通过给予表达TPP1的AAV治疗眼的溶酶体贮积病的制作方法

通过给予表达tpp1的aav治疗眼的溶酶体贮积病
1.相关申请的引用
2.本技术要求2019年4月8日提交的美国临时申请第62/831,067号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
3.序列表的引用
4.本技术包含序列表，其通过efs-web以ascii格式提交，并且在此通过引用整体并入本文。所述ascii副本创建于2020年4月8日，命名为chopp0026wo_st25.txt，大小为7.6干字节。


背景技术：

5.1.领域
6.本发明涉及医药、遗传学和分子生物学领域。更具体地，它涉及表达溶酶体丝氨酸蛋白酶tpp1的aav载体的视网膜下给药，用于治疗溶酶体贮积病。
7.2.相关技术
8.基因转移目前被广泛认为是用于在细胞和分子水平分析生物事件和疾病过程的有力工具。最近，基因治疗在治疗遗传性(例如，ada缺乏)或获得性(例如，癌症或传染病)人类疾病中的应用受到了相当多的关注。
9.传统上，基因治疗已被定义为将治疗基因引入哺乳动物的细胞中，以纠正先天遗传错误的过程。虽然目前超过4500名人类疾病被归类为遗传性的，但已经确定了这些疾病中相对较少的疾病的人类基因组中的特异性突变。直到最近，这些罕见的遗传疾病仍代表了基因治疗努力的唯一目标。因此，大多数nih批准的基因治疗方案迄今为止集中在将缺陷基因的功能性拷贝引入具有已知的先天遗传错误的个体的体细胞中。直到最近，研究人员和临床医生才开始意识到大多数的人类癌症、某些形式的心血管疾病和许多退行性疾病也具有重要的遗传成分，并且为了设计新的基因治疗，应将其视为“遗传障碍”。因此，基因治疗最近被广泛定义为通过将新的遗传信息引入受影响的生物体来纠正疾病表型。
10.在体内基因治疗中，将转移的基因原位引入受体生物体的细胞中，即在受体内。已在几种动物模型中检查了体内基因治疗。最近的一些出版物已经报道了将基因原位直接转移到诸如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺的器官和组织的可行性。已报道了将dna直接注射到骨骼肌、心肌，和将dna-脂质复合物注射到脉管系统中，以在体内产生(多种)插入的基因产物的可检测到的表达水平。
11.中枢神经系统疾病，例如遗传性基因疾病的治疗，仍然是一个棘手的问题。这种情况的实例是溶酶体贮积病和阿尔茨海默病。总的来说，溶酶体贮积病(lsd)的发病率是全球每10,000出生人数中有1例，而且在65％的病例中，存在显著的中枢神经系统(cns)受累。当静脉递送时，这些障碍中缺乏的蛋白质不穿过血脑屏障，或者当直接递送到大脑时，不广泛分布。因此，需要开发用于cns缺陷的疗法。


技术实现要素：

12.因此，根据本发明，提供了一种治疗患有溶酶体贮积病(lsd)的哺乳动物的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物视网膜下给予多个aav颗粒，所述aav颗粒包含(i)插入到一对aav反向末端重复序列(itrs)之间的核酸，所述核酸编码(1)可溶性溶酶体三肽基肽酶1(tpp1)多肽，(2)其片段，(3)前述任一种的酶原，或(4)前述任一项的组合；和(ii)可操作地连接所述核酸并驱动其表达以产生具有溶酶体水解酶活性的多肽的表达控制元件，其中所述aav颗粒能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达。aav itr中的一个或多个可以包含一个或多个aav2 itr。核酸可以编码哺乳动物tpp1，例如人tpp1。该方法可以导致减慢、停止、逆转或防止视力丧失/失明。
13.表达控制元件可以包含cmv增强子和/或β-肌动蛋白启动子，例如鸡β-肌动蛋白启动子。表达控制元件包含与天然cmv增强子具有80％或更多同一性，或与天然鸡β-肌动蛋白启动子或前述任一项的功能片段具有80％或更多同一性的序列。
14.aav颗粒还包含衣壳蛋白。衣壳序列或片段可以包含与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3序列或其功能片段具有70％或更多同一性的vp1、vp2和/或vp3衣壳序列或片段。衣壳序列或片段可以包含与aav2具有80％或更多同一性的vp1衣壳序列或片段，其中衣壳序列或片段在444、500和/或730位的酪氨酸被非酪氨酸的氨基酸置换。衣壳序列或片段可以包含与aav2或其功能片段具有90％或更多同一性的vp1衣壳序列或片段，其中衣壳序列或片段在444、500和/或730位的酪氨酸被苯丙氨酸置换。衣壳序列或片段可以包含在444、500和/或730位的酪氨酸被苯丙氨酸置换的aav2 vp1衣壳序列或其功能片段。衣壳序列或片段可以包含vpl、vp2或vp3衣壳序列或其功能片段，其选自以下中的任一种：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8 aav血清型或其功能片段。
15.患者可能先前已经、正在或将要通过不同的给药途径接受tpp1酶替代疗法。aav颗粒可以以约1x108至约1x10
15
总vg的剂量给药。哺乳动物可以是非啮齿类哺乳动物，例如灵长类动物，例如人，例如人类儿童，例如约1至约4岁的人类儿童。lsd可以是婴儿或晚发性婴儿蜡样质脂褐素沉积病(lincl)、青少年batten病、法布里病、mld、sanfilippo氏a综合征、krabbe病、morquio病、niemann-pick病c型、tay-sachs病、hurler病(mps-i h)、sanfilippo氏b综合征、maroteaux-lamy综合征、niemann-pick病a型、胱氨酸病、hurler-scheie综合征(mps-i h/s)、sly综合征(mps vii)、scheie病(mps-i s)、婴儿batten病、gm1神经节苷脂贮积病、粘多糖症ii7iii型或sandhoff病。也考虑了具有这些疾病中的一种或多种的共患病的患者。与所述lsd相关的症状的发作可以延迟5-10、10-25、25-50或50-100天。症状可以选自本体感受反应(proionceptive response)、眼球震颤、威胁(menace)、瞳孔光反射、小脑共济失调、意向震颤或前述任一项的组合。症状可以是视力丧失/失明。
16.aav颗粒可以选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav 12、aav-rh74、aav-rh10和aav-2i8颗粒或其功能片段。所述itr中的一个或多个可以选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav 12、aav-rh74、aav-rh10和aav-2i8 itr。衣壳序列或片段可以包含与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3序列或其功
能片段具有90％或更多同一性的vp1、vp2和/或vp3衣壳序列或其功能片段。衣壳序列或片段可以包含选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh1o、rh74或aav-2i8 aav血清型中的任一项的vp1、vp2或vp3衣壳序列。
17.本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例当指示本发明的特定实施方案时，仅通过说明的方式来给出，因为从该详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
18.本文通常使用描述多个实施方案和方面的肯定性语言来公开本发明。本发明还具体包括其中特定主题，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序被全部或部分排除的实施方案。例如，在本发明的某些实施例或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明在本文中一般不表达本发明不包括的方面，但本发明中未明确排除的方面仍然在本文中公开。
19.本文描述了本发明的实施方案。在阅读前述描述后，那些实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。发明人期望技术人员适当地采用这种变化，并且发明人旨在以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。
20.除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实施例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释为表示对本发明的实施必不可少的任何非要求保护的要素。
21.除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实施或测试中使用与本文所述的类似或等同的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
附图说明
22.以下附图构成本说明书的一部分并被包括在内，以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文所示的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
23.图1a-f.视网膜下注射aav-tpp1后非人类灵长类动物眼睛中的tpp1水平。(图1a-b)不同aav-tpp1剂量后实验终点(注射后8周)处视网膜中的tpp1水平。溶媒(空心条)，7.5e11、2.5e11、8.3e10、8.3e9、5.0e9总vg的剂量。图1a为注射后8周；图1b为注射后22周。每种样品中的tpp1水平使用特定视网膜色素上皮标志物rpe65作为标准化物，用视网膜组织的量标准化。为每个提供了线性标度和对数标度二者。(图1c-d)aav-tpp1注射后房水中的tpp1水平随时间的变化。aav-ttp1注射后4到7周，房水中增加的tpp1浓度达到平稳表达。(图1c)7.5e11、2.5e11、8.3e10总vg的剂量。(图1d)8.3e9、5.0e9总vg的剂量。为每个提供了线性标度和对数标度二者。(图1e)在该早期时间点(处理后22周)，tpp1水平相对于视神经中的内源性表达没有改变。注射溶媒(空心条)、5.0e9和8.3e9总vg组(黑色条)。将tpp1水平相对于gapdh标准化。(图1f)用重组tpp1和来自对照或注射的动物的血清孵育tpp1缺陷细胞后tpp1活性的百分比。可以在来自产生针对重组tpp1的中和抗体的动物的样品中量化降低的tpp1活性。(图1a、b、e、f)注射(黑色条)和未注射的眼睛(空心条)。
