两种阴道乳酸杆菌及其应用的制作方法

no.22802。
7.2、技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.两种阴道乳酸杆菌，寄存于中国普通微生物保藏管理中心，具体包括有一种卷曲乳酸杆菌和一种詹氏乳酸杆菌；
10.所述卷曲乳酸杆菌，其保藏号为cgmcc no.22801；
11.所述詹氏乳酸杆菌，其保藏号为cgmcc no.22802。
12.优选地，所述卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌从健康女性阴道中分离所得。
13.优选地，所述保藏号为cgmcc no.22801的卷曲乳酸杆菌，其 16s rdna序列为： ttagacggctccttcccgaaggttaggccaccggctttgggca ttgcagactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccg ggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcga ttccagcttcgtgcagtcgagttgcagactgcagtccgaactg agaacagctttcagagattcgcttgccttcgcaggctcgcttc tcgttgtactgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcata aggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggttt gtcaccggcagtctcattagagtgcccaacttaatgctggcaa ctaataacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacat ctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtcttag cgtccccgaagggaactttgtatctctacaaatggcactagat gtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaacc acatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgag tttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgc gttagctgcagcactgagaggcggaaacctcccaacacttag cactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctg ttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagacca gagagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgca ttccaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcactca agaaaaacagtttccgatgcagttcctcggttaagccgagggc tttcacatcagacttattcttccgcctgcgctcgctttacgccc aataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggct gctggcacgtagttagccgtgactttctggttgattaccgtca aataaaggccagttactacctctatccttcttcaccaacaaca gagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgc tccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgc ctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccg atcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagcc tttaccttaccaactagctaatgcaccgcggggccatcccata gcgacagcttacgccgccttttaaaagctgatcatgcgatctg ctttcttatccggtattagcacctgtttccaagtggtatcccag actatggggcaggttccccacgtgttactcacccatccgccgc tcgctttcctaacgtcattaccgaagtaaatctgttagttccgc tcgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcc tgagccagatccaaact。
14.优选地，所述保藏号为cgmcc no.22802的詹氏乳酸杆菌，其 16s rdna序列为： ccattaggcggctggctccaaaggttacctcaccgactttggg tgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcc cgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagc gattccagcttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaac tgagaacagctttaagagatccgcttgccttcacaggttcgct tctcgttgtactgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtca taaggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggt ttgtcaccggcagtctcaatagagtgcccaacttaatgctggc aactattaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaac atctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtctc tttgtccccgaagggaaaacctaatctcttaggtggtcaaagg atgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaa ccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttg agtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaat gcgttagctgcagcactgagaggcggaaacctcccaacactt agcactcatcgtttacggcatggact
accagggtatctaatcc tgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagac cagagagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacg cattccaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcact caagattgacagtttctgatgcagttcttcggttgagccgaag gctttcacatcagacttatcaatccgcctgcgctcgctttacgc ccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcgg ctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttgattaccgtc aaataaaggccagttactacctctatccttcttcaccaacaac agagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttg ctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctg cctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggcc gatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagc cgttaccttaccaactagctaatgcatcgcaggtccatccttt agcgacagcttacgccgccttttaaacttctttcatgcgaaag tagcttttatccggtattagcatctgtttccaaatggtatccca gacttaagggcaggttacccacgcgttactcacccatccgccg ctagcttgtatctatgtccattccgaagaatttcaataggcaa gctcgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgt cctgagccagattccaaac。
