用于颗粒表征的方法和系统与流程

1.本发明涉及颗粒表征领域。更具体地，本发明涉及通过光学纳米运动检测对诸如活细胞的颗粒的表征。
现有技术
2.在世界范围内广泛且通常不受控制地使用广谱抗微生物药物促进了抗性菌株的出现，该抗性菌株构成全球健康、食品安全和发展的最大威胁之一。合理化使用广谱抗生素和抗真菌剂的选择之一在于采用快速敏感性检测测试，其在患者进入医疗中心时立即鉴定对抗给定微生物的最适当药物。这样的早期诊断应当允许立即开始最合适的治疗，并且避免使用被证明诱导抗性的广谱药物。标准的抗微生物易感性测试(ast)方法依赖于在24h至48h期间在抗真菌剂存在下测量细菌或真菌生长。
3.几年前，基于原子力显微镜(afm)的纳米机械传感器在几分钟的时间范围内评估化学物质对细菌的生存力的影响。
4.检测基于以下观察：活生物体以纳米尺度振荡并将这些振荡传递到它们所附着的afm悬臂。只要生物体还活着，这些振荡就会持续，但是一旦细胞的生存力受到任何化学或物理手段的损害，这些震荡就会停止。
5.这些振荡存在于活细菌及其细胞器例如线粒体和细胞核、酵母、植物和哺乳动物细胞中。通过将微生物附着在afm悬臂上并且根据不同抗微生物药物监测其振荡来进行抗生素或抗真菌剂敏感性测试。最近，已经开发了用于抗微生物易感性测试(ast)的其他纳米运动方法。这些纳米运动方法基于细菌的z运动的等离子体成像，跟踪附着细菌的亚微米尺度xy运动，用共振晶体的相位噪声感测附着细菌的振动，以及对附着细菌进行亚细胞波动成像(基于全内反射显微镜方法)。这些纳米运动方法可以在几分钟到几小时的时间范围内完成完全的抗生素敏感性测试，而传统的基于细胞培养的技术在生物体缓慢生长的情况下需要几天或几周。然而，所有这些方法都有若干缺点，其中最具挑战性的是将关注的生物体附着在表面上。


技术实现要素：

6.本发明的实施方式的目的是提供用于表征颗粒例如细胞的良好方法和系统。
7.本发明的实施方式的优点在于，颗粒的表征可以提供关于颗粒的生存力和/或代谢活动性的信息。
8.本发明的实施方式的优点在于，该方法和系统适用于多种颗粒，例如活细胞。在一些实施方式中，该表征例如可以用于生物技术应用、临床微生物学、抗生素/抗真菌剂易感性测试、细胞生存力的表征、代谢监测、诊断和药物筛选以及基础研究。
9.本发明的实施方式的优点在于，可以以高通量方法执行颗粒例如细胞的表征。
10.本发明的实施方式的优点在于，不需要标记颗粒来表征它们。
11.本发明的实施方式的优点在于，可以在不需要将颗粒例如细胞附着到表面例如机
械对象的表面或更大颗粒的表面的情况下执行颗粒的表征。
12.本发明的实施方式的优点在于，该系统和方法是独立于生长的并且独立于细胞复制/分裂的速度的，因此测量的持续时间可以较短。
13.本发明的实施方式的优点在于，可以用相对简单的测量系统来执行颗粒的表征。
14.本发明的实施方式的优点在于，可以在不需要将颗粒连接到表面的情况下执行颗粒的表征。后者导致不需要用于将颗粒与表面连接的接头分子的事实。这避免了一些颗粒在将它们与已知的接头分子连接时出现的问题，或者避免了一些接头分子对颗粒产生负面影响而出现的问题。
15.本发明的实施方式的优点在于，细胞的表征和/或分析可以以自动方式和/或自动地执行。
16.本发明的实施方式的优点在于，可以以例如在微孔中比如在微孔板中或在液滴微流体中的多种方式应用方法和系统来表征颗粒。
17.本发明的实施方式的优点在于，可以应用方法和系统来表征多个颗粒以及表征各个颗粒。