24.图2.tpp1的蛋白序列(seq id no：1)和dna序列(seq id no：2)。
具体实施方式
25.如上所讨论，中枢神经系统疾病，例如脑部遗传性基因疾病的治疗，仍然是一个棘手的问题。这些障碍中缺乏的蛋白质当静脉内递送时无法穿过血脑屏障，或者当直接递送到大脑时，无法广泛分布。神经元蜡样质脂褐素沉积病(ncls)是一组儿童神经退行性疾病，也称为batten病。cln2病是一种遗传性常染色体隐性障碍，是ncl的一种更常见的形式。tpp1基因中的突变导致可溶性溶酶体酶三肽基肽酶1(tpp1)的缺乏，导致脑和眼细胞中的溶酶体废物积聚，从而导致cln2疾病的发展，其特征在于癫痫症、发育延迟和进行性失明。酶替代疗法旨在恢复tpp1酶活性并减轻cln2疾病的症状，提高了患有疾病的儿童的生活质量。推测该治疗也将延长这些儿童的寿命。然而，每两周通过奥马耶贮器(omaya reservoir)输注进入小脑侧脑室递送到大脑的重组蛋白不能纠正进行性视力丧失。
26.本发明人确定了视网膜下递送aav2-tpp1是否可以恢复这些患者的眼睛中的tpp1酶活性和防止随后的视力丧失。他们开发了视网膜下给予基因治疗载体以纠正眼睛中内源性tpp1活性的缺乏的新方法，所述基因治疗载体是包含aav衣壳蛋白和包含编码插入一对aav反向末端重复序列之间的tpp1基因的核酸的载体的raav颗粒。在生物分布和剂量nhp研究中，发明人成功地证明了视网膜下注射该测试颗粒aav2-tpp1表达出人tpp1蛋白，并在8周研究持续期间维持溶酶体tpp1酶活性。内源性表达的tpp1被合成为无催化活性的酶，进入溶酶体的酸性环境中后自动催化加工成为成熟的活性酶。由于一些tpp1被分泌并被非转导细胞摄取的事实，表达的tpp1纠正转导细胞和相邻细胞。因为tpp1可以被分泌并用于交叉纠正视网膜的非转导细胞，因此这种基因治疗方法提供了一种用于在一次性递送到视网膜下空间后治疗视网膜的整个厚度的方法。本发明的这些和其他方面将在下面更详细地阐述。
27.i.溶酶体贮积病
28.本文提供了用于向疑似患有或患有溶酶体贮积病(lsd)的需要本文所述方法的哺乳动物给药的方法和用途。在某些实施方案中，本文所述的方法或用途用于治疗、预防、抑制、降低、减少或延迟lsd的一种或多种症状的数量、严重程度、频率、进展或发作。
29.lsd的非限制性实例包括婴儿脂褐素沉积病或晚发性婴儿神经元蜡样质脂褐素沉积病(lincl)、gaucher病、青少年batten病、法布里病、mld、sanfilippo氏a综合征、晚发性婴儿batten病、hunter病、krabbe病、morquio病、pompe病、niemann-pick病c型、tay-sachs病、hurler病(mps-i h)、sanfilippo氏b综合征、maroteaux-lamy综合征、niemann-pick病a型、胱氨酸病、hurler-scheie综合征(mps-i h/s)、sly综合征(mps vii)、scheie病(mps-i s)、婴儿batten病、gml神经节苷脂贮积病、粘多糖症ii7iii型或sandhoff病。
30.lsd通常由编码三肽基肽酶-1(tpp1)酶的基因中的基因异常(例如，突变、缺失、插入)引起，从而导致功能性tpp1酶活性的缺乏。在人类中，tpp1由cln2基因编码，cln2基因有时称为tpp1基因。例如，晚发性婴儿神经元蜡样质脂褐素沉积病(lincl)是一种儿童神经退行性疾病，最常见的原因是由于cln2中的突变引起的tpp1活性的缺乏。发育在最多2-4岁是正常的，之后lincl的临床表现呈现为运动和智力衰退、癫痫症和视觉缺陷。死亡通常发生在生命的前十年内。大多数lincl病例是由于cln2中的突变，其诱导可溶性溶酶体酶三肽基
肽酶-1(tpp1)的缺乏。tpp1被合成为甘露糖-6-磷酸酶原，并且所述酶原类似于其他可溶性溶酶体水解酶，主要靶向溶酶体，但也可以通过分泌途径从细胞释放。因此，可以发生相同或相邻细胞的细胞摄取，以及随后的溶酶体递送和将酶原激活为活性形式。
31.在某些实施方案中，本文提供了通过将引导具有tpp1活性的多肽表达的aav颗粒(在本文称为aav-tpp1颗粒)直接给药到中枢神经系统的组织或体液中，治疗患有或者疑似患有lsd的哺乳动物的方法。本文公开了显示将aav递送/给药到溶酶体贮积症的动物模型中的脑和/或脊髓的数据。
32.可以通过本文所述的方法或用途治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人类灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、奶牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，哺乳动物是非啮齿类哺乳动物(例如，人、猪、山羊、绵羊、马、狗等)。在某些实施方案中，非啮齿类哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或胎内哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性的。在某些实施方案中，哺乳动物可以是动物疾病模型，例如，用于研究lsd，例如lincl的动物模型。
33.本文所述的方法或组合物治疗的受试者包括成人(18岁或以上)和儿童(不到18岁)。儿童的年龄范围在1-2岁，或2-4、4-6、6-18、8-10、10-12、12-15和15-18岁。儿童还包括婴儿。婴儿通常为1-12个月的月龄。
34.ii.aav载体
35.腺相关病毒(aav)是细小病毒科的小型非病原性病毒。迄今为止，已经确定了许多血清学不同的aav，并且从人或灵长类动物中分离出许多个。aav因其复制依赖于辅助病毒而与该科的其他成员不同。
36.已显示aav基因组稳定地整合到宿主细胞基因组中；具有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂和非分裂细胞并保持高水平的转导基因的表达。aav病毒颗粒是热稳定的，耐溶剂、洗涤剂、ph变化、温度，并且可以在cscl梯度上浓缩或通过其他方法浓缩。aav基因组包括正义或反义的单链脱氧核糖核酸(ssdna)。在没有辅助病毒的情况下，aav可以以位点特异性的方式例如整合到染色体19的q臂。aav的大约5kb的基因组由一段正极性或负极性的单链dna组成。基因组的末端是短反向末端重复序列，其可以折叠成发夹结构并用作病毒dna复制的起源。
37.aav“基因组”是指最终被包装或封装以形成aav颗粒的重组核酸序列。aav颗粒通常包含aav基因组。在重组质粒用于构建或制备重组载体的的情况下，载体基因组不包括“质粒”的不对应于重组质粒的载体基因组序列的部分。重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，这对于繁殖和重组病毒产生所需的过程
‑‑
质粒的克隆和扩增是重要的，但本身并不包装或封装成病毒(例如，aav)颗粒。因此，载体“基因组”是指通过病毒(例如，aav)包装或封装的核酸。
38.aav病毒粒子(颗粒)是无包膜的直径约25nm的二十面体颗粒。aav颗粒包含由三种相关衣壳蛋白vp1、vp2和vp3组成的二十面体对称衣壳，其一起相互作用以形成衣壳。右侧orf通常编码衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。这些蛋白质通常分别以1∶1∶10的比例存在，但可以是不同的比率，并且都源自右侧orf。通过使用选择性剪接和不寻常的起始密码子，衣壳蛋白
彼此不同。缺失分析表明，由选择性剪接信息翻译的vp1的去除或改变导致感染性颗粒的产量降低。vp3编码区域内的突变导致未能产生任何单链子代dna或感染性颗粒。aav颗粒是一种包含aav衣壳或片段的病毒颗粒。在某些实施方案中，aav颗粒的基因组编码一种、两种或所有vp1、vp2和vp3多肽。
39.大多数天然aav的基因组通常包含两个开放阅读框(orf)，有时称为左侧orf和右侧orf。左侧orf通常编码非结构rep蛋白rep 40、rep 52、rep 68和rep 78，其除了产生单链子代基因组之外还参与复制和转录的调节。rep蛋白中的两种已经与aav基因组优先整合到人19号染色体的q臂的区域相关联。rep68/78已显示具有ntp结合活性以及dna和rna解旋酶活性。一些rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。在某些实施方案中，aav(例如，raav)的基因组编码一些或全部rep蛋白。在某些实施方案中，aav(例如，raav)的基因组不编码rep蛋白。在某些实施方案中，rep蛋白中的一种或多种可以反式递送，因此不包括在包含编码多肽的核酸的aav颗粒中。
40.aav基因组的末端包含短反向末端重复序列(itr)，其具有折叠成充当病毒dna复制的起点的t形发夹结构的潜力。因此，aav的基因组包含一个或多个(例如，一对)itr序列，其位于其单链病毒dna基因组的侧翼。每个itr序列通常包含约145个碱基。在itr区域内，已经描述了被认为是对itr功能很重要的两个元件，gagc重复基序和末端解离位点(trs)。已显示当itr为线性或发夹构象时，重复基序结合rep。该结合被认为是在trs定位rep68/78以进行切割，其以位点和链特异性方式发生。除了它们在复制中的作用外，这两个元件似乎对病毒整合很重要。包含在19号染色体内的整合位点是具有相邻trs的rep结合位点。这些元件已显示对于位点特异性整合是功能性的和必需的。
41.在某些实施方案中，aav颗粒(例如，raav)包含两个itr。在某些实施方案中，aav(例如，raav)包含一对itr。在某些实施方案中，aav颗粒(例如，raav)包含一对itr，其位于至少编码具有tpp1酶活性的多肽的多核苷酸的侧翼(即，位于每个5
′
和3
′
端)。
42.病毒载体源自或基于包含病毒基因组的一种或多种核酸元件。特定病毒载体包括腺相关病毒(aav)载体。还提供了包含编码tpp1多肽、变体或子序列(例如，具有tpp1酶活性的多肽片段)的核酸序列的载体(例如，aav)。
43.术语“重组”作为载体，例如重组病毒，例如，慢病毒或细小病毒(例如，aav)载体的修饰语，以及序列，例如重组多核苷酸和多肽的修饰语，是指组合物以通常不会在自然界发生的方式被操纵(即，工程化)。重组载体的一个特定实例，例如aav载体是通常不存在于野生型病毒(例如，aav)基因组中的多核苷酸插入到病毒基因组内的情况。重组多核苷酸的一个实例是其中编码tpp1多肽的核酸(例如，基因)克隆到载体中的情况，所述载体包含或不含基因在病毒(例如，aav)基因组内相关的5
