一种中药提取物、组合物及其在制备具有清洁固化牙齿作用的牙膏或漱口水中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种中药提取物、组合物及其在制备具有清洁固化牙齿作用的牙膏或漱口水中的应用。


背景技术：

2.变形链球菌(streptococcus mutans)是口腔天然菌群中占比例最大的链球菌属中的一种，为牙斑的主要成分之一；同时变形链球菌家也是导致龋病发生的主要细菌。因此，通过抑制变形链球菌的生长是一种预防或减少龋病以及牙斑生成的可行的方法。
3.山栀子为茜草科植物山栀的果实，是中药名。主治：热病心烦、肝火目赤、头痛、湿热黄疳、淋证、血痢尿血、口舌生疮、疮疡肿毒、扭伤肿痛。并无现有技术报道山栀子或其中的成分具有抗变形链球菌作用。薄荷(学名：mentha canadensis linnaeus)是唇形科、薄荷属植物，即同属其他干燥全草。薄荷是中华常用中药之一。它是辛凉性发汗解热药，治流行性感冒、头疼、目赤、身热、咽喉、牙床肿痛等症。外用可治神经痛、皮肤瘙痒、皮疹和湿疹等。现有技术同样未报道薄荷或其中的成分具有抗变形链球菌作用。
4.因此，开发一种具有抗变形链球菌的中药提取物以及组合物对于预防或减少龋病以及牙斑的生成具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种中药提取物，所述的中药提取物具有抗变形链球菌作用；采用该中药提取物作为活性成分加入到牙膏和漱口水中，可以起到预防或减少龋病以及牙斑的生成的作用；同时可以使得制备得到的牙膏或漱口水具有清洁固化牙齿的作用。
6.本发明所要解决的技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.一种中药提取物，所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
8.(1)取中药山栀子以及薄荷混合后，用体积分数为30％～50％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
9.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱，然后用乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
10.发明人在大量的实验中惊奇的发现：以中药山栀子以及薄荷为原料通过乙醇提取以及大孔树脂柱洗脱得到的中药提取物具有一定的抗变形链球菌作用。
11.本发明的发明点之一在于，以中药山栀子以及薄荷为原料制备中药提取物；研究表明，以中药山栀子以及薄荷为原料，通过本发明的上述方法制备得到的中药提取物，其抗变形链球菌作用远远大于仅仅以中药山栀子或薄荷为原料制备得到的中药提取物。
12.优选地，步骤(1)中，中药山栀子以及薄荷的重量比为1～2:1～2。
13.最优选地，步骤(1)中，中药山栀子以及薄荷的重量比为2:1。
14.优选地，中药山栀子与薄荷的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:10～20ml；
15.最优选地，中药山栀子与薄荷的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml。
16.优选地，步骤(2)中用乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥后即得所述的中药提取物的具体方法为：
17.先用3～5倍柱体积的体积分数为5％～10％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用3～6倍柱体积的体积分数为20～30％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为20～30％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
18.优选地，步骤(2)中用乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥后即得所述的中药提取物的具体方法为：
19.先用4倍柱体积的体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
20.优选地，所述的大孔树脂为d101型大孔树脂。
21.发明人在研究中进一步发现，大孔树脂的洗脱条件对于得到的中药提取物是否具有优异的抗变形链球菌作用起着决定性作用。研究表明，只有通过上述大孔树脂洗脱条件制备得到的中药提取物才具备优异的抗变形链球菌作用；而在其它大孔树脂洗脱条件制备得到的中药提取物并不具备抗变形链球菌作用，甚至是不具备抗变形链球菌作用。
22.本发明还提供了一种组合物，其包含上述中药提取物以及方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物；
23.所述的方格星虫三肽的氨基酸序列为ser-arg-pro；
24.所述的方格星虫三肽金属螯合物是通过方格星虫三肽与金属盐反应制备得到。
25.上述方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物是发明人前期制备得到的，已于2021年9月15日申请了专利，专利号为202111082550.9。发明人进一步研究表明，将方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物与本发明中药提取物组合物后，其同样具备优异的抗变形链球菌作用。
26.优选地，中药提取物与方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物的重量比为3～5:1。
27.最优选地，中药提取物与方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物的重量比为4:1。
