，进行一第三官能化反应，以将一生物素化靶向特异性捕获剂添加至所述多个聚乙二醇-生物素官能化的微米柱阵列。例如且仍然参见图1a至图2b，所述第三官能化试剂的一溶液流入反应(或分析)室118(例如，经由多个流体端口120或直接地流入间隙114)。所述第三官能化试剂是一靶向特异性生物素化捕获剂，例如一生物素化抗体。所述靶向特异性生物素化捕获剂经由所述生物素结合连接子试剂(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)结合多个微米柱阵列122。
[0096]
在步骤245，干燥所述官能化的微流体室。在一实例中，使用一冻干方案进行干燥反应(或分析)室118。使用冻干作为用于干燥各种试剂(例如，蛋白质)的一技术是众所周知的，且本领域普通技术人员将认可多个方案及/或多个条件可为特定应用。
[0097]
图7a及图7b用图表示图6的方法200的一些步骤。图7a及图7b中，仅显示基板110的一部分及一单一微米柱阵列122。即，在步骤210(未示出)，提供包括多个表面附着的微米柱阵列的一或多个基板110。例如，提供两个基板110，其中至少一基板110包括由例如pdms所形成的多个表面附着的微米柱阵列122的一排列。
[0098]
在步骤215，进行一修饰反应，以修饰pdms微米柱阵列122的表面。例如，将具有表面附着的微米柱阵列122的一或多个基板110放置于一反应室(未示出)中，且暴露于一硅烷化剂，以将在pdms微米柱阵列122的表面上的多个官能团126a(例如，多个硅烷醇基团及多个自由基基团)转化为多个含有胺的基团126b。在一实例中，硅烷化剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)。在一实例中，使用一气相沉积程序进行所述修饰反应，其中将所述多个基板110被放置于一湿度受控的密封室中，且在80℃下暴露于所述硅烷化剂(即，3-氨基丙基三乙氧基硅烷，aptes)约1小时至约24小时。
[0099]
在步骤220(未示出)，所述两个基板110及间隔物或衬垫116以一分层的方式进行组装，以形成多个微米柱阵列处理平台100的反应(或分析)室118。反应室118提供一包含的微流体通道，其中一界定的流体的体积的可流入及流出多个微米柱阵列处理平台100(例如，经由多个流体端口120或直接地进入间隙114)以用于随后的基于溶液的官能化反应。
[0100]
在步骤225，进行所述第一官能化反应，以在所述经胺修饰的微米柱阵列122的表面上添加一通用结合剂。在一实例中，所述第一官能化试剂是胺酯-聚乙二醇-生物素的一水溶液，其具有941或约54埃的分子量(即，nhs-peg
12-生物素)。所述胺酯-聚乙二醇-生物素
分子的胺酯基团与在微米柱阵列122上的所述胺基126b反应，以将聚乙二醇-生物素共价地结合至微米柱阵列122。使用一浓度的nhs-peg
12-生物素及多个反应条件，进行所述第一官能化反应，以提供在微米柱阵列122的表面上的一特定密度的聚乙二醇-生物素结合位点(即，并非所有的胺基团126b皆被聚乙二醇-生物素结合)。在一实例中，所述第一官能化反应在室温(25℃)下进行约30分钟至约1小时。所述聚乙二醇间隔臂的末端处的生物素官能团提供一通用结合部分，以用于随后附接一靶向特异性捕获剂。
[0101]
在步骤230，进行所述阻断(钝化)反应，以阻断(钝化)在聚乙二醇-生物素官能化的微米柱阵列122上的多个未结合的胺基126b。在一实例中，所述阻断剂是胺酯-聚乙二醇的一水溶液，其具有589或约29埃的分子量(即，nhs-peg4)。在一实例中，所述阻断(钝化)反应是在室温(25℃)下进行约30分钟至约1小时。
[0102]
由于所述多个阻断聚乙二醇分子的链长足够短于所述聚乙二醇-生物素结合剂的链长，因此保持在所述聚乙二醇臂的末端处的生物素结合基团的移动性。
[0103]
在步骤235，进行所述第二官能化反应，以向所述聚乙二醇-生物素官能化的微米柱阵列122添加结合一结合连接子。在一实例中，所述第二官能化试剂是一生物素结合试剂，例如一抗生物素蛋白试剂(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)。所述生物素结合试剂(例如，抗生物素蛋白)结合至所述聚乙二醇-生物素官能化的微米柱阵列122上的生物素基团。一抗生物素蛋白分子(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)具有四个生物素结合位点。当一抗生物素蛋白分子结合至在微米柱阵列122上的一生物素基团时，在所述抗生物素蛋白连接子分子上的三个生物素结合位点保留可用于一靶向特异性生物素化捕获剂(例如，3个生物素化抗体，“ab
3”)的后续的结合。
[0104]
在步骤240，进行所述第三官能化反应，以向所述多个聚乙二醇-生物素/抗生物素蛋白官能化的微米柱阵列添加一生物素化的靶向特异性捕获剂。所述第三官能化试剂是一靶向特异性生物素化捕获剂，例如一生物素化抗体。所述靶向特异性生物素化捕获剂经由所述生物素结合连接子试剂(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)结合至微米柱阵列122。