′
、3
′
和/或内含子区域。虽然本文提到的载体例如病毒和aav载体以及诸如多核苷酸的序列并不总是使用术语“重组”，但尽管有任何这样的遗漏，重组形式，包括多核苷酸，也明确被包括在内。
44.重组病毒“载体”或“aav载体”源自病毒的野生型基因组，例如avv，其通过使用分子方法从病毒(例如，aav)中去除野生型基因组，以及用例如tpp1编码核酸序列的非天然核酸替换以添加例如tpp1编码核酸序列的非天然核酸，或其组合。通常，对于aav，aav基因组的一个或两个反向末端重复序列(itr)被保留在aav载体中。“重组”病毒载体(例如，raav)不同于病毒(例如，aav)基因组，因为病毒基因组的全部或部分已被相对于例如tpp1编码核
酸序列的病毒(例如，aav)基因组核酸的非天然序列替代，以及已经添加诸如tpp1编码核酸序列的非天然核酸，或其组合。因此，非天然序列的掺入将病毒载体(例如，aav)定义为“重组”载体，其在aav的情况下可以被称为“raav载体”。
45.aav载体(例如，raav载体)可以被包装并且在本文中称为“aav颗粒”，用于后续的细胞、离体、体外或体内感染(转导)。其中将重组aav载体封装或包装到aav颗粒中，该颗粒也可以称为“raav颗粒”。在某些实施方案中，aav颗粒是raav颗粒。raav颗粒通常包含aav载体或其部分。raav颗粒可以是一个或多个aav颗粒(例如，多个aav颗粒)。raav颗粒通常包含封装或包装raav载体基因组的蛋白(例如，衣壳蛋白)。
46.任何合适的aav颗粒(例如，raav颗粒)可用于本文的方法或用途。raav颗粒和/或其中包含的基因组可以源自任何合适的aav血清型或菌株。raav颗粒和/或其中包含的基因组可以源自两种或更多种aav血清型或菌株。因此，raav可以包含aav的任何血清型或菌株的蛋白和/或核酸或其部分，其中aav颗粒适用于哺乳动物细胞的感染和/或转导。aav血清型的非限制性实例包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav 12、aav-rh 74、aav-rhlo或aav-2i8。在某些实施方案中，多个raav颗粒包含相同的菌株或血清型(或亚组或变体)的颗粒或源自相同的菌株或血清型(或亚组或变体)。在某些实施方案中，多个raav颗粒包含两种或更多种不同的raav颗粒(例如，不同血清型和/或菌株)的混合物。
47.如本文所用，术语“血清型”是用于指aav具有在血清学上与其他aav血清型不同的衣壳的区别。基于一种aav与另一种aav相比缺乏抗体之间的交叉反应性确定血清学特异性。这样的交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列的差异)。尽管包括衣壳变体的aav变体可能不会与参考aav或其他aav血清型在血清学上不同，但与参考或其他aav血清型相比，它们至少一个核苷酸或氨基酸残基不同。
48.在某些实施方案中，raav颗粒不包括某些血清型。在一个实施方案中，raav颗粒不是aav4颗粒。在某些实施方案中，raav颗粒在抗原或免疫上不同于aav4。可以通过标准方法确定特异性。例如，elisa和western印迹可用于确定病毒颗粒是否在抗原或免疫上不同于aav4。此外，在某些实施方案中，raav2颗粒保留与aav4不同的组织趋向特异性。
49.在某些实施方案中，基于第一血清型基因组的raav载体与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种的血清型相同。在某些实施方案中，raav载体基因组可以基于与包装载体的aav衣壳蛋白中的一种或多种的血清型不同的aav(例如，aav2)血清型基因组。例如，raav载体基因组可以包含源自aav2的核酸(例如itr)，而三种衣壳蛋白中的至少一种或多种源自不同的血清型，例如aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rhlo、rh74或aav-2i8血清型或其变体。
50.包含引导多肽表达的多核苷酸的重组aav载体可以使用本领域已知的合适的重组技术产生(例如，参见sambrook等，1989)。重组aav载体通常被包装到有转导能力的aav颗粒中，并使用aav病毒包装系统繁殖。有转导能力的aav颗粒能够结合并进入哺乳动物细胞并随后将核酸货物(例如，异源基因)递送到细胞的细胞核。因此，有转导能力的完整aav颗粒被配置成转导哺乳动物细胞。被配置成转导哺乳动物细胞的aav颗粒通常没有复制能力，并且需要额外的蛋白质机制来自我复制。因此，被配置成转导哺乳动物细胞的aav颗粒被改造
成结合和进入哺乳动物细胞并向细胞递送核酸，其中用于递送的核酸通常定位在aav基因组中的一对aav itr之间。
51.用于产生具有转导能力的aav颗粒的合适的宿主细胞包括但不限于可以或已经用作异源raav载体的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以使用来自稳定的人细胞系293的细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心容易地获得，登记号为atcc cr11573)。在某些实施方案中，用腺病毒5型dna片段转导并表达腺病毒ela和elb基因的改性人胚肾细胞系(例如hek293)用于产生重组aav颗粒。改性的hek293细胞系被容易地转染并提供了一个特别便利的在其中产生raav颗粒的平台。产生能够转导哺乳动物细胞的高滴度aav颗粒的方法是本领域已知的。例如，aav颗粒可以如wright，2008和wright，2009中所述制备。
52.在某些实施方案中，在转染aav表达载体之前或同时，通过用aav辅助构建体转染宿主细胞，将aav辅助功能引入宿主细胞中。因此，aav辅助构建体有时用于提供aav rep和/或cap基因的至少瞬态表达，以补充有效的aav转导所需的aav功能的缺失。aav辅助构建体通常缺少aav itr，并且既不能复制也不能自包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多aav辅助构建体，例如常用的质粒paav/ad和pim29 45，其编码rep和cap表达产物二者。已知许多编码rep和/或cap表达产物的其他载体。
53.在某些实施方案中，与参考血清型有关的aav颗粒或其载体基因组具有多核苷酸、多肽或其子序列，其包含与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav 12、rh 10、rh74或aav-2i8颗粒的多核苷酸、多肽或子序列具有至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)同一性的序列或由其组成。在特定实施方案中，与参考血清型有关的aav颗粒或其载体基因组具有衣壳或itr序列，其包含与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh10、rh74或aav-2i8血清型的衣壳或itr序列具有至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)同一性的序列或由其组成。
54.在某些实施方案中，本文的方法包括aav2颗粒的用途。在特定方面，aav2颗粒是重组aav2颗粒。在某些实施方案中，raav2颗粒包含aav2衣壳。在某些实施方案中，raav2颗粒包含与相应的天然或野生型aav2颗粒的衣壳蛋白具有至少60％、65％、70％、75％或更多，例如，80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最高达100％同一性的一种或多种衣壳蛋白(例如，vp1、vp2和/或vp3)。在某些实施方案中，raav2颗粒包含与相应的天然或野生型aav2颗粒的衣壳蛋白具有至少75％或更多，例如，80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最高达100％的同一性的vp1、vp2和vp3衣壳蛋白。在某些实施方案中，raav2颗粒是天然或野生型aav2颗粒的变体。在一些方面，与天然或野生型aav2颗粒的(多种)衣壳蛋白相比，aav2变体的一种或多种衣壳蛋白具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸置换。
55.在某些实施方案中，raav2颗粒(例如，aav2颗粒的衣壳)包含与野生型aav2 vp1衣
壳具有至少60％，至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性，或甚至100％同一性的vpl多肽。在某些实施方案中，aav2颗粒包含vp1多肽，其与具有aav2 vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的多肽具有约63％或更多同一性(例如，63％同一性)。aav2衣壳序列和aav4衣壳序列具有约60％同一性。在某些实施方案中，aav2 vp1衣壳蛋白具有与野生型aav2 vp1衣壳具有至少65％同一性的序列。在某些实施方案中，aav2 vp1衣壳蛋白包含野生型aav2 vp1衣壳。
56.在某些实施方案中，raav颗粒包含与相应的天然或野生型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8的itr具有至少75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最高达100％的同一性的一个或两个itr(例如，一对itr)，只要它们保留一种或多种期望的itr功能(例如，如果需要，能够形成允许dna复制的发夹；将aav dna整合到宿主细胞基因组中；和/或包装)。
57.在某些实施方案中，raav2颗粒包含与相应的天然或野生型aav2颗粒的itr具有至少75％或更多，例如，80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最高达100％的同一性的一个或两个itr(例如，一对itr)，只要它们保留一种或多种期望的itr功能(例如，如果需要，能够形成允许dna复制的发夹；将aav dna整合到宿主细胞基因组中；和/或包装)。