28.本发明还提供一种上述中药提取物在制备具有抗变形链球菌作用的抗菌剂中的应用。
29.本发明还提供一种上述组合物在制备具有抗变形链球菌作用的抗菌剂中的应用。
30.本发明还提供一种上述中药提取物或组合物在制备具有清洁固化牙齿作用的牙膏或漱口水中的应用。
31.优选地，所述的牙膏或漱口水中还含有灵芝提取物。
32.发明人进一步研究发现，灵芝提取物同样能抑制口腔内的其它有害细菌，更可以清除口腔内有害的原虫类生物，如齿龈内阿米巴。因此，在牙膏或漱口水中加入灵芝提取物，一方面能够拓宽抗菌的范围，可以有效地减少有害细菌的再次滋生；另一方面还可以清除口腔内有害的原虫类生物；使得牙膏或漱口水具有多重抑菌以及抗原虫类生物作用。
33.有益效果：本发明首次以中药山栀子以及薄荷为原料通过乙醇提取以及大孔树脂柱洗脱制备中药提取物，研究表明制备得到的中药提取物具有一定的抗变形链球菌作用。发明人进一步研究表明，将方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物与本发明中药提取物组合物后，具备优异的抗变形链球菌作用。由于所述的中药提取物以及组合物具有抗变形链球菌作用；因此，采用该中药提取物或组合物作为活性成分加入到牙膏和漱口水中，可以起到预防或减少龋病以及牙斑的生成的作用；同时可以使得制备得到的牙膏或漱口水具有清洁固化牙齿的作用。
具体实施方式
34.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
35.实施例1中药提取物的制备
36.(1)取100g中药山栀子以及50g薄荷混合后，用2.25l体积分数为40％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
37.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱(大孔树脂柱中的填料为d101大孔树脂；大孔树脂的重量用量为乙醇提取物重量的40倍)；先用4倍柱体积的体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
38.实施例2组合物的制备
39.将实施例1制备得到的中药提取物与方格星虫三肽锌螯合物按重量比4:1混合而成。
40.所述的方格星虫三肽锌螯合物通过如下方法制备得到：
41.(1)取250mg fmoc-ser(tbu)-oh树脂倒入反应柱中，加入dmf浸泡30min，抽干；再加入哌啶dmf溶液，振荡后滤出溶剂；
42.(2)向反应柱中加入适量脱保护溶液(哌啶＝20％六氢吡啶 80％dmf)，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干，向反应柱中加入适量dmf，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次；
43.(3)加入fmoc-arg(pbf)-oh、缩合剂hbtu以及有机碱nmm，氮气搅拌鼓动30分钟，进行缩合反应；其中，fmoc-arg(pbf)-oh、缩合剂hbtu以及有机碱nmm与fmoc-ser(tbu)-oh树脂的摩尔用量比为3:2.85:6:1；
44.(4)缩合反应完毕后，将反应柱中的溶液抽干，加入适量dmf洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次；
45.(5)参照步骤2～4加入fmoc-pro-oh进行缩合反应；反应完毕后脱除fmoc-pro-oh上面的保护基fmoc，使n端裸露出来；
46.(6)抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量dcm，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割；
47.(7)将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量切液(1g/10ml，组成为87.5％tfa 5％苯甲硫醚 2.5％苯酚 2.5％edt 2.5％h2o)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时；过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入离心管的玻璃容器内，
加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品；
48.(8)将白色固体分装进离心管中，离心管密封后放入离心机中以4000r/min的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次；
49.(9)将已洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时；经纯化后即得氨基酸序列为ser-arg-pro方格星虫三肽；
50.(11)溶解：取方格星虫三肽，置于烧杯中，加入超纯水(方格星虫三肽：超纯水质量比1：25)，搅拌、溶解，调ph值5.5；
51.(12)螯合反应：将烧杯置于55℃水浴中，搅拌下加入硫酸锌(方格星虫三肽：锌的质量比为2.5∶1)，螯合反应35min。放置室温；
52.(13)洗涤：向反应液中加入无水乙醇洗涤，搅拌10min，离心(5000r/min)10min；其中，无水乙醇与反应液的体积比为2:1；
53.(14)纯化：取沉淀加入无水乙醇震荡洗涤2min，离心(5000r/min)10min，重复上述的步骤2次，去除游离zn ，再次加入无水乙醇，置于-20℃冰箱内36h；其中，洗涤后的沉淀与无水乙醇的用量比为1g:3ml；
54.(15)冷冻干燥：离心后的置于冷冻干燥机内，冷冻干燥，得白色晶体，即所述的方格星虫三肽锌螯合物。
55.对比例1中药提取物的制备
56.(1)取150g中药山栀子，用2.25l体积分数为40％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