[0105]
在另一实施例中，图8说明一方法300的流程图，所述方法300是目前所公开的用于靶向特异性结合及高效结合的硅的表面修饰的方法的另一实例。方法300与图6所示的方法200基本上相同，除了省略步骤240之外。即，方法300包括步骤210，接着是步骤215，接着是步骤220，接着是步骤225，接着是步骤230，接着是步骤235，及之后是步骤245；其中所有的步骤如参考图6的方法200所述。在此实施例中，多个微米柱阵列处理平台100仅将多个生物素/抗生物素蛋白官能化的微米柱阵列122提供一给最终使用者。据此，在使用之前，所述最终使用者之后将一最终的官能化步骤(即，作为“运行时(run-time)”最终官能化反应)整合至其分析方案中，以将所述生物素化捕获剂(例如，一生物素化ab)附接至微米柱阵列122。
[0106]
在又一实施例中，图9说明一方法400的流程图，所述方法400是目前所公开的用于靶向特异性结合及高效结合的硅的表面修饰的方法的又一实例。方法400与图6所示的方法200基本上相同，除了省略步骤235及步骤240之外。即，方法400包括步骤210，接着是步骤215，接着是步骤220，接着是步骤225，接着是步骤230，且之后是步骤245；其中所有的步骤如参考图6的方法200所述。在此实施例中，多个微米柱阵列处理平台100仅将多个生物素官
能化的微米柱阵列122提供一给最终使用者。据此，在使用之前，所述最终使用者之后将两个官能化步骤(即，作为运行时最终官能化反应)整合至其分析方案中，所述两个官能化步骤为添加所述抗生物素蛋白连接子的一步骤，以及将所述生物素化的捕获剂(例如，一生物素化的ab)连接至多个微米柱阵列122的另一步骤。
[0107]
为了使用图6的方法200及图1a至图2b的多个微米柱阵列处理平台100，以评估使用多个生物素化捕获抗体(使用生物素化山羊抗小鼠igg)进行官能化的多个微米柱阵列的结合化学，进行多个分析物捕获实验。例如，图10a及图10b是分别使用悬浮在一简单的缓冲基质中的多个珠粒及掺入全血中的细菌(即，大肠杆菌)所进行的多个分析物捕获实验的照片。现在参见图10a，数据证实通过使用生物素化捕获抗体进行官能化的多个微米柱阵列，捕获悬浮在一缓冲基质中的包覆有tnf-α小鼠抗驴抗体的多个珠粒。现在参见图10b，数据证明通过使用多个生物素化抗大肠杆菌o157:h7捕获抗体(购自seracare)进行官能化的多个微米柱阵列，捕获掺入全血中的大肠杆菌。大肠杆菌在血液中的浓度每毫升含有约10,000个细胞。
[0108]
在用于特异性靶向结合及高效结合的硅的表面修饰的任何目前所公开的多个微米柱阵列表面官能化程序(例如，方法200、方法300及/或方法400)完成时，已进行的所述多个微米柱阵列处理平台100现在可以被称为可被递送给一最终使用者的多个经处理的微米柱阵列处理平台100。在一实例中，图11显示所述多个经处理的微米柱阵列平台100的一实例的侧视图，其中两个基板110皆包括多个官能化的微米柱阵列122的一场或阵列。图12显示多个经处理的微米柱阵列平台100的一实例的侧视图，其中一基板110仅包括多个官能化的微米柱阵列122的一场或阵列。在图11及图12所示的实例中，多个经处理的微米柱阵列平台100可为一结构，所述结构包括在其整体上的多个基板110，例如6英寸或12英寸直径的基板，其在其区域上具有基本连续的场或自立式多个官能化的微米柱阵列122的阵列。在又一实例中，图13显示被切割成单独的微流体装置150的所述多个经处理的微米柱阵列平台100的一实例的平面图，其中所述多个微流体装置150中的各个包括在一反应(或分析)室中的多个官能化的微米柱阵列122的一设置。例如，所述多个微流体装置150中的各个皆可作为一插入式就绪模块而予以提供，以便容易地集成至一最终使用者的任何流体盒或系统中。同样的，在多个经处理的多个微米柱阵列平台100及/或微流体装置150中的所述多个官能化的微米柱阵列122的状态取决于使用何种官能化的方法200、300或400，其可取决于最终使用者的需求。
[0109]
此外，虽然前述方法200、方法300，及/或方法400被描述为在一基板水平结构上进行，所述基板水平结构例如多个微米柱阵列处理平台100，但在其他的实施例中，前述方法200、方法300，及/或方法400可替代地在诸如多个微流体装置150的多个切割装置上进行。
[0110]
所述通用结合剂或连接剂的任何部分皆可被修饰，以使其变得易劈的，以促进如所述使用者所希望的所捕获的物件的释放。例如，多个结合剂及/或连接剂可被修饰，使得其是酸的、炔烃、肼、连二亚硫酸钠及光可裂解的。其对于需要完整地回收从样本中捕获的物件很重要的情况是很有用。例如，人们可能希望通过在小(例如，10微升)室中处理大体积(例如，10毫升)，以从血液中捕获细菌，从而集中所述细菌。之后可通过使用含有一裂解剂的缓冲液冲洗所述小室(可能在洗掉剩余的血液之后)释放此经浓缩的样本。因此，人们可提取一经浓缩(从10毫升至10微升)及经纯化(从血液至缓冲液)的样本。