一种工厂化冬荪液体菌种及其制备方法与流程

1.本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种工厂化冬荪液体菌种及其制备方法。


背景技术：

2.冬荪，又名竹下菌、无裙荪，属鬼笔科、鬼笔属真菌。《全国中草药汇编》和《中华本草》中记载，冬荪菌柄、菌托和子实体可入药，其药性为甘，淡，性温，有活血止痛，祛风除湿的功效，可用于治疗风湿痛。另外，有研究表明，冬荪的提取物可通过降低血小板聚集的发生率来减少乳腺癌患者因静脉血栓导致死亡的状况，有作为辅助预防营养品的潜力。其发酵物经处理可用于治疗癌症、痛风，激发性欲等。还可抑制腐败菌生长，作为食品的短期防腐剂。冬荪营养丰富、药用价值高，具有广泛开发利用的前景。
3.目前，仅贵州开展冬荪的规模化人工种植。传统的冬荪菌种是通过三级固体菌种逐步扩大的方式生产的，从母种到栽培种的生产周期需7-8个月，周期长，效率低，远远不能满足大规模种植的需要。菌种生产是冬荪产业发展的关键，液体菌种具有制作程序简单，基质简单，成本低，生产周期短，菌龄一致，接种方便，活性高等优点。
4.公告号为cn108541513b的专利文件公开了一种冬荪液体菌种快繁方法，分两个阶段液体摇瓶,此专利方法只有摇瓶阶段的方法，且要进行两级培养才能用做工厂发酵，培养时间久，容易引起杂菌污染，不适合工厂化生产。
5.公布号为cn113317131a的专利文件公开了一种冬荪鬼笔液体菌种制作及生产菌棒的方法，培养基成分只有碳源、氮源、无机盐，且此专利没有明确液体菌种和菌棒的培养时间。
6.冬荪菌丝生长速度慢，液体菌种生产过程中容易形成大的菌球，菌球分散程度低，菌丝活力低；现有的冬荪液体菌种生产方法没有控制杂菌污染，一旦污染杂菌，将降低液体菌种生产的效率，使菌种质量大大降低，并且增加成本投入。因此，亟需改进冬荪液体菌种的培养基成分和生产工艺。