58.raav颗粒可以包含具有任何合适数量的“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，aav2颗粒的itr包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个“gagc”重复序列。在某些实施方案中，raav2颗粒包含含有三个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒包含具有少于四个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒包含具有多于四个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒的itr包含rep结合位点，其中前两个“gagc”重复序列中的第四个核苷酸是c而不是t。
59.任何合适长度的dna都可以掺入aav颗粒中。用于raav载体的合适的dna分子可为约5干碱基(kb)、小于约5kb、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb或小于约2.5kb。
[0060]“转基因”在本文中用于便利地指旨在或已经被引入细胞或生物体中的核酸。转基因包括任何核酸，例如编码多肽或蛋白质(例如，tpp1)的基因，并且通常相对于天然存在的aav基因组序列是异源的。
[0061]
在具有转基因的细胞中，通常借助例如raav颗粒的载体引入/转移转基因。通过raav颗粒将转基因引入细胞中通常称为细胞的“转导”。术语“转导”是指借助载体(例如，aav颗粒)将诸如核酸的分子引入细胞或宿主生物体中。转基因可以或可以不整合到转导细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸变得整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组dna)中，它可以稳定地维持在该细胞或生物体中，并进一步传递给受体细胞或生物体的子代细胞或生物体或由其遗传。最后，引入的核酸可以存在于受体细胞或宿主生物体中的染色体外，或仅短暂存在。“转导细胞”是已通过转导的方式将转基因引入其中的细胞。因此，“转导的”细胞是已将核酸引入其中或其子代中的细胞。可以繁殖转导的细胞并表达引入的蛋白质或转录核酸。对于基因治疗用途和方法，转导的细胞可以在哺乳动物中。
[0062]
核酸可以包括一个或多个与开放阅读框可操作地连接的表达控制或调控元件，其中一个或多个调控元件被配置成引导由哺乳动物细胞中的开放阅读框编码的多肽的转录和翻译。表达控制/调控元件的非限制性实例包括转录起始序列(例如，启动子、增强子、tata盒等)、翻译起始序列、mrna稳定性序列、聚a序列、分泌序列等。表达控制/调控元件可以从任何合适的生物体的基因组获得。非限制性实例包括sv40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子；腺病毒主要晚期启动子(ad mlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子如cmv立即早期启动子区(cmvie)、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、pol ii启动子、pol iii启动子、合成启动子、杂交启动子等。此外，源自非病毒基因的序列，例如鼠金属硫蛋白基因，也可用于本文。
[0063]
示例性的组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(pgk)、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、肌动蛋白启动子和本领域技术人员已知的其他组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中起组成型功能。这些包括：sv40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复序列(ltr)；和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子等。因此，任何上述组成型启动子都可用于控制异源基因插入物的转录。
[0064]
在诱导剂存在下，受诱导型启动子控制的基因仅表达或在更大程度上表达(例如，在某些金属离子存在下，受金属硫蛋白启动子控制的转录大大增加)。诱导型启动子包括响应元件(re)，当它们的诱导因子结合时会刺激转录。例如，有血清因子、类固醇激素、视黄酸和环amp的re。可以选择含有特定re的启动子以获得诱导性反应，并且在一些情况下，re本身可以连接到不同的启动子，从而赋予重组基因的可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型对诱导型；强对弱)，可以控制基因修饰细胞中多肽的存在和表达水平。如果编码多肽的基因受诱导型启动子的控制，则通过使经基因修饰的细胞原位暴露于允许多肽转录的条件，例如通过腹膜内注射控制试剂转录的诱导型启动子的特异性诱导剂，引发多肽的原位递送。例如，通过将基因修饰的细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触来增强基因修饰的细胞原位表达受金属硫蛋白启动子控制的基因编码的多肽。
[0065]
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，它被“可操作地连接”。编码多肽的核酸或引导tpp1多肽(例如，具有tpp1活性的多肽)表达的核酸可包括诱导型启动子，或用于控制编码的多肽转录的组织特异性启动子。
[0066]
在某些实施方案中，表达控制元件包含cmv增强子。在某些实施方案中，表达控制元件包含β-肌动蛋白启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含鸡β-肌动蛋白启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含cmv增强子和鸡β-肌动蛋白启动子。
[0067]
iii.tpp1
[0068]
tpp1是由cln2基因(tpp1基因)编码的溶酶体丝氨酸蛋白酶。人tpp1的代表性氨基酸序列示于图2，人tpp1的代表性核酸序列示于图2。人tpp1包含三肽基肽酶i活性(tpp1酶活性)。tpp1活性包含非特异性溶酶体肽酶活性，其由溶酶体蛋白酶产生的分解产物生成三肽。底物特异性研究表明tpp1主要从肽和蛋白质中未取代的氨基末端切割三肽。内源性表达的tpp1被合成为无催化活性的酶。靶向溶酶体后，由于酸性环境，tpp1被自催化加工成为成熟的活性酶。可以使用已知方法在体外测量和/或定量tpp1的活性。例如，参见junaid等
人(1999)。
[0069]
在某些实施方案中，raav颗粒包含aav衣壳蛋白和编码包含tpp1活性的多肽的核酸。在某些实施方案中，raav颗粒包含aav衣壳蛋白和引导包含tpp1活性的多肽的表达和/或分泌的核酸。
[0070]
如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变体是指背离参考序列的核酸、多肽或其子序列。因此，修饰的序列和变体序列可以具有与参考序列基本相同、更高或更低的表达、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。一种特定类型的变体是tpp1置换突变体，它是指与野生型tpp1相比，由具有置换残基的基因编码的蛋白质。
[0071]
多肽中的氨基酸变化可以通过改变相应核酸序列的密码子来实现。这样的多肽可基于将多肽结构中的某些氨基酸置换为其他氨基酸以修饰或提高生物活性而获得。例如，通过供选择的氨基酸的置换，可以使多肽产生小的构象变化，导致活性增加。供选择地，某些多肽中的氨基酸置换可用于提供残基，然后该残基可与其他分子连接以提供肽-分子缀合物，其保留起始多肽的足够特性以用于其他用途。
[0072]
包含tpp1活性的多肽是指哺乳动物的tpp1蛋白或其部分，其表现出至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％的使用合适的肽底物分析的，例如，如通过junaid等人，1999的方法或另一种相当的方法分析的人tpp 1肽酶活性。在某些实施方案中，包含tpp1活性的多肽是指哺乳动物的tpp1蛋白或其子序列或变体，其显示至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％的人tpp1的肽酶活性。
[0073]
包含tpp1活性的多肽可以包含保留至少部分tpp1活性的tpp1多肽的截短、突变、嵌合或修饰形式。包含tpp1活性的多肽可以包含获得自任何合适的生物体(例如，获得自哺乳动物，获得自人，获得自非人哺乳动物，例如获得自狗、猪、牛等)的tpp1蛋白或其部分。在某些实施方案中，包含tpp1活性的多肽与人tpp1蛋白具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％或100％同一性。
[0074]
氨基酸修饰的一个实例是保守的氨基酸置换或缺失。在特定实施方案中，修饰或变体序列(例如，tpp1)保留未修饰序列(例如，野生型tpp1)的功能或活性的至少一部分。
[0075]
可以使用氨基酸的亲水指数来赋予多肽相互作用的生物学功能，其中发现某些氨基酸可以被置换为具有相似亲水指数的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。供选择地，可以在亲水性的基础上进行类似氨基酸的置换，特别是在要生成的多肽中期望的生物学功能预期用于免疫学实施方案的情况下。由“蛋白质”的相邻氨基酸的亲水性控制的“蛋白质”的最大局部平均亲水性与其免疫原性相关。因此，注意到可以基于分配给每个氨基酸的亲水性进行置换。
[0076]
在使用为每个氨基酸分配值的亲水性指数或亲水指数时，进行氨基酸的置换，其中这些值为 2，其中 1是典型的， 0.5内的值是最典型的置换。
[0077]
类似地，“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已被基因改变的修饰的核酸序列。可以在不改变编码的蛋白质序列的情况下对序列进行基因修饰。供选择地，该序列可以被基因修饰以编码变体蛋白质，例如变体tpp1蛋白质。核酸或多核苷酸变体也可指组合序列，其已被密码子修饰以编码仍保留与参考序列(例如野生型蛋白质序列)具有至少部分
序列同一性的蛋白质，并且也已被密码子修饰以编码变体蛋白。例如，这样的核酸变体的一些密码子将被改变而不改变由其编码的tpp1蛋白的氨基酸，并且核酸变体的一些密码子将被改变，这反过来又改变了由其编码的tpp1蛋白的氨基酸。
[0078]
修饰的非限制性实例包括一个或多个核苷酸置换或添加(例如，约1至约3、约3至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约100、约100至约150、约150至约200、约200至约250、约250至约500、约500至约750、约750至约1000个或更多个核苷酸)。核酸修饰的一个非限制性实例是密码子优化。