18.本发明的实施方式的优点在于，该方法和系统可以用于表征多个颗粒，例如多个细胞。在一个实施方式中，该方法和系统可以用于执行单细胞癌细胞筛选。在一个实施方式中，该方法和系统可以例如应用于细菌细胞或酵母细胞、植物细胞和细胞器例如线粒体和细胞核。在一个实施方式中，该方法和系统可以例如应用于动物细胞例如癌细胞。
19.本发明的实施方式的优点在于，可以执行对癌细胞或肿瘤细胞的化学治疗药物的反应。本发明的实施方式的优点在于，可以应用该方法和系统来执行筛选，例如测试哪些药物可以杀死肿瘤中的大部分或全部癌细胞。
20.本发明的实施方式的优点在于，可以应用方法和系统来确定剂量-反应曲线和/或确定最小抑制浓度(mic)和/或确定最小杀真菌浓度(mfc)和/或或确定最小抑菌浓度(mbc)。
21.本发明的实施方式的优点在于，可以应用方法和系统来确定植物细胞对农药的抗性或农药对植物细胞的有效性。
22.因此，在特定实施方式中，该方法可以用于确定要使用的特定抗生素/抗真菌剂以治疗由细菌或真菌引起的特定感染或确定微生物分离株的抗微生物抗性谱，并且指导抗微生物治疗决定。
23.本发明的实施方式的优点在于，可以显著减少样本的运输时间和测试时间，使得可以避免延迟抗性病原体的诊断时间和决定合适和有效的抗微生物治疗。这可以导致患者死亡率的降低、更好的临床结果、广谱抗微生物剂的较少使用和相应地对抗微生物剂的抗性的降低。
24.本发明的实施方式的优点在于，可以执行快速的抗微生物易感性测试，可以使用个性化治疗(使用窄谱抗微生物施用)以及可以在可能的最早治疗阶段给予治疗。
25.本发明的实施方式的优点在于，与游动细胞和非游动细胞一起工作。
26.在一个方面，本发明可以涉及一种用于得出颗粒特性的方法，该方法包括：
27.对液体环境中的至少一个自由漂浮的颗粒在至少一个时刻处的移动进行成像，
28.针对至少一个时刻、基于液体环境中的自由漂浮的颗粒的经成像的移动来确定至
少一个移动参数，以及
29.从至少一个移动参数得出至少一个颗粒的特性。
30.应当注意，该方法可以包括单个颗粒的单个特性的得出、单个颗粒的两个或更多个特性的得出、两个或更多个颗粒的单个特性的得出、或两个或更多个颗粒的两个或更多个特性的得出。
31.因此，所述至少一个颗粒可以包括多个颗粒。本方法因此给出了对一个颗粒以及一组颗粒的特性的洞察。例如，该方法可以用于确定一个或更多个颗粒与多个颗粒中的其他一个或更多个颗粒的特性相比的特性。例如，本方法可以用于确定细胞群或组中的哪些细胞对药物具有抗性而哪些不具有抗性。
32.关于单个特性提供的陈述和解释同样适用于两个或更多个特征的情况，反之亦然。同样，关于单个颗粒的陈述同样适用于两个或更多个颗粒的情况，反之亦然。
33.为此，可以想到，单个颗粒的移动在至少一个时刻处被成像，或者两个或更多个颗粒特别是多个颗粒的移动优选地在至少一个时刻处被共同成像。在这种情况下，应当注意，可以同时得出两个或更多个颗粒的个体特性。即，并且如以下将更详细地解释的，通过记录例如两个颗粒的一个或更多个图像并且通过随后分析所述一个或更多个图像，可以得出与颗粒中之一相关联的特性以及得出与另一颗粒相关联的特性。
34.此外，可以想到，一个或更多个颗粒的移动被重复成像。
35.该方法可以包括：
36.对液体环境中的至少一个自由漂浮的颗粒在至少多个时刻处的移动进行成像，
37.针对所述多个时刻中的每一个、基于自由漂浮的颗粒的经成像的移动来确定移动参数，以及
38.从不同的所述移动参数得出至少一个颗粒的特性。
39.期间一个或更多个颗粒的移动被成像的至少一个时刻优选地对应于毫秒到分钟例如1毫秒到60分钟范围的时间段。因此，可以想到，期间颗粒的移动被成像的至少时刻对应于1秒或更长的时间段，更优选地对应于5秒或更长的时间段，甚至更优选地对应于10秒或更长的时间段。然而，同样能够想到更长的时间段例如120秒或更长的时间段。
