热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用的制作方法

1.本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及到热稳定性提高且比活力较好的木聚糖酶突变体、其制备及其应用。


背景技术：

2.半纤维素是地球上存在的最丰富的非纤维素杂多糖，是植物细胞和细胞壁的主要组成成分。将半纤维素高效转化成其它有价值的副产物，不但有着良好的经济效益，同时也对环境保护起着积极作用。
3.植物细胞和细胞壁中的半纤维素的主要成分为木聚糖。木聚糖是植物细胞中的主要结构多糖，是自然界中第二丰富的多糖，约占地球上所有可再生有机碳的三分之一。
4.木聚糖，由木糖分子(d xylose)以β-1,4-糖苷键连结成主链；阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。在自然界中富含木聚糖的原料来源广泛，包括硬木、软木、秸秆、稻草、麸皮等农、林、工业废弃物及城市固体垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15～30％，软材中一般占干重的7～12％。而在一些一年生植物如小麦、棉子壳中，木聚糖含量则高达30％以上。
5.木聚糖酶是糖苷酶(o-糖苷水解酶，ec 3.2.1.x)，其催化木聚糖中1,4-βd-木糖苷键(β-1,4-糖苷键)的内切水解。根据其结构和催化结构域，木聚糖酶可主要划分为gh 10家族和gh11家族。木聚糖酶gh10家族包括内切-1,4-β-木聚糖酶(ec3.2.1.8)，内切-1,3-β-木聚糖酶(ec 3.2.1.32)和纤维二糖水解酶(ec 3.2.1.91)，其中以内切-1,4-β-木聚糖酶为主。和gh10家族相比，gh11家族只能专一的作用于d-木糖，可以称为“真正意义上的木聚糖酶”，有着分子量低，活力高等特点。
6.在工业上，木聚糖酶有着广泛的应用。在食品行业中，木聚糖酶被用于水果、蔬菜和植物等的加工，以促进浸渍过程；在造纸工业中，木聚糖酶被用于促进制浆处理；在纺织工业中，木聚糖酶被用于纺织品的酶解中，减少或替代化学混麻方法，以降低环境污染；在饲料行业中，木聚糖酶被添加于单胃动物以及反刍动物的饲料当中，以提高饲料的可消化性和营养价值；在生物能源领域方面，木聚糖酶可与其他纤维素酶、半纤维素酶共同应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇的工业生产中，而且近些年随着五碳糖发酵途径及菌株的研究、开发，利用细菌、酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木糖生产燃料乙醇的工艺日趋成熟，木聚糖酶在生物能源领域内扮演的角色越来越重要。
7.在工业应用上的木聚糖酶大都来源于细菌或真菌，它们大都为嗜中温。然而在生产过程中，往往需要经过高温处理环节，这样导致木聚糖酶的性能大为折扣。获得热稳定性优良的木聚糖酶突变株将使其应用更广泛，效率更高。因此，本领域需要开发适应于不同的高温条件且能保持较为理想的酶活性


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用。
9.在本发明的第一方面，提供一种提高木聚糖酶的热稳定性的方法，包括：对木聚糖酶的氨基酸序列进行突变，对应于野生型木聚糖酶所示的氨基酸序列(seq id no:2)，突变选自下组的位点或其组合：第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位，第203位。
10.在一个优选例中，第14位突变为his(h)；第28位突变为val(v)；第29位突变为ser(s)或ala(a)；第30位突变为ser(s)或pro(p)；第31位突变为his(h)；第41位突变为arg(r)；第52位突变为leu(l)；第131位突变为cys(c)；第133位突变为glu(e)；第192位突变为asp(d)；和/或，第203位突变为val(v)。
11.在本发明的另一方面，提供一种木聚糖酶突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于野生型木聚糖酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的蛋白：第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位，第203位；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型木聚糖酶的第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位或第203位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型木聚糖酶的第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位或第203位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。
12.在一个优选例中，第14位突变为his(h)；第28位突变为val(v)；第29位突变为ser(s)或ala(a)；第30位突变为ser(s)或pro(p)；第31位突变为his(h)；第41位突变为arg(r)；第52位突变为leu(l)；第131位突变为cys(c)；第133位突变为glu(e)；第192位突变为asp(d)；和/或，第203位突变为val(v)。
13.在另一优选例中，所述的木聚糖酶突变体包括选自下组的蛋白：对应于野生型木聚糖酶：
14.(1)第14位突变为his，第28位突变为val；第29位突变为ser，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp(d)，第203位突变为val(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l)；
15.(2)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp，第203位突变为val，第41位突变为arg(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l/k41r)；