[0079]“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。
[0080]
大多数生物体中的脱氧核糖核酸(dna)是遗传物质，而核糖核酸(rna)参与将dna中包含的信息转移到蛋白质中。本发明还包括所公开的核苷酸序列的片段和变体或由其编码的蛋白质或部分长度的蛋白质。“片段”或“部分”是指编码多肽或蛋白质的核苷酸序列或多肽或蛋白质的氨基酸序列的全长或小于全长。在某些实施方案中，片段或部分具有生物学功能(即，保留野生型tpp1的酶活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。
[0081]
tpp1分子的“变体”是与天然分子的序列基本相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码与天然蛋白质相同的氨基酸序列的那些序列。可以使用分子生物学技术，例如聚合酶链反应(pcr)和杂交技术来确定诸如这些的天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变产生的那些序列，其编码天然蛋白质，以及那些编码具有氨基酸置换的多肽的序列。通常，本发明的核苷酸序列变体将与天然(内源)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，通常至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％的序列同一性。在某些实施方案中，变体具有生物学功能(即保留野生型tpp1的酶活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。
[0082]
特定核酸序列的“保守修饰变异”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列。
[0083]
由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子cgt、cgc、cga、cgg、aga和agg都编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子指定精氨酸的每个位置处，密码子可以改变为所描述的相应密码子中的任一种而不改变所编码的蛋白质。这种核酸变异是“沉默变异”，是“保守修饰变异”的一种。除非另有说明，本文描述的编码多肽的每种核酸序列还描述了每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(atg除外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可以通过标准技术进行修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”隐含在每个所述的序列中。
[0084]
术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指多核苷酸包含与使用以标准参数描述的比对程序之一的参考序列相比具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以
适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应的同一性。用于这些用途的氨基酸序列的基本同一性通常是指至少70％、至少80％、90％或甚至至少95％的序列同一性。
[0085]
多肽上下文中的术语“基本同一性”表明tpp1多肽包含具有与参考序列在指定的比较窗口内具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％，或79％，或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％，或89％或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。两个多肽序列基本相同的指示是一种多肽与针对第二种多肽产生的抗体具有免疫学反应性。因此，tpp1多肽与第二种tpp1多肽基本上相同，例如，其中两种肽仅通过保守置换而不同。
[0086]
iv.联合疗法
[0087]
在某些实施方案中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送aav-tpp1颗粒和任选地向哺乳动物给予一种或多种免疫抑制剂。在某些实施方案中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送aav-tpp1颗粒并且任选地向哺乳动物施用2、3、4种或更多种免疫抑制剂。在某些实施方案中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送aav-tpp1颗粒和任选地向哺乳动物给予两种免疫抑制剂。在一个代表性实施方案中，治疗哺乳动物的方法或用途包括向哺乳动物给予或递送aav-tpp1颗粒和向哺乳动物给予第一和第二免疫抑制剂。
[0088]
在给予两种或更多种免疫抑制剂的情况下，每种免疫抑制剂可以是有区别的和/或不同的(例如，每种药剂的结构和/或作用机制不同)。在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是麦考酚酯或其衍生物。这种麦考酚酯衍生物的一个实例是吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil，mmf)。在某些实施方案中，免疫抑制剂是环孢菌素或其衍生物。在某些实施方案中，第一免疫抑制剂包含环孢菌素，第二免疫抑制剂包含麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)。在某些实施方案中，第一免疫抑制剂包含环孢菌素并且第二免疫抑制剂包括mmf。
[0089]
在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒之前、期间和/或之后，给予免疫抑制剂。在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒的同时给予免疫抑制剂。在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒之后给予免疫抑制剂。
[0090]
在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒前至少约1天至约7天，或约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，向哺乳动物给予第一免疫抑制剂，并且在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒前约1天至约7天，约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒期间，和/或在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒之后约10天、约20天、约30天、约40天、约50天、约100天、约200天、约300天、约350天、约400天或约500天内，给予第二免疫抑制剂。在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒前至少约1天至约7天，或约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，向哺乳动物给予环孢菌素，并且在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒前约1天至约7天，约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒期间，和/或在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒期间之后约10天、约20天、约30天、约40天、约50天、约100天、约200天、约300天、约350天、约400天或约500天内，给予麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)。在某些实施方案中，在给予aav-tpp1颗粒前约1天至约7天，或约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，并且在治疗后以规律的间隔给予环孢菌素，并且在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒前约1天至约7天，约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，在向哺乳动物给予
aav-tpp1颗粒期间和/或在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒之后约10天至约40天内，给予一次麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)。
[0091]
可以以任何合适的剂量给予免疫抑制剂。在某些实施方案中，以约1至约50mg/kg、约1至约20mg/kg或约5至约10mg/kg的剂量，以一天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率给予环孢菌素。在某些实施方案中，以约10mg/kg每天两次给予环孢菌素。在某些实施方案中，在至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月或约5个月的期间内，以约10mg/kg每天两次给予环孢菌素。在某些实施方案中，在向哺乳动物给予或使用aav-tpp1颗粒约1至约2个月后，环孢菌素的剂量逐渐减少至小于约5mg/kg或小于约2mg/kg的剂量。
[0092]
在某些实施方案中，以约1至约100mg/kg，约1至约50mg/kg，约1至约25mg/kg，或约5至约20mg/kg的剂量，以每天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率给予麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)。在某些实施方案中，每天一次以约10至约20mg/kg给予麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)。在某些实施方案中，在向哺乳动物给予aav-tpp1颗粒约1至约2个月后，将麦考酚酯或其衍生物(例如，mmf)的剂量降低至小于约5mg/kg或小于约2mg/kg的剂量。