技术实现要素：

7.本发明为解决上述问题，提供了一种工厂化冬荪液体菌种及其制备方法，具体是通过以下技术方案实现：
8.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
9.所述液体菌种的制备方法具体如下：
10.1、冬荪一级液体菌种的制备：
11.(1)配制培养基：按照配方蔗糖10-20g/l、羧甲基纤维素钠3-6g/l、酵母浸粉1-3g/l、玉米浆4-8g/l，过滤水100-200ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸
封口，121℃灭菌15-20分钟，冷却后加入青霉素10-100u/ml、链霉素0.05-0.1mg/ml、两性霉素b 0.1-0.25μg/ml。
12.(2)接种及培养：用打孔器取5-8块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于20-25℃，140-160r/min振荡培养20-30d，得到冬荪一级液体菌种；
13.2、冬荪二级液体菌种的制备
14.(1)配制培养基：按照配方蔗糖10-20g/l、羧甲基纤维素钠3-6g/l、酵母浸粉1-3g/l、玉米浆4-8g/l、吐温80 1-2％、过滤水15-24l，装入发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素10-100u/ml、链霉素0.05-0.1mg/ml、两性霉素b 0.1-0.25μg/ml。
15.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10-30％接种于发酵罐中，于20-25℃，140-160r/min搅拌培养15-30d，得到冬荪二级液体菌种；
16.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30-50ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养30-40d，得到冬荪栽培种。
17.综上所述，本发明的有益效果在于：1、本发明通过在培养基中加入羧甲基纤维素钠，增加培养基粘稠度，可促进冬荪菌丝球分散均匀，快速增殖；2、添加三抗药物(青霉素、链霉素、两性霉素b)，可有效抑制真菌和细菌等杂菌污染，提高液体菌种制种的成功率；3、采用液体菌种接种菌棒，菌棒长满时间比固体原种接种培养时间短；4、本发明冬荪液体菌种培养基成分简单、工艺易操作，适用于工厂化生产。
18.与公开号为cn108541513b的专利文件相比，本专利方法摇瓶阶段只有一级菌种，然后直接作为工厂化发酵生产菌种，减少了培养环节，可节省培养时间，提高生产效率。此专利液体菌种培养基成分多，其中添加了琼脂，本专利培养基成分添加羧甲基纤维素钠作为增稠剂，具有比琼脂分散性好的优点，另外还添加了抗生素，有效抑制了真菌和细菌等杂菌污染，提高液体菌种制备的成功率。
19.与公布号为cn113317131a的专利文件相比，本专利液体菌种培养基成分更简单，更易配制，还具有防污染的作用，通过添加羧甲基纤维素钠增加培养基粘度，促进菌丝球分散，有利于提高菌丝球增殖速度，减短培养时间，提高生产效率，更适合工厂化生产。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但并不局限于以下实施方式，任何在本实施例上的改进或代替，仍属于本发明保护的范围。
21.实施例1
22.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
23.所述液体菌种的制备方法具体如下：
24.1、冬荪一级液体菌种的制备：
25.(1)配制培养基：按照配方蔗糖10g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭菌20分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
26.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养30d，得到冬荪一级液体菌种。
27.2、冬荪二级液体菌种的制备
28.(1)配制培养基：按照配方蔗糖10g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l、吐温80 1％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐的罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
29.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养30d，得到冬荪二级液体菌种；
30.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
31.实施例2
32.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
33.所述液体菌种的制备方法具体如下：
34.1、冬荪一级液体菌种的制备：
35.(1)配制培养基：按照配方蔗糖15g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭菌20分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
36.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养25d，得到冬荪一级液体菌种；
37.2、冬荪二级液体菌种的制备
38.(1)配制培养基：按照配方蔗糖15g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l、吐温80 2％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
39.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养25d，得到冬荪二级液体菌种；
40.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
41.实施例3
42.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
43.所述液体菌种的制备方法具体如下：
44.1、冬荪一级液体菌种的制备：
45.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭
菌0分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
46.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养20d，得到冬荪一级液体菌种；
47.2、冬荪二级液体菌种的制备
48.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠3g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l、吐温80 1％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
49.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养20d，得到冬荪二级液体菌种；
50.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
51.实施例4
52.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
53.所述液体菌种的制备方法具体如下：
54.1、冬荪一级液体菌种的制备：
55.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭菌0分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
56.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养20d，得到冬荪一级液体菌种；
57.2、冬荪二级液体菌种的制备
58.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆4g/l、吐温80 1％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
59.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养20d，得到冬荪二级液体菌种；
60.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
61.实施例5
62.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
63.所述液体菌种的制备方法具体如下：
64.1、冬荪一级液体菌种的制备：
65.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米
浆5g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭菌0分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
66.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养20d，得到冬荪一级液体菌种；
67.2、冬荪二级液体菌种的制备
68.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆5g/l、吐温80 1％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
69.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养20d，得到冬荪二级液体菌种；
70.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
71.实施例6
72.一种工厂化冬荪液体菌种，所述的液体菌种包括一级液体菌种和二级液体菌种；其中，在一级液体菌种和二级液体菌种中均添加了三抗药物和羧甲基纤维素钠。进一步，所述的三抗药物为青霉素、链霉素和两性霉素b。
73.所述液体菌种的制备方法具体如下：
74.1、冬荪一级液体菌种的制备：
75.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆6g/l，过滤水100ml；用300ml玻璃三角瓶配制液体培养基，用硅胶塞和报纸封口，121℃灭菌0分钟，冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
76.(2)接种及培养：用打孔器取5块0.5cm2冬荪母种菌块接种于一级液体菌种培养基中，于25℃，160r/min振荡培养20d，得到冬荪一级液体菌种；
77.2、冬荪二级液体菌种的制备
78.(1)配制培养基：按照配方蔗糖20g/l、羧甲基纤维素钠5g/l、酵母浸粉1g/l、玉米浆6g/l、吐温80 2％、过滤水20l，装入容量30l的发酵罐中，罐温上升到120℃，发酵罐罐压维持在0.1mpa(表压)，保持30min；冷却后加入青霉素80u/ml、链霉素0.1mg/ml、两性霉素b 0.20μg/ml。
79.(2)接种及培养：取冬荪一级液体菌种10％接种于发酵罐中，于25℃，160r/min搅拌培养20d，得到冬荪二级液体菌种；
80.3、一种冬荪栽培种的制备方法：接种30ml冬荪液体菌种到菌棒中，室温培养40d，得到冬荪栽培种。
81.对实施例1-6中冬荪一级液体菌种培养20d时的菌丝球状态和数量进行统计，如表1所示。
82.表1培养基成分对冬荪菌丝球的影响
[0083][0084]
据报道，液体种菌丝球浓度需达到800-1500个/ml以上才适用于生产。由表1可知，实施例1-6的培养基配方所得的菌丝球浓度都能够满足生产。其中，菌丝球浓度随着蔗糖和羧甲基纤维素钠浓度增加而增加，当蔗糖浓度为20g/l、羧甲基纤维素钠浓度为5-6时，冬荪菌丝球分散非常均匀，菌丝球浓度达到1500以上。