40.优选地，至少一个自由漂浮的颗粒的移动作为时间的函数而被成像，并且其中，移动参数被确定为时间的函数。
41.因此，该方法可以包括将至少一个颗粒的移动作为时间的函数而成像的步骤。作为结果，该方法能够确定与至少一个颗粒相关联的作为时间的函数的特性。
42.该方法可以包括i)对至少一个自由漂浮的颗粒在至少两个时刻处的移动进行成像，由此获得至少第一经成像的移动和第二经成像的移动，以及ii)确定第一经成像的移动与第二经成像的移动之间的改变，并且其中，所述改变指示移动参数。
43.也就是说，优选的是检测颗粒的移动的两个或更多个图像并且确定所述图像的改变，其中，所述改变指示一个或更多个移动参数。然后可以从所述一个或更多个移动参数得出颗粒的一个或更多个特性。换言之，该方法使得能够通过记录两个或更多个图像来得出一个或更多个颗粒的一个或更多个特性。
44.进一步优选的是，两个连续图像紧接着一个接一个地或相对于彼此暂时延迟地被记录。两个连续图像的记录之间的时间延迟优选地为至少1毫秒或更长，更优选地为至少1
秒或更长，甚至更优选地为至少1分钟或更长，例如30分钟或更长，或至少60分钟或更长。
45.该改变优选地对应于自由漂浮的颗粒的空间位移和/或与自由漂浮的颗粒的空间位移相关联的速度和/或与自由漂浮的颗粒的空间位移相关联的加速度和/或自由漂浮的颗粒的空间位移的分布和/或与自由漂浮的颗粒的空间位移相关联的速度的分布和/或与自由漂浮的颗粒的空间位移相关联的加速度的分布。
46.该至少一个颗粒可以是至少一个细胞和/或至少一个细胞器。该至少一个颗粒优选地为至少一个活细胞和/或至少一个活细胞器。该至少一个细胞可以是原核细胞和/或真核细胞。该至少一个细胞也可以是游动细胞和/或非游动细胞。该至少一个细胞优选地是细菌细胞和/或真菌细胞，例如酵母细胞，和/或哺乳动物细胞和/或昆虫细胞和/或植物细胞。该至少一个细胞器优选地是线粒体和/或细胞核或任何其他亚细胞结构。可以以一组细胞的形式提供多个颗粒。为此，例如可以从活组织检查中获得若干细胞的聚集体。
47.有生命物质表现出不同于死亡物质或受损物质的另一种行为，这尤其表现在物质的位移行为中。通过得出空间位移或通过推导进一步的性质或量，例如相关联的速度或相关联的加速度或位移或速度或加速度的分布，可以得出关于物质的状况的信息。例如，与活动细胞的空间位移相比，死细胞或受损细胞的空间位移减少。此外，已经确定空间位移或与空间位移相关联的速度或加速度的非对称分布可以归因于活动细胞的非随机行为。非活动细胞或死细胞又表现出其空间位移和/或速度和/或加速度的小且相当对称的分布。
48.至少一个颗粒的特性可以是至少一个颗粒的生存力或代谢活动性或代谢活动性水平或代谢状态或活力或敏感性或抗性。抗性优选地对应于对药物的抗性，例如抗菌抗性和/或抗真菌剂抗性和/或抗癌抗性。
49.从所述移动参数得出至少一个颗粒的特性可以包括：将颗粒的移动量——特别是颗粒的平移和/或旋转和/或变形量——与至少一个颗粒的生存力和/或代谢活动性和/或代谢活动性水平和/或活力和/或敏感性和/或抗性成比例纳入考虑。
50.该方法可以包括得出至少一个颗粒的颗粒活动性和/或生存力和/或代谢活动性和/或代谢活动性水平和/或代谢状态和/或活力和/或敏感性和/或抗性。该方法优选地包括得出至少一个颗粒对药物的抗性，例如抗菌抗性和/或抗真菌剂抗性和/或抗癌抗性。
51.因此，优选的是确定以下中的至少一个以获得至少一个移动参数：空间位移、与空间位移相关联的速度、与空间位移相关联的加速度、空间位移的分布、与空间位移相关联的速度的分布、以及与来自颗粒的两个或更多个经成像的移动的空间位移相关联的加速度，并且其中，颗粒的至少一个特性然后由所述一个或更多个移动参数确定。