[0093]
v.药物制剂、剂量和给药途径
[0094]
可以将raav颗粒配制成适合视网膜下给药的任何合适的制剂，例如重新配制以使用的液体制剂或冻干制剂。各种药学上可接受的制剂是可商购的并且可由执业医师获得。
[0095]
示例性视网膜下给药程序如下。受试者背卧。将丙美卡因局部施用到眼睛，用1∶50稀释的必妥碘溶液/盐水冲洗结膜穹窿，并用未稀释的5％必妥碘溶液擦拭眼睑边缘。使用steven腱切断术剪刀进行外眦切开术。使用卡尺在上颞部和下颞部巩膜缘后3.0毫米处标记点。双极电灼术用于烧灼标记点下的巩膜，然后局部施用未稀释的5％必妥碘溶液。使用巩膜固定钳固定眼球位置，同时将带有25号带阀套管的微玻璃体视网膜刀片在每个标记点插入，穿过结膜和巩膜，并推进到玻璃体液中。套管针朝向眼球后轴定位，然后缩回以将巩膜端口留在原位。作为任选步骤，将31号针切向穿过角膜缘插入右眼前房以收集房水样本(约80μl)。样品在收集后立即置于干冰上。
[0096]
直接接触式手术透镜被放置在具有无菌耦合凝胶的角膜上，并且将内照明器探针通过巩膜端口之一插入以易于通过显微镜直接观察眼后段。视网膜下注射套管通过第二端口插入并推进到中部玻璃体中。推进小直径注射套管，直到它接触到视网膜表面并沿着下血管弓放置。该组合物被缓慢递送以诱发视网膜下气泡。如果观察到适当的气泡形成，则继续注射以将整个剂量体积递送到视网膜下空间。如果未观察到气泡形成，则重新定位小直径注射套管，并根据外科医生的偏好在相同位置或供选择的位置再次尝试注射。一旦递送全部注射剂量，从巩膜端口移除注射套管和内照明器探针，并从角膜移除接触透镜。去除巩膜端口并使用7-0vicryl缝合线关闭外眦切开术部位。庆大霉素和曲安奈德可以通过结膜下注射给予到右眼中。然后对对侧眼重复该程序(给药，庆大霉素/曲安奈德给药和任选地包括房水收集)。
[0097]
免疫抑制剂可以通过任何合适的途径给药，例如视网膜下给药，并相应地配制。在某些实施方案中，口服给予免疫抑制剂。在某些实施方案中，口服给予麦考酚酯或其衍生物，例如吗替麦考酚酯(mmf)。在某些实施方案中，口服给予环孢菌素。免疫抑制剂也可以肠胃外给药(例如，肌肉内、静脉内、皮下)，或通过注射到脑、脊髓或其部分(例如，注射到csf中)给药。
[0098]
可以根据经验确定raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒的有效量。在整个治疗过程中，可以连续或间歇地以一个或多个剂量进行给药。有效给药剂量可由本领域技术人员确定，并可根据aav血清型、病毒滴度和所治疗哺乳动物的体重、状况和物种而变化。可以通过治疗医师选择的剂量水平、目标和时间来进行单次和多次给药。例如，可以根据需要给予多剂量以维持足够的酶活性。
[0099]
在某些实施方案中，给予多个aav-tpp1颗粒。如本文所用，多个aav颗粒是指约1
×
105至约1
×
10
16
个颗粒。
[0100]
在某些实施方案中，以约500μl至约5ml中约1x105至约1x10
16
vg/ml的剂量；以约500μl至约3ml的1
×
105至约1
×
10
16
vg/ml的剂量；或以约500μl至约2ml的1
×
105至约1
×
10
16
vg/ml的剂量给予raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒。在某些实施方案中，以约1
×
108至约1
×
10
16
vg/kg被治疗哺乳动物体重的剂量给予raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒。例如，可以以约1
×
108vg/kg、约5
×
108vg/kg、约1
×
109vg/kg、约5
×
109vg/kg、约1
×
10
10
vg/kg、约5
×
10
10
vg/kg、约1
×
10
11
vg/kg、约5
×
10
11
vg/kg、约1
×
10
12
vg/kg、约5
×
10
12
vg/kg、约1
×
10
13
vg/kg、约5
×
10
13
vg/kg、约1
×
10
14
vg/kg、约5
×
10
14
vg/kg或约1
×
10
15
vg/kg被治疗哺乳动物体重的剂量给予raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒。具体视网膜下的剂量包括7.5
×
10
11
vg/眼、2.5
×
10
11
vg/眼、8.3
×
10
10
vg/眼、8.3
×
109vg/眼和5.0
×
109vg/眼，或每眼1
×
108至1
×
10
12
。
[0101]
适用于注射或输注raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒的药物形式可以包括无菌水溶液或分散体，其适用于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选地封装在脂质体中。在所有情况下，最终形式应该是无菌液体，并且在制备、使用和储存条件下是稳定的。液体载体或溶媒可以是溶剂或液体分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。例如，可以通过脂质体的形成，在分散体的情况下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或盐(例如氯化钠)。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。
[0102]
raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒的溶液或悬浮液可以任选地包含以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、人工csf、不挥发油、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、甘油或其他合成溶剂；抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。
[0103]
raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒，可以作为冻干组合物提供。在某些实施方案中，制剂由液体制剂冻干。在一些方面，液体制剂包含约5mm至约25mm、约5mm至约15mm、约10mm至约20mm或约15mm至约25mm的缓冲剂。在示例性方面，药物组合物包含约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm或约25mm的缓冲剂。药学上可接受的缓冲剂是本领域众所周知的，包括但不限于磷酸盐缓冲液、组氨酸、柠檬酸钠、hepes、tris、二甘氨酸、甘氨酸、n-甘氨酰甘氨酸、乙酸钠、碳酸钠、甘氨酰甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠及其混合物。在某些实施方案中，缓冲剂是组氨酸(例如，l-组氨酸)。
[0104]
包含中等水平(即，约1％至约10％)的一种或多种糖和/或糖醇有助于液体和/或冻干制剂的稳定性。例如，糖和/或糖醇允许在冷冻/解冻循环期间具有更好的特性。因此，在某些实施方案中，本发明提供了包含约2％至约10％的一种或多种糖和/或糖醇的药物组合物。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素。在一个特定的实施方案中，糖是蔗糖、海藻糖或其组合。在某些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。糖醇被定义为具有约4至约8个碳原子和一个羟基的烃。可以用于本文提供的药物组合物中的糖醇的非限制性实例包括甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在某些实施方案中，甘露糖醇被用作糖醇添加剂。在某些实施方案中，药物组合物包含糖和糖醇添加剂。糖和糖醇可以单独使用或组合使用。在一些实施方案中，糖、糖醇或其组合将以约1％至约10％(w/v)、约1％(w/v)至约1.5％(w/v)、约2.5％至约7.5％(w/v)或约1％至约5％(w/v)的浓度存在于制剂中。在示例性方面，本发明的药物组合物包含约1.0％(w/v)、约1.1％(w/v)、约1.2％(w/v)、约1.3％(w/v)、约1.4％(w/v)、约1.5％(w/v)、约1.6％(w/v)、约1.7％(w/v)、约1.8％(w/v)、约1.9％(w/v)、约2.0％(w/v)、约2.5％(w/v)、约3.0％(w/v)、约3.5％(w/v)、约4.0％(w/v)、约4.5％(w/v)、约5.0％(w/v)、约5.5％(w/v)、约6.0％(w/v)、约6.5％(w/v)、约7.0％(w/v)、约7.5％(w/v)、约8.0％(w/v)、约8.5％(w/v)、约9.0％(w/v)、约9.5％(w/v)或约10％(w/v)糖、糖醇或其组合。在某些实施方案中，糖是蔗糖、海藻糖或其组合。在某些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。
[0105]
在示例性实施方案中，本发明的制剂或药物组合物包含额外的药学上可接受的成分。在示例性方面，制剂或药物组合物包含以下任一种或组合：酸化剂、添加剂、吸附剂、气雾剂抛射剂、空气置换剂、碱化剂、抗结剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解促进剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、成膜剂、增味剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、制粒剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘结剂、软膏基质、软膏、油脂性溶媒、有机基质(organic base)、锭剂基质(pastille base)、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、隐蔽剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂(surface active agent)、表面活性剂(surfactants)、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水混溶性助溶剂、水软化剂或润湿剂。