16.(3)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第203位突变为val，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第131位突变为cys，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l/q131c)；
17.(4)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第203位突变为val，第30位突变为pro，第31位突变为his，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v/s30p/t31h)；
18.(5)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第203位突变为val，
第30位突变为pro，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v/s30p)
19.(6)第29位突变为ser，第28位突变为val，第203位突变为val，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l)；
20.(7)第14位突变为his，第28位突变为val，第203位突变为val，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14h/d29/a203v/s30p/t31h/a52l)；
21.(8)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14h/d29s/a203/s30p/t31h/a52l)；
22.(9)第29位突变为ser，第28位突变为val，第30位突变为pro，第31位突变为his，第52位突变为leu，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/k133e/g192d/q14/d29s/a203/s30p/t31h/a52l)；
23.(10)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ser，第30位突变为ser，第203位突变为val，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/n30s/k133e/g192d/q14h/d29s/a203v)；或
24.(11)第14位突变为his，第28位突变为val，第29位突变为ala，第30位突变为ser，第203位突变为val，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/n30s/k133e/g192d/q14h/d29a/a203v)；或
25.(12)第28位突变为val，第30位突变为ser，第133位突变为glu，第192位突变为asp(l28v/n30s/k133e/g192d(xyn370))。
26.在一个优选例中，所述的木聚糖酶突变体包括选自下组序列的蛋白：seq id no:14，seq id no:16，seq id no:18，seq id no:12，seq id no:10，seq id no:20，seq id no:22，seq id no:24，seq id no:26，seq id no:8，seq id no:6或seq id no:4。
27.在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码前述任一所述的木聚糖酶突变体；较佳地，所述的核酸的核苷酸序列如seq id no:13，seq id no:15，seq id no:17，seq id no:11，seq id no:9，seq id no:19，seq id no:21，seq id no:23，seq id no:25，seq id no:7，seq id no:5或seq id no:4。
28.在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
29.在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
30.在一个优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括霉菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。
31.在本发明的另一方面，提供一种前面任一所述的木聚糖酶突变体的制备方法，该方法包含：
32.(i)培养所述的宿主细胞；
33.(ii)收集含有所述的木聚糖酶突变体的培养物；
34.(iii)从培养物中分离出所述的木聚糖酶突变体。
35.在本发明的另一方面，提供一种用于降解木聚糖的组合物，它含有有效量的：前面任一所述的木聚糖酶突变体；或所述的宿主细胞或其培养物或裂解物；以及食品学或工业上可接受的载体。
36.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的木聚糖酶突变体或所述的组合物的用途，用于降解木聚糖；较佳地，所述木聚糖酶突变体酶切β-1,4-糖苷键，从而水解木聚糖。
37.在本发明的另一方面，提供一种降解木聚糖的方法，所述方法包括：利用前面任一所述的木聚糖酶突变体或所述的组合物降解木聚糖；较佳地，所述木聚糖酶突变体酶切β-1,4-糖苷键，从而水解木聚糖。
38.在一个优选例中，所述的降解或酶切为高温下的降解或酶切；较佳地，所述的高温为45～95℃；较佳地50～90℃(如55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃)。
39.在另一优选例中，所述的木聚糖酶突变体或组合物降解的底物是木聚糖或含有木聚糖的物质。
40.在另一优选例中，所述的木聚糖包括(但不限于)：山毛榉木聚糖，玉米芯木聚糖，燕麦皮木聚糖。
41.在另一优选例中，所述的含有木聚糖的物质包括(但不限于)：工业产品，农、林、工业废弃物及城市固体垃圾；较佳地，包括(但不限于)：纸浆、饲料、食品、秸秆、硬木、软木、稻草、麸皮。