15.两种阴道乳酸杆菌的应用，所述卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外能显著的抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，其在阴道菌群紊乱的调节及宫颈癌防治方面有重要的应用。
16.3、有益效果
17.本发明所提出的通过从人体内分离的两种乳酸杆菌在体外能显著的抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，这将为阴道菌群紊乱的调节及宫颈癌防治方面有重要的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的健康志愿者和宫颈癌患者阴道菌群结构分析图；
19.图2为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌的菌落示意图；
20.图3为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌的革兰染色示意图；
21.图4是为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌的全基因组图谱及比对结果示意图；
22.图5是为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外对宫颈癌细胞增殖的影响示意图；
23.图6是为本发明提出的两种阴道乳酸杆菌及其应用的分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外对宫颈癌细胞迁移的影响示意图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：
26.两种阴道乳酸杆菌，寄存于中国普通微生物保藏管理中心，具体包括有一种卷曲乳酸杆菌和一种詹氏乳酸杆菌；
27.卷曲乳酸杆菌，其保藏号为cgmcc no.22081；
28.詹氏乳酸杆菌，其保藏号为cgmcc no.22802。
29.卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌从健康女性阴道中分离所得。
30.保藏号为cgmcc no.22081的卷曲乳酸杆菌，其16s rdna序列为： ttagacggctccttcccgaaggttaggccaccggctttgggca ttgcagactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccg ggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcga ttccagcttcgtgcagtcgagttgcagactgcagtccgaactg agaacagctttcagagattcgcttgccttcgcaggctcgcttc tcgttgtactgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcata aggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggttt gtcaccggcagtctcattagagtgcccaacttaatgctggcaa ctaataacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacat ctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtcttag cgtccccgaagggaactttgtatctctacaaatggcactagat gtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaacc acatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgag tttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgc gttagctgcagcactgagaggcggaaacctcccaacacttag cactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctg ttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagacca gagagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgca ttccaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcactca agaaaaacagtttccgatgcagttcctcggttaagccgagggc tttcacatcagacttattcttccgcctgcgctcgctttacgccc aataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggct gctggcacgtagttagccgtgactttctggttgattaccgtca aataaaggccagttactacctctatccttcttcaccaacaaca gagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgc tccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgc ctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccg atcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagcc tttaccttaccaactagctaatgcaccgcggggccatcccata gcgacagcttacgccgccttttaaaagctgatcatgcgatctg ctttcttatccggtattagcacctgtttccaagtggtatcccag actatggggcaggttccccacgtgttactcacccatccgccgc tcgctttcctaacgtcattaccgaagtaaatctgttagttccgc tcgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcc tgagccagatccaaact。
31.保藏号为cgmcc no.22802的詹氏乳酸杆菌，其16s rdna序列为： ccattaggcggctggctccaaaggttacctcaccgactttggg tgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcc cgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagc gattccagcttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaac tgagaacagctttaagagatccgcttgccttcacaggttcgct tctcgttgtactgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtca taaggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggt ttgtcaccggcagtctcaatagagtgcccaacttaatgctggc aactattaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaac atctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtctc tttgtccccgaagggaaaacctaatctcttaggtggtcaaagg atgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaa ccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttg agtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaat gcgttagctgcagcactgagaggcggaaacctcccaacactt agcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcc tgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagac cagagagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacg cattccaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcact caagattgacagtttctgatgcagttcttcggttgagccgaag gctttcacatcagacttatcaatccgcctgcgctcgctttacgc ccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcgg ctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttgattaccgtc aaataaaggccagttactacctctatccttcttcaccaacaac agagctttacgatccgaaa
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32.两种阴道乳酸杆菌的应用，卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外能显著的抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，其在阴道菌群紊乱的调节及宫颈癌防治方面有重要的应用。
33.实施例2：
34.请参阅图1，结合实施例1的基础有所不同之处在于，
35.健康志愿者和宫颈癌患者阴道菌群组成的比较
36.1)dna提取：从-80℃冰箱取出健康志愿者和宫颈癌患者阴道拭子标本在冰上解冻，等其恢复室温后，按照qlaamp dna mini kit 操作说明提取每个阴道拭子的dna，将所得dna样品用nano drop 2000(thermo)仪器检测其浓度(ng/μl)和纯度(a260/a280)， a260/a280比值一般应在1.8-2.0之间，然后对提取的dna进行分装保存；
37.2)阴道菌群16s rrna 基因高通量测序分析：应用illuminate hiseq pe250 16s rrna 基因测序分析技术对所提取的阴道拭子dna 进行测序分析：
38.a1、首先dna样品经质控分析后，将其上传到qiime (quantitative insights into microbial ecology，v1.8.0)以供进一步研究；
39.a2、然后基于有效数据进行otus(operational taxonomic units) 聚类和物种分类分析；
40.a3、根据otus聚类结果，对每个out的代表序列做物种注释，健康志愿者和宫颈癌患者阴道菌群组成如图1所示，结果显著宫颈癌患者阴道菌群紊乱，阴道乳酸杆菌的丰度显著降低。
41.实施例3：
42.请参阅图2-4，基于实施例1-2但有所不同之处在于，
43.培养基的制备
44.分离用培养基的制备：卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌分离培养所使用的培养基是mrs固体培养基，mrs固体培养基各组分质量浓度组成为：蛋白胨10g，牛肉浸粉8g，酵母浸粉4g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰 0.04g，琼脂14g，吐温80 1g，在室温调整ph值为6.5
±
0.2，溶于1l蒸馏水中。
45.增菌用培养基的制备：卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌增菌所使用的培养基是mrs肉汤培养基，mrs肉汤培养基各组分质量浓度组成为：蛋白胨10g，牛肉浸粉8g，酵母浸粉4g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04 g，在室温调整ph值为5.7
±
0.2，溶于1l蒸馏水中。
46.卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌的分离与鉴定
47.菌种的分离
48.将健康人阴道拭子样本溶于1ml无菌生理盐水中，反复挤压至液体浑浊，再利用棉拭子均匀涂布于mrs固体平板上，在37℃厌氧环境下培养24h，挑选出明显浅白色菌落，进行
分离、纯化与保存。
49.菌种的鉴定
50.1)形态学观察：将上述分离的菌株接种在mrs固体培养基上， 37℃厌氧环境下培养24h后观察菌落形态，如图2所示，分离的一株菌菌落白色，边缘不整齐，片状，中央凸起；另一株菌圆形白色，边缘整齐，菌落光滑；
51.2)革兰染色：将上述两株菌革兰染色后光学显微镜观察，如图 3所示，两株菌均为革兰阳性杆菌；
52.3)分子生物学鉴定：对筛选得到的菌株进行16s rdna进行扩增，将纯化后pcr产物进行测序，测序结果如实施例1中序列表所示；对筛选的菌株进行全基因组测序，全基因测序图谱及比对结果如图4所示。
53.综合形态、革兰染色和分子生物学鉴定的结果，分离得到的一株菌为卷曲乳酸杆菌、另一株为詹氏乳酸杆菌。
54.上述分离得到的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌，已于2021年6 月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc)。
55.实施例4：
56.请参阅图5，基于实施例1-3但有所不同之处在于，
57.卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外对宫颈癌细胞增殖的影响，具体试验步骤为：
58.1)用含5％胎牛血清的培养液将宫颈癌细胞siha配成单个细胞悬液，在96孔板中加入100μl 5000个细胞，每个实验组或对照组均做3个复孔；
59.2)挑取例2分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌单菌落，接种于100ml mrs肉汤培养基中，37℃厌氧环境下培养。隔天吸取细菌培养液，利用酶标仪测定600nm处的光密度(od)来监测细菌生长情况，待od600＝1.5时，5,000rpm离心10min，收集菌体及培养液，并通过0.2μm过滤器过滤后将上清液添加至宫颈鳞状上皮细胞癌细胞悬液中，mrs培养基用作对照。moi，即细菌和细胞比例为1:1000。
60.3)37℃、5％co2条件培养过夜；
61.4)将5*mtt稀释成1*mtt，每孔加入50μl 1*mtt，37℃培养4h，使mtt还原成甲臜；
62.5)终止培养，小心倾倒孔内上清液，避免损失细胞，每孔加50 μl二甲基亚砜(dmso)使结晶物充分溶解，用平板摇床摇匀，最后用酶标仪于595nm波长处测定吸光度。
63.结果见图5，分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外均能显著抑制对宫颈癌细胞的增殖(***p《0.001)。
64.实施例5：
65.请参阅图6，基于实施例1-4但有所不同之处在于，
66.卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外对宫颈癌细胞迁移的影响，具体试验步骤为：
67.1)在6孔板中接种约5
×
105个siha细胞，保证过夜能铺满；
68.2)第二天用枪头垂直横竖划痕，枪头要垂直，不能倾斜；
69.3)用pbs洗细胞三次，去除划下的细胞，向培养基中按照 moi＝1:1000添加实施例
4中卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌的上清液，mrs用作对照；
70.4)放入37℃培养箱培养，按0，48小时取样，拍照，用imagej 软件对图片进行分析。
71.结果见图6，分离的卷曲乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌在体外均能显著抑制对宫颈癌细胞的迁移(****p《0.0001)。
72.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。