[0106]
冻干组合物可以用水或缓冲液/缓冲剂重新配制以产生适合给予受试者的重构剂量单位。在某些实施方案中，重构剂量单位具有与生理条件相容的ph。在一些情况下，重构剂量单位的ph范围为6至8。在一些情况下，重构剂量单位的ph范围为7至8。例如，重构剂量单位的ph范围可以为7至7.5。
[0107]
raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒，可以与防腐剂一起配制。防腐剂通常可以选自季铵化合物，例如苯扎氯铵、苯佐氯铵等。苯扎氯铵更好地描述为：n-苄基-n-(c
8-c
18
烷基)-n，n-二甲基氯化铵。不同于季铵盐的防腐剂的实例是硫代水杨酸的烷基汞盐，例如硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞；过硼酸钠；亚氯酸钠；对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；醇，例如氯丁醇、苯甲醇或苯乙醇；胍衍生物，例如氯己定或聚六亚甲基双胍；过硼酸钠；germal ii或山梨酸。优选的防腐剂是季铵化合物，特别是苯扎氯铵或其
衍生物，例如polyquad(参见美国专利第4,407,791号)、烷基汞盐和对羟基苯甲酸酯。在适当的情况下，将足量的防腐剂添加到药物组合物中以确保在使用过程中防止由细菌和真菌引起的二次污染。在另一个实施方案中，本发明的药物制剂不包含防腐剂。本组合物中的防腐剂组分(如果有的话)的浓度是有效保存组合物的浓度，并且通常在组合物的约0.00001％至约0.05％或约0.1％(w/v)等的范围内，包括范围内的所有值，在适当情况下包括适当的范围的端点。
[0108]
raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒，和它们的组合物可以以剂量单位形式配制以易于给药和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算可产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物，并与所需的药物载体相结合。剂量单位形式取决于认为产生期望效果所必需的raav颗粒(例如aav-tpp1颗粒)的量。所需的量可配制为单剂量或可配制为多剂量单位。可以将剂量调整到合适的raav颗粒浓度，任选地与抗炎剂组合，并包装以使用。
[0109]
在一个实施方案中，药物组合物将包括足够的遗传物质(raav颗粒)以提供治疗有效量，即足以减轻或改善所关注的疾病状态的症状的量或足以赋予期望益处的量。药物组合物通常含有药学上可接受的赋形剂。这样的赋形剂包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且可以在没有过度毒性的情况下给药的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，吐温80和例如水、盐水、甘油和乙醇的液体。其中可包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，可以存在于这样的溶媒中。在remington’s pharmaceutical sciences，1991中可获得对药学上可接受的赋形剂的详尽的讨论。
[0110]
含有raav颗粒(例如aav-tpp1颗粒)的制剂将在溶媒中包含有效量的raav颗粒，本领域技术人员容易确定该有效量。raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒，通常可以在组合物的约1％至约95％(w/w)的范围内，或者如果合适的话甚至更高。给药量取决于诸如考虑治疗的哺乳动物或人类受试者的年龄、体重和身体状况的因素。本领域普通技术人员可以通过建立剂量反应曲线的常规试验确定有效剂量。
[0111]
在某些实施方案中，方法包括将多种raav颗粒，例如aav-tpp1颗粒给予本文所述的哺乳动物(例如，患有lsd例如lincl的哺乳动物)，其中lsd的一种或多种症状的严重性、频率、进展或发作时间被降低、减轻、防止、抑制或延迟。在某些情况下，lsd的症状会降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，1、2、3、4、5、6、7或8周，或1、2、3、4、5或6个月。因此，在一些情况下，治疗方案包括但不必限于每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每两个月一次，以及其任意组合。术语“发作时间”是指在首次给予aav-tpp1颗粒后首次观察到或检测到lsd症状的时间点。其中一种或多种lsd症状的严重性、频率、进展或发作时间降低、减轻、防止、抑制或延迟的lsd的非限制性症状包括本体感受反应、眼球震颤、威胁、瞳孔光反射、小脑共济失调和意向震颤。lsd的一种或多种症状的严重程度、频率、进展或发作时间可以通过标准化的临床神经学检查主观确定(例如，参见lorenz等，2011)。
[0112]
与lsd相关的症状发作时间的延迟可以通过将用aav-tpp1颗粒治疗的哺乳动物的症状发作时间与不用aav-tpp1颗粒治疗的一种或多种哺乳动物比较来确定。在某些实施方
案中，方法包括向哺乳动物(例如患有lsd的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分给予多个aav-tpp1颗粒，并且lsd的一种或多种症状的严重性、频率、进展或发作时间降低、减轻、防止、抑制或延迟至少约5至约10、约10至约25、约25至约50或约50至约100天。
[0113]
vi.定义
[0114]
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用以指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)及其聚合物。多核苷酸包括基因组dna、cdna和反义dna，以及剪接或未剪接的mrna、rrna、trna和抑制性dna或rna(rnai，例如小或短发夹(sh)rna、微小rna(mirna)、小或短干扰(si)rna、反式剪接rna或反义rna)。多核苷酸可包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的，线性的或环状的，并且可以是任何合适的长度。在讨论多核苷酸时，特定多核苷酸的序列或结构可根据提供5
′
至3
′
方向序列的惯例在本文中描述。
[0115]
编码多肽的核酸通常包含编码该多肽的“开放阅读框”或orf。除非另有说明，特定的核酸序列还包括简并密码子置换。
[0116]
如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中通常可以互换使用。由本文公开的“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”包括部分或全长天然tpp1序列，如天然存在的野生型和功能性多态蛋白、其功能性子序列(片段)和修饰形式或其序列变体，只要该多肽保留一定程度的tpp1酶活性即可。因此，在本发明的方法中，由核酸序列编码的这样的多肽可以但不必与在治疗的哺乳动物中有缺陷，或其表达不足或缺乏的内源蛋白tpp1蛋白相同。
[0117]
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如，aav载体)或可通过核酸的插入或掺入来操纵的其他载体。诸如aav的载体可用于将多核苷酸引入/转移到细胞中，使得其中的多核苷酸被细胞转录并随后被细胞翻译。
[0118]“表达载体”是包含具有在宿主细胞中表达所需的必要调控区的基因或核酸序列的特化载体。载体核酸序列通常包含至少用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的另外的元件，例如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、(多个)itr、多聚腺苷酸化信号。
[0119]
可以靶向多肽以递送到细胞外、细胞内或膜位置。从细胞分泌的基因产物通常具有从细胞分泌到细胞外环境的分泌“信号”。还可以构建表达载体以包括分泌“信号”。基因产物也可以保留在细胞内。以类似的方式，基因产物可以包括，或者表达载体可以被构建成包括用于将多肽锚定在细胞质膜内的“保留”信号序列。例如，膜蛋白具有疏水性跨膜区，可将蛋白质保持在膜中。
[0120]
本文所用的术语“约”是指在参考值的(正或负)10％以内的值。
[0121]
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是预防或减少不希望的生理变化或障碍。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于可检测的或不可检测的一种或多种症状的缓解，疾病程度的减轻，一种或多种疾病症状或状态发稳定(即，不恶化或进展)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(部分或全部)。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期存活期相比延长存活期。需要治疗的那些包括已经患有该病症或障碍的那些以及易于患上该病症或障碍的那些或者其中该病症或障碍要被预防的那些。
[0122]
在描述本发明的上下文中，术语“一个”和“一种”和“该”以及类似的指代被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。因此，例如，对“载体”的引用包括多个这样的载体，对“病毒”或“颗粒”的引用包括多个这样的病毒粒子/颗粒，对“aav或raav颗粒”的引用包括多个这样的aav或raav颗粒。
[0123]
除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，是指“包括但不限于”)。
[0124]
除非本文另有说明，否则本文对值的范围的引用仅旨在充当单独引用落入该范围内的每个单独的值的速记方法，并且每个单独的值都被引入说明书中，就好像它在本文被单独引用一样。
[0125]
所有数值或数值范围包括这样的范围内的整数和范围内的值或整数的分数，除非上下文另外明确指出。因此，为了说明，对80％或更多的同一性的引用，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，包括范围内的所有值，在适当的情况下包括范围的端点。