42.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的木聚糖酶突变体或所述的组合物的用途，包括：作为食品添加物；作为植物(包括如水果或蔬菜)加工过程添加剂；作为造纸过程添加物；作为纺织品加工过程添加物；作为饲料添加物；和/或应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇。
43.在本发明的另一方面，提供一种木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸的文库，所述文库包括：前面任一所述的木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸中的至少5种，较佳地至少10种；更佳地其包括所述的木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸。
44.在本发明的另一方面，提供所述的木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸的文库的用途，用于根据待降解木聚糖所处反应体系的温度，提供适当的木聚糖酶突变体以降解木聚糖。
45.在本发明的另一方面，提供一种用于降解木聚糖的试剂盒，其中含有：前面任一所述的木聚糖酶突变体或突变体的组合；所述的宿主细胞；所述的组合物；或所述的木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸的文库。
46.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
47.图1-1～图1-13、野生型及突变体序列信息汇总。
具体实施方式
48.本发明人从来源于gh11家族的野生型木聚糖酶出发，通过定向进化的易错pcr技
术，结合本发明人针对该类木聚糖酶的长期研究经验，确定了与热稳定性相关的氨基酸位点，通过进行定点改造，获得热稳定性显著提高的突变体。
49.如本文所用，所述的“木糖”指一种含有五个碳原子的单糖。分子式c4h9o4cho。所述的“木聚糖”是“木糖”的聚合体。
50.如本文所用，除非另外说明，所述的“木聚糖酶突变体”、“突变型木聚糖酶”可互换使用，是指对应于突变前的木聚糖酶，在本发明人确定的一些与酶的热稳定性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)，较佳地相应于seq id no:2所示的氨基酸序列，突变选自下组的位点或其组合：第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第203位。
51.若需要表示突变前的木聚糖酶(野生型)，其可以为“氨基酸序列如seq id no:2的蛋白。除非另外说明，本发明中的突变体的突变位点基于该seq id no:2所示的序列。
52.本发明中，除非另外说明，木聚糖酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示木聚糖酶突变体中突变的氨基酸，如q14h，表示位置14的氨基酸由亲本木聚糖酶的q替换成h。
53.如本文所用，“分离的木聚糖酶”是指木聚糖酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化木聚糖酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
54.如本文所用，“提高热稳定性”是指与改造前的木聚糖酶出发多肽相比，发生突变的木聚糖酶的热稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种处理温度下，热稳定性提高的突变型木聚糖酶在一定时间的热处理后，残余酶活比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。
55.如本文所用，所述的“木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸的文库”是指含有本发明提供的一系列突变型木聚糖酶的多肽集合体或多核苷酸集合体。多条稳定性有不同或温度适应性有不同的木聚糖酶突变体或编码其的多核苷酸被组装于一个库中，有利于本领域技术人员根据其所需的反应条件，选择合适的木聚糖酶或其编码核酸。
56.本发明的突变体蛋白可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
57.本发明还包括所述木聚糖酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然木聚糖酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的木聚糖酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:2所示的氨基酸序列，选自第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位和/或第203位氨基酸的突变。
58.在本发明中，术语“木聚糖酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括木聚糖酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:2所示的氨基酸序列，选自第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位和/或第203位氨基酸的突变。
59.在本发明中，术语“木聚糖酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:2所示的氨基酸序列，选自第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位和/或第203位氨基酸的突变。
60.发明还提供所述木聚糖酶突变体的类似物。这些类似物与所述木聚糖酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
61.作为本发明的优选方式，在所述优选的与稳定性相关的位点中，第14位突变为his(h)；第28位突变为val(v)；第29位突变为ser(s)或ala(a)；第30位突变为ser(s)或pro(p)；第31位突变为his(h)；第41位突变为arg(r)；第52位突变为leu(l)；第131位突变为cys(c)；第133位突变为glu(e)；第192位突变为asp(d)；和/或，第203位突变为val(v)。