52.为此，特别优选的是，空间位移和/或与空间位移相关联的速度和/或与空间位移相关联的加速度和/或空间位移的分布和/或与空间位移相关联的速度的分布和/或与空间位移相关联的加速度的分布对应于至少一个移动参数。
53.进一步优选的是，空间位移和/或与空间位移相关联的速度和/或与空间位移相关联的加速度和/或空间位移的分布和/或与空间位移相关联的速度的分布和/或与空间位移相关联的加速度的分布被确定为时间的函数。
54.此外，优选的是，关于至少一个空间方向而确定空间位移。特别地，可以仅关于单个空间方向而确定空间位移以及因此相关联的量例如速度和/或加速度。然而，同样能够想到关于两个或更多个空间方向而确定空间位移以及因此相关联的量例如速度和/或加速
度。所述两个或更多个空间方向优选地彼此垂直地延伸。
55.因此，能够想到，仅关于单个空间方向而确定空间位移，从哪个空间位移推导移动参数，或者哪个空间位移对应于移动参数。例如，所述空间方向可以被称为x方向并且关于x方向的空间位移可以被称为x移动或x位移或x运动。因此，应当注意，本文所指的移动可以被理解为位移和运动，反之亦然。
56.当至少一个颗粒在易受流的液体环境中被提供时，优选地关于所述颗粒的单个空间方向而确定空间位移或相关联的量。事实上，优选的是使液体环境沿空间方向流动并且测量颗粒关于另一空间方向的空间位移。例如，液体环境可以沿x方向流动，并且颗粒的空间位移可以关于与x方向垂直的y方向而确定。液体环境优选地易受存在于微流体设备的通道内的强制对流，例如强制层流或强制湍流，也进一步参见下文。
57.然而，同样能够想到，关于两个空间方向而确定空间位移，从哪个空间位移推导移动参数，或者哪个空间位移对应于移动参数。例如，所述两个空间方向可以被称为x方向和y方向，并且其中，关于x方向和y方向的空间位移可以被称为x、y移动或x、y位移或x、y运动。
58.同样能够想到，关于三个空间方向而确定空间位移，从哪个空间位移推导移动参数，或者哪个空间位移对应于移动参数。例如，所述三个空间方向可以被称为x方向、y方向和z方向，并且其中，关于x方向、y方向和z方向的空间位移可以被称为x、y、z移动或x、y、z位移或x、y、z运动。
59.x方向、y方向和z方向可以参考笛卡尔坐标系，其中，可以说x方向和y方向跨越水平平面，即xy平面。此外，x方向和y方向可以关于z方向垂直地延伸。z方向也可以被称为垂直方向以及一个或更多个颗粒的成像沿其发生的方向。然而，为了提供坐标参考系，也可以使用任何其他系统。例如，极坐标系和/或圆坐标系和/或圆柱坐标系同样是可能的。
60.该方法可以包括得出至少一个颗粒的x移动和/或y移动和/或z移动和/或x、y移动和/或x、y、z移动。
61.该方法可以包括在纳米到微米的范围内，例如在约1纳米到1000微米的范围内，更优选地在约1纳米到100微米的范围内，关于一个或更多个空间方向中的每一个而得出至少一个颗粒的空间位移。为此，因此优选的是，该方法能够对以下进行成像：至少第一经成像的移动与第二经成像的移动之间在约1纳米到1000微米的范围内，更优选地在约1纳米到500微米的范围内，特别优选地在约100纳米到100微米的范围内关于至少一个空间方向的空间位移。
62.该方法还可以包括确定空间位移的量和/或相关联的量的量，并且其中，从所述量得出颗粒的特性。
63.从所述量——即颗粒关于空间方向中的一个或更多个空间方向移动的距离或相关联的速度或加速度的量——可以得出关于颗粒的状况的信息，也参见上文。另外地或可替选地，该方法还可以包括确定特定时间段内的空间位移的量。换言之，优选的是确定颗粒在特定时间段内关于一个或更多个空间方向移动的一个或更多个距离——优选地总距离。然后可以从所述距离得出关于颗粒的状况的信息。