[0126]
对大于(高于)或小于的整数的引用分别包括大于或小于参考数字的任何数字。因此，例如，对小于100的引用包括99、98、97等，一直到数字一(1)；小于10，包括9、8、7等，一直到数字一(1)。
[0127]
如本文所用，所有数值或范围包括这样的范围内的值和整数的分数以及这样的范围内的整数的分数，除非上下文另有明确指示。因此，为了说明，对数字范围的引用，例如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等。因此，对范围1-50的引用包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最高达并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，包括范围内的所有值，在适当的情况下包括范围的端点。
[0128]
对一系列范围的引用包括组合该系列内不同范围的边界值的范围。因此，为了说明对一系列范围的引用，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000，包括10-50、50-100、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000等范围以及范围内的所有值，在适当的情况下包括范围的端点。
[0129]
vii.实施例
[0130]
本发明包括适用的法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等价方案。此外，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖在其所有可能变化中的元素的任何组合。因此，以下实施例旨在说明但不限制要求保护的本发明的范围。
[0131]
实施例1-食蟹猴研究
[0132]
该研究的目的是评价在猴子中视网膜下注射测试物aav-tpp1(7.5x10
11
，2.5x10
11
或8.3x10
10
vg/眼)后的转基因表达。检眼镜检查表明rpe/脉络膜色素沉着在研究期间在所有三个剂量水平下都有一定程度的改变，并且oct图像分析显示视网膜形态发生了改变。在任何剂量水平下，对血液学或临床化学终点都没有与测试物相关的影响。鉴于第一项研究
显示出一些损伤以及远高于治疗益处所需的表达水平，因此进行了第二项食蟹猴研究。在研究2中，在以5x109vg/眼和8.3x109vg/眼视网膜下注射aav-tpp1后评估了转基因表达。两种剂量在非人类灵长类动物中均具有良好的耐受性。
[0133]
在不同时间点的房水中的所有剂量后(图1c-d)以及尸检后的视网膜和视神经(图1a、图1b和图1e)中测量tpp1水平。将在缺乏tpp1的细胞与重组tpp1和来自对照或注射动物的血清孵育后确定tpp1活性的百分比(图1f)。可以在来自产生了针对重组tpp1的中和抗体的动物的样品中量化tpp1活性的降低。
[0134]
发明人已知在动物模型中达到比htpp1的内源性水平高10倍的水平是有效的(katz等人，sci trans.med.2015)。目前，他们可以在5x109vg/眼下实现100倍的内源性水平。由此推断，剂量可以安全地减少一个对数并且仍然达到有效剂量，病毒载量甚至更少。
[0135]
实施例2-人临床试验方案
[0136]
提出了一项开放标签、非随机、剂量递增研究，以评价在缺乏tpp1和接受ert的受试者中视网膜下输注aav2-tpp1的安全性、耐受性和有效性。提出的研究将评价双侧注射(两次手术之间至少间隔3周)两个剂量的aav2-tpp1(如果证明较低剂量有效，则可能仅为一个剂量)。
[0137]
在该剂量递增研究中，初始受试者将接受tbd vg/眼的起始剂量并在给予第一受试者下一剂量水平之前完成至少六(6)个月的安全性观察。在初始受试者之后至少六个月，第二个群组将接受更高剂量水平的tbd vg/眼(或如果六个月后证明安全有效，则接受更低剂量)。如果在低剂量下达到预先指定的tpp1水平，将继续在该剂量下对所有受试者进行该试验。
[0138]
所有注射的受试者在aav递送至眼睛后将经历总共52(
±
2)周的安全观察。将鼓励完成52(
±
2)周(研究结束)的受试者参加一项持续另外4年的评价aav2-tpp1长期安全性的扩展研究。
[0139]
在一个剂量群组内的给药之间将间隔至少2周以确保安全性。受试者将在他们通常使用的输注地点接受定期安排的ert。ert后五到六天，前往研究地点进行第一次眼部手术/基因治疗输注。患者在最少3周内返回研究地点进行第二次眼部手术。
[0140]
主要功效终点是视网膜疾病的(视觉上和可测量的)减少，包括形态学oct和功能性erg或瞳孔测量：
[0141]
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黄斑亚区的量化-萎缩性视网膜环周围超自发荧光环直径的增加可以作为阻止疾病或减缓疾病的结果量度；使用蓝光加上oct来确定环直径的增加(提示基因治疗输注后最少6个月才能评估)
[0142]
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aav2-tpp1的载体脱落分析
[0143]
如果可能，将获得房水液中载体来源的http1酶活性水平和总蛋白水平的药代动力学参数测量值。
[0144]
次要功效终点可以通过以下方式测量：
[0145]
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瞳孔光反射测试
[0146]
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全场光灵敏度阈值测试
[0147]
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视敏度
[0148]
探索性功效终点可以通过以下方式测量：
[0149]
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还将使用以下方法测量视觉和视网膜功能：
[0150]
a.视觉功能问卷
[0151]
b.视野测试-humphrey和/或goldmann
[0152]
c.对比敏感度
[0153]
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chq的健康相关生活质量(即chq-pf-28)
[0154]
为了有资格参加本研究，候选人在筛选时必须满足以下合格标准：
[0155]
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经典晚发性婴儿型：患者或年长的兄弟姐妹(如果患者还年轻)到4岁时首次癫痫发作，或两种常见的语言延迟突变(4岁或以下)，并且总分≥3。
[0156]
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已确诊为tpp1缺乏(基于基因型和htppl酶活性)。
[0157]
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之前未参与过针对tpp1缺乏的基因治疗研究(用于ttp1缺乏的ert除外)。
[0158]
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经历ert最短6个月至最长2年的受试者。
[0159]
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在总分6分的评定量表的运动和语言领域中记录的总分≥3。
[0160]
此外，如果合适，父母或法定监护人和受试者必须能够理解研究的目的和风险，并提供签署和注明日期的知情同意书和授权，以依照国家和地方隐私法规使用其孩子参与的受保护的健康信息(phi)。
[0161]
如果筛选时存在以下排除标准中的任一项，则候选人将被排除在研究准入之外：
[0162]
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无法或不愿满足研究要求，包括接受双侧视网膜下载体给药。
[0163]
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目前未因ttp1缺乏接受ert。
[0164]
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任何先前参与给予基因治疗载体的研究。
[0165]
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在过去六个月内参与了一项研究性药物的临床研究。
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使用可能与tpp1酶的生化活性相互作用的化合物或前体；停止使用这些化合物3个月的个人可以合格。
[0167]
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六个月内曾做过眼内手术。
[0168]
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已知对围手术期计划使用的药物的过敏。
[0169]
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将妨碍计划的手术或干扰对研究的解释的预先存在的眼部疾病或复杂的全身性疾病。
[0170]
本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据本发明在没有过度实验的情况下制备和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以将变化应用到组合物和方法以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序中。更具体地，显而易见的是，某些化学和生理学相关的药剂可以替代本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。
[0171]
参考文献
[0172]
本技术中引用的所有参考文献、专利、专利申请、论文和文献均通过引用具体并入本文。以下参考文献可以提供示例性的程序或其他细节，以补充本文所阐述的那些。
[0173]
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