62.在本发明的具体实施例中，本发明人利用易错pcr技术对来源于木聚糖酶11家族的野生型xyn11(核酸序列如seq id no:1所示，蛋白序列如seq id no:2所示)进行第一轮随机突变，随机突变文库容量为10000个，得到优选突变体xyn68。以该优选xyn68为模板，利用易错pcr对xyn68进行第二轮随机突变，突变文库容量为20000个，得到优选突变体xyn370(核酸序列如seq id no:3所示，蛋白序列如seq id no:4所示)。与野生型相比，xyn370包括突变：l28v/n30s/k133e/g192d。
63.对上述两轮得到的优选突变体(包括xyn68和xyn370，但不限于xyn68和xyn370)进行测序，发现突变位点大都集中在q14h，l28v，d29a，n30s，s93a，r97l，v99l，k133e，e159g，
a187d，g192d，a203v。
64.将q14h，l28v，d29a，n30s，s93a，r97l，v99l，k133e，e159g，a187d，g192d，a203v突变位点单个逐一引入野生型xyn11，发现q14h，d29a，a203v对野生型xyn11热稳定性有提升作用
65.将q14h，d29a，v203以单个、两个组合，或三个组合方式引入上述优选突变体xyn370，得到优选突变体xyn370-q14h/d29a/a203v(核酸序列如seq id no:5所示，蛋白序列如seq id no:6所示)
66.对上述优选xyn370-q14h/d29a/a203v突变体的第14位氨基酸残基进行饱和突变，将残基q替换成除h外的另18种氨基酸残基；对第29位氨基酸残基进行饱和突变，将残基d替换成除a外的另18种氨基酸；对第203位氨基酸残基进行饱和突变，替换成除a外的另18种氨基酸，得到优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v(核酸序列如seq id no:7所示，蛋白序列如seq id no:8所示)
67.对上述优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v，利用在线服务器进行同源建模，获取优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v 3d结构图。
68.对上述优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v的3d立体结构，利用在线服务器进行b-factor值的预测，获得优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v每个残基的b-factor值信息。
69.选取上述优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v中b-factor值较高的残基，分别为：30s、31t、41k、52a、53v、108g、109v、110q、131q、170q、171k。
70.对上述优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v中的30s、31t、41k、52a、53v、108g、109v、110q、131q、170q、171k分别进行饱和突变，构建饱和突变文库，从饱和突变文库中筛选得到s30p、t31h、k41r、a52l、q131c突变残基对优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v的热稳定性有提升作用。
71.将s30p、t31h、k41r、a52l、q131c以s30p，s30p/t31h，s30p/t31h/a52l，s30p/t31h/a52l/k41r，s30p/t31h/a52l/q131c迭代组合方式分别引入上述优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v当中，得到优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p(核酸序列如seq id no:9所示，蛋白序列如seq id no:10所示)；优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h(核酸序列如seq id no:11所示，蛋白序列如seq id no:12所示)；优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l(核酸序列如seq id no:13所示，蛋白序列如seq id no:14所示)；xyn370-q14h/d29s/a203v-s30p/t31h/a52l/k41r(核酸序列如seq id no:15所示，蛋白序列如seq id no:16所示)；优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/q131c(核酸序列如seq id no:17所示，蛋白序列如seq id no:18所示)。
72.通过一系列改造，本发明人得到了多株热稳定极大提升的优选突变株，但发现在提升热稳定性的同时，它们的比酶活也不可避免的下降，为了平衡热稳定性与比酶活之间的关系，在优选突变株xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l的基础上，对q14h，d29s，a203v三个可能对酶活力有影响的位点分别进行了回复突变，获得了酶活力不同程度提高的优选突变株xyn370-q14/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l(核酸序列如seq id no:19所示，蛋白序列如seq id no:20所示)；xyn370-q14h/d29/a203v/s30p/t31h/a52l(核酸序列如seq id no:21所示，蛋白序列如seq id no:22所示)；xyn370-q14h/d29s/a203/s30p/t31h/
a52l(核酸序列如seq id no:23所示，蛋白序列如seq id no:24所示)；xyn370-q14/d29s/a203/s30p/t31h/a52l(核酸序列如seq id no:25所示，蛋白序列如seq id no:26所示)。