57.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱(大孔树脂柱中的填料为d101大孔树脂；大孔树脂的重量用量为乙醇提取物重量的40倍)；先用4倍柱体积的体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
58.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1仅仅以山栀子为原料制备中药提取物。
59.对比例2中药提取物的制备
60.(1)取150g中药薄荷，用2.25l体积分数为40％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
61.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱(大孔树脂柱中的填料为d101大孔树脂；大孔树脂的重量用量为乙醇提取物重量的40倍)；先用4倍柱体积的体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
62.对比例2与实施例1的区别在于，对比例2仅仅以薄荷为原料制备中药提取物。
63.对比例3中药提取物的制备
64.(1)取100g中药山栀子以及50g薄荷混合后，用2.25l体积分数为40％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
65.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱(大孔树脂柱中的填料为d101大孔树脂；大孔树脂的重量用量为乙醇提取物重量的40倍)；先用4倍柱体积的水洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为15％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为15％的乙醇水溶液洗脱下来的
流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
66.对比例3与实施例1的不同之处在于，大孔树脂的洗脱条件不同；对比例3的大孔树脂洗脱条件为：先用水洗脱除杂；再用体积分数为15％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为15％的乙醇水溶液洗脱下来的流份。而实施例1的大孔树脂洗脱条件为：先用体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份。
67.对比例4中药提取物的制备
68.(1)取100g中药山栀子以及50g薄荷混合后，用2.25l体积分数为40％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后得乙醇提取物；
69.(2)将乙醇提取物上大孔树脂柱(大孔树脂柱中的填料为d101大孔树脂；大孔树脂的重量用量为乙醇提取物重量的40倍)；先用4倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为50％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
70.对比例4与实施例1的不同之处在于，大孔树脂的洗脱条件不同；对比例4的大孔树脂洗脱条件为：先用体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为50％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱下来的流份。而实施例1的大孔树脂洗脱条件为：先用体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份。
71.实验例
72.采用牛津杯法测试抗菌实验，具体方法如下：在无菌条件下在培养基中加入0.2ml浓度为1
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107个/ml的变形链球菌菌液，用l型涂抹棒涂抹均匀；干燥后，用镊子将牛津杯放入培养基中，然后在牛津杯中加入200μl浓度为0.1g/ml的待测药液，将装有上述培养基的培养皿放入培养箱中，37℃中培养24h，测量抑菌圈圈直径；其中抑菌圈直径越大说明抗菌效果会越好；各组药物分别测试10次，计算平均直径；测试结果见表1。
73.表1.抗变形链球菌实验结果
[0074][0075][0076]
从表1实验中可以看出，实施例1和2制备得到的中药提取物以及组合物的抑菌圈直径大于20mm，说明中药提取物以及组合物具有优异的抗变形链球菌作用；尤其是将方格星虫三肽锌螯合物与本发明中药提取物组合物后，其抗变形链球菌作用比单纯使用中药提
取物要进一步提高。
[0077]
从表1实验中还可以看出，实施例1制备得到的中药提取物的抑菌圈直径要远远大于对比例1和2制备得到的中药提取物；这说明：以中药山栀子以及薄荷为原料通过乙醇提取以及大孔树脂柱洗脱制备中药提取物，其抗变形链球菌作用要远远大于仅仅以中药山栀子或薄荷为原料制备得到的中药提取物。
[0078]
从表1实验中还可以看出，实施例1制备得到的中药提取物的抑菌圈直径要远远大于对比例3和4制备得到的中药提取物；这说明：大孔树脂的洗脱条件对于以中药山栀子以及薄荷为原料制备得到的中药提取物是否具有优异的抗变形链球菌作用起着决定性作用；以中药山栀子以及薄荷为原料并不是在任意的大孔树脂洗脱条件下均能制备得到具有优异抗变形链球菌作用的中药提取物；只有在本发明所述的大孔树脂洗脱条件下(即先用体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为25％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为25％的乙醇水溶液洗脱下来的流份)才能制备得到具有优异抗变形链球菌作用的中药提取物。