73.本发明还提供了编码本发明木聚糖酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
74.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
75.编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0076]“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0077]
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或木聚糖酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
[0078]
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的木聚糖酶突变体。一般来说有以下步骤：
[0079]
(1).用本发明的编码木聚糖酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0080]
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0081]
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0082]
本发明中，木聚糖酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0083]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含木聚糖酶突变体编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0084]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0085]
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。
[0086]
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。在本发明的优选方式中，所用的表达载体为pet28a；所述表达载体转化的微生物宿主细胞均为大肠杆菌。
[0087]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下
进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0088]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0089]
本发明的木聚糖酶可作用于木聚糖长链分子的内部，以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为简单糖(如木寡糖)。
[0090]
如本文所用，所述的“简单糖”广义地指木聚糖链被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖含有1-50个木糖，较佳的，含有1-30个木糖；更佳的，含有1-15个木糖；更佳地含有1-10个木糖，如2，3，4，5，6，7，8，9个木糖。所述的简单糖包括：单糖、木二糖、木三糖、木四糖等。本发明中，所述的简单糖又指：低聚木糖、少量木糖、木寡糖。
[0091]
在获得了本发明的木聚糖酶突变体酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物(特别是木聚糖)的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种降解木聚糖的方法，该方法包含：用本发明所述的木聚糖酶突变体酶处理待水解的底物，所述的底物包括但不限于山毛榉木聚糖，玉米芯木聚糖，燕麦皮木聚糖等。在本发明的选方式中，本发明的木聚糖酶在高温下的进行对底物的降解或酶切；较佳地，所述的高温为45～95℃；较佳地50～90℃，如55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃。
[0092]
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的木聚糖酶突变体以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中木聚糖酶突变体的有效量。
[0093]
所述的组合物中还可添加调节本发明的木聚糖酶突变体酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。例如，一些可能可以提高本发明的木聚糖酶突变体酶活性的物质从包括下组中选择和验证：k

、mg
2
、cu
2
、co
2
、k

、mn
2
、cu
2
、co
2
、ni
2
、zn
2
、fe
3
、edta等的物质。
[0094]
本发明所述的木聚糖酶突变体、含有其的组合物，表达其的细胞等，可被包含在试剂盒中，以便于扩大化应用或商业应用。较佳地，所述试剂盒中还可包含使用说明书，以指导人们的应用。
[0095]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0096]
材料和方法
[0097]
培养基及培养基配方
[0098]
lb液体培养基：酵母提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l。
[0099]
lb固体培养基：酵母提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，琼脂2g/l。
[0100]
蛋白表达纯化
[0101]
将含有木聚糖酶野生型或优选突变体表达载体的宿主bl21单克隆挑至lb试管当中，37℃，180r/min摇过夜，然后转接至lb三角瓶中，37℃，180r/min摇至od600到0.4-0.6时，冰上放置10min，添加iptg至终浓度40um，16℃，110r/min诱导16h。诱导结束后，离心收集菌体，用裂解缓冲液(50mm nah2po4，300mm nacl，10mm咪唑，ph＝8.0)重悬，压榨。用购自上海翊圣的ni柱纯化粗酶液，20mm咪唑洗杂，200mm咪唑洗脱，收集洗脱液，进行蛋白sds-page电泳检测。
[0102]
木聚糖酶酶活力测定中所用的试剂dns配制方法
[0103]
木聚糖酶酶活力测定包括野生型和突变体的测定。称取10g naoh，溶解于大约400ml ddh2o中，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于大约300ml ddh2o中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。
[0104]
木聚糖酶酶活力中所用底物配制
[0105]
底物选择：山毛榉木聚糖(购自sigma)，山毛榉木聚糖(购自megazyme，玉米芯木聚糖，燕麦皮木聚糖。
[0106]
以购自sigma的山毛榉木聚糖为例，其余均同。
[0107]
称取0.5g山毛榉木聚糖(购自sigma)至20ml 0.1％naoh中，70℃水浴搅拌1.5h，然后添加0.2m乙酸缓冲液(ph＝6.0)至45ml，用冰醋酸调至ph 6.0，最后用0.2m乙酸缓冲液定容至50ml，使其终浓度为1％(w/v)。
[0108]
木聚糖酶酶活力测定方法
[0109]
底物选择：山毛榉木聚糖(购自sigma)，山毛榉木聚糖(购自megazyme)，玉米芯木聚糖，燕麦皮木聚糖。
[0110]
以购自sigma的山毛榉木聚糖为例，其余均同。
[0111]
50μl 1％山毛榉木聚糖(购自sigma) 50μl已经稀释合适倍数的酶液，混匀后于37℃反应10min，然后加入100μl dns终止反应，对照为在上述反应体系中先加入100μl dns后再加酶液，于95℃下显色反应10min，最后用酶标仪测定540nm波长下的吸光值，并换算成相应酶活单位。
[0112]
酶活力单位(u)定义
[0113]
1u为每分钟催化水解木聚糖产生1μmol木糖所需的酶量。
[0114]
实施例1、第一轮突变文库构建及筛选
[0115]
随机突变文库构建：利用genemorph ii random mutagenesis kit易错pcr试剂盒对木聚糖酶野生型编码基因xyn11(seq id no:1)进行随机突变(pcr具体反应程序参照genemorph ii random mutagenesis kit)，将突变后的目的基因片段胶回收，然后用vazyme clonexpress ii one step cloning kit重组到pet28a载体中，电转化到大肠杆菌bl21感受态中并涂布含kana抗生素的lb固体平板，37℃孵育过夜。用牙签将孵育过夜的转化子挑至含有kana抗生素的lb液体培养基96孔培养板中，37℃孵育12h后，以1％接种量转接至新的lb液体96孔板，添加iptg至终浓度为2mm，37℃诱导12h。
[0116]
随机突变文库的筛选：将37℃诱导12h的96孔板进行离心，移除培养基，然后每孔加入50ul pbs缓冲液进行重悬，之后65℃处理2.5h。热处理结束后，加入50ul 1％山毛榉木聚糖，37℃反应10分钟，加入100ul dns终止反应，95℃显色10分钟后转入96孔酶标板中读
取od540。od540比野生型高的记为阳性转化子，挑出保菌做进一步验证。该轮文库覆盖10000个转化子。
[0117]
优选突变体的热稳定性验证：从10000个转化子中，本发明人筛选得到5株较之野生型xyn11热稳定性有较大提高的优选突变体，对这5株优选突变体进行表达纯化后测定热稳定性。第一轮随机突变文库中的优选突变体在65℃热处理不同时间后残余酶活(％)如表1，可以看出优选突变体xyn68热稳定性最佳，选为该轮的最优选突变体。
[0118]
表1
[0119][0120]
实施例2、第二轮随机突变文库的构建与筛选
[0121]
以第一轮的优选突变体xyn68为模板，利用genemorph ii random mutagenesis kit易错pcr试剂盒对xyn68编码基因进行随机突变，其后续构建方法与第一轮随机突变文库构建方法无异。筛选方法除了将第一轮的65℃处理2.5h变为80℃30min，其余均与第一轮的筛选方法保持一致，该轮文库覆盖20000个转化子。优选突变体纯化后进行热稳定验证，优选突变体在70℃热处理不同时间后残余酶活(％)结果如表2，xyn370为该轮优选突变体。
[0122]
表2
[0123]
[0124]
实施例3、定点突变
[0125]
对上面两轮随机突变中的优选突变体(包括xyn68和xyn370，但不限于xyn68和xyn370)进行测序及分析，本发明人发现，q14h，l28v，d29a，n30s，s93a，r97l，v99l，k133e，e159g，a187d，g192d，a203v等氨基酸位点出现频率较频繁，推测对木聚糖热稳定性有提升作用，随后将上述位点逐一以定点突变的方式(定点突变程序参照hieff mut
tm site-directed mutagenesis kit)引入到木聚糖酶野生型xyn11当中。木聚糖酶野生型引入14h，29a，203v突变位点后经70℃热处理不同时间后残余酶活(％)如表3所示。
[0126]
表3
[0127][0128]
从表3可以看出，q14h，d29a，a203v对野生型xyn11热稳定性有提升作用。
[0129]
为进一步测定该三个氨基酸位点对木聚糖酶热稳定性是否有重要影响，本发明人将这三个位点以单突变以及双突变，三突变组合方式引入第二轮随机突变中的优选突变体xyn370当中。木聚糖酶突变体xyn370引入14h，29a，203v突变位点后经75℃热处理不同时间后残余酶活(％)如表4。
[0130]
表4
[0131][0132]
从表4可以看出，三突变优选突变体xyn370-q14h/d29a/a203v较之野生型xyn11及出发菌株xyn370，其热稳定性有极为显著的提高。xyn370-a203v/q14h双突变体比之野生型以及单突变体，其热稳定性也有一定的提高。
[0133]
实施例4、优选突变体xyn370-q14h/d29a/a203v饱和突变
[0134]
用hieff mut
tm site-directed mutagenesis kit定点突变试剂盒对实施例4中的优选突变体xyn370-q14h/d29a/a203v的第14位、29位、203位分别进行饱和突变：将14位氨基酸残基q替换成除h外的另18种氨基酸残基；将29位氨基酸残基d替换成除a外的另18种氨基酸；将203位氨基酸残基v替换成除a外的另18种氨基酸。木聚糖酶突变体xyn370-q14h/
d29a/a203v第29位饱和突变后经80℃处理不同时间后的残余酶活(％)如表5。
[0135]
表5
[0136][0137]
从表5可以看出，将29位的残基d替换成s后，突变体xyn370-q14h/d29s/a203v的热稳定性又进一步呈现极为显著的提高，故在实施例4中得到优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v。
[0138]
实施例5、优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v的理性设计
[0139]
登录蛋白质结构数据库protein datebank(https://www.rcsb.org/)，经blast比对后选取与优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v三维结构具有高度高度同源的晶体结构作为模板，然后利用在线服务器进行同源建模，获取优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v 3d结构图。利用在线服务器对优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v三维结构模型进行b-factor值预测，获得各残基的b-factor值。优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v中高b-factor值氨基酸残基如表6。
[0140]
表6
[0141]
残基序号3031415253108109110130170b-factor值29.2130.2232.1730.8730.88333.9235.2933.3430.7130.36
[0142]
根据表6，选取其中b-factor值较高的残基分别进行饱和突变构建突变文库。
[0143]
饱和突变方法与上述实施例4一致，文库筛选方法与上述实施例1或实施例2一致。从突变文库中本发明人进一步筛选得到其中s30p、t31h、k41r、a52l、q131c位点的突变对优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v的热稳定性有提升作用，随后以s30p，s30p/t31h，s30p/t31h/a52l，s30p/t31h/a52l/k41r，s30p/t31h/a52l/q131c迭代组合方式分别引入优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v当中，表达纯化后测定其热稳定性。优选木聚糖酶突变体xyn370-q14h/d29s/a203v引入不同突变位点后热处理不同时间后的残余酶活(％)如表7(表中，xyn370-q14h/d29s/a203v简称xyn370-a29s)。
[0144]
表7
[0145][0146]
从表7可以看出，突变体xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p，xyn370-q14h/d29s/
a203v-s30p/t31h，xyn370-q14h/d29s/a203v-s30p/t31h/a52l，xyn370-q14h/d29s/a203v-s30p/t31h/a52l/k41r，xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l/q131c的热稳定性较之实施例4、实施例5或实施例6中的出发菌株优选突变体xyn370-q14h/d29s/a203v均有不同程度的提高，其中突变体xyn370-q14h/d29s/a203v-s30p/t31h/a52l，xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l/k41r在85℃热处理20min后，其残余酶活分别为85.90％
±
5.24％，80.27％
±
1.33％，而xyn370-q14h/d29s/a203v仅剩4％左右，热稳定性有显著提升。
[0147]
实施例6、木聚糖酶突变株比酶活力测定及xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l回复突变
[0148]
以山毛榉(购自sigma)木聚糖为底物，37℃条件下测定了野生型及优选突变株的比酶活力，单位为u/mg、木聚糖酶突变株比酶活力如表8所示(表中xyn370-q14h/d29s/a203v简称xyn370-a29s)。
[0149]
表8
[0150][0151]
从表8可以看出，优选突变株的比酶活力均下降，在蛋白热稳定性改造中，热稳定性的提高往往不可避免以牺牲酶活力为代价。为了平衡酶活力与热稳定性之间的关系，本发明人将热稳定性最佳的优选突变株xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l的q14h，d29s，a203v分别进行了回复突变成q14，d29，a203，并测定了其在85℃条件下的经不同时间处理后的残余酶活变化及比酶活。xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l回复突变经85℃热处理不同时间后的残余酶活(％)及比酶活力测定(u/mg)如表9。
[0152]
表9
[0153][0154]
从表9可以看出，将q14h，d29s，a203v分别回复突变成q14，d29，a203后，较之出发菌株xyn370-q14h/d29s/a203v/s30p/t31h/a52l，其热稳定性均下降，中d29热稳定性下降最明显，a203影响最小。但较之出发菌株，其比酶活力均上升，其中q14上升最大，由出发菌株的593.2
±
2.7上升至1158.8
±
24.4，证实了q14，d29，a203三个位点对木聚糖酶的酶活力有重大影响。
[0155]
随后，本发明人同时将q14和a203回复突变，构建了突变株xyn370-q14/d29s/a203/s30p/t31h/a52l，其比酶活力进一步提高(1554.7
±
156.8，表9)。
[0156]
综上，野生型及突变体序列信息汇总如图1-1～图1-13。
[0157]
本发明的突变株可供在实际应用中进行合理选择，可以更好地权衡热稳定性与酶活力之间的关系，根据实际生产要求，选择合适的突变株以达到目的。
[0158]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。