64.空间位移可以经受空间至频率转换以便获得与所述空间位移相关联的一个或更多个频率，并且其中，从所述一个或更多个频率得出颗粒的特性。
65.特别地，优选的是在第一步骤中确定作为时间的函数的颗粒的空间位移，并且然
后将所述空间位移转换到频域中。例如，已经确定活细胞在与死细胞不同的频率范围内振荡。因此，与空间位移相关联的频率的确定也使得能够确定所研究的颗粒的状况。
66.鉴于以上，因此可以说该方法可以包括计算空间位移的速度和/或确定空间位移的分布和/或执行频域分析。
67.在该上下文中，优选的是，该方法还包括使用转换算法以将作为时间的函数的颗粒的移动转换到频域中，由此获得与颗粒的经成像的移动相关联的一个或更多个振荡频率。所述转换算法优选地执行从空间到频域的转换，例如傅立叶变换等，进一步参见下文。
68.移动可以是振荡，并且其中，移动参数是振荡移动参数。
69.优选地通过常规统计分析例如所谓的小提琴图和/或箱形图的生成来确定空间位移的分布。同样，优选地借助于已知方法例如快速傅立叶变换(fft)或小波来执行频域分析。因此，该方法优选地包括使用能够执行这些分析和计算中的一个或更多个的一个或更多个对应算法。
70.空间位移优选地对应于自由漂浮的颗粒的平移和/或自由漂浮的颗粒的旋转和/或自由漂浮的颗粒的变形。旋转可以被称为颗粒关于空间方向中的一个或更多个空间方向表现出的角位移。优选地以圆柱坐标指示角位移。
71.颗粒的变形可以被理解为颗粒的形状的改变。例如，形状的改变可以由细胞内渗透压的改变、细胞内细胞骨架的重排、胞质空间的体积的改变、细胞核的体积的改变引起。这样，可以从对形状的改变或变形的分析中得出关于细胞的状况的信息。
72.可以确定至少一个颗粒的整体移动。为此，能够想到确定整个自由漂浮的颗粒的空间位移。整个自由漂浮的颗粒的空间位移优选地根据颗粒的质心的空间位移来确定。
73.然而，同样能够想到确定自由漂浮的颗粒的至少一部分的空间位移。自由漂浮的颗粒的至少一部分的空间位移优选地根据颗粒的形状的修改来确定。换言之，颗粒的一部分的空间位移优选地针对颗粒的静止质心得出。例如，颗粒的一部分的空间位移可以是由细胞内渗透压的改变、细胞骨架的重排和/或细胞器位移引起的细胞的形状的变形。
74.该方法可以包括使用包括颗粒或颗粒的一部分的区域来检测至少一个颗粒。
75.分析可以包括确定整个颗粒的移动、确定颗粒壁位移和细胞器位移中的任何一个或组合。
76.可以使用互相关算法来确定空间位移。能够想到的互相关算法在本领域中是公知的。为此，优选的是，对以亚像素分辨率检测的位移或运动或移动进行比较。特别地，以亚像素分辨率检测关于空间方向中的一个或更多个空间方向的改变，并且其中，所述数据集用于频域和/或时域中的分析。
77.该方法可以包括基于对纳米运动的分析来进行互相关。
78.表述纳米运动这里是指由所研究的颗粒表现出的运动，即移动或位移。取决于颗粒的类型，所述运动可以在纳米范围内。
79.该方法可以包括对描绘至少一个颗粒在至少一个时刻处的移动的一个或更多个图像进行互相关。特别优选的是使至少一个颗粒的连续图像互相关。
80.该方法因此可以包括使用互相关算法。
81.互相关算法使得能够量化至少一个颗粒的移动，特别是关于一个或更多个空间方向例如x方向和/或关于y方向和/或关于z方向量化移动。关于x方向的量化被理解为与所研
究的颗粒关于x方向等的移动相关联的数值。为此，互相关算法优选地被配置成针对每个图像即帧计算与关于的空间方向的移动有关的数值。
82.通过量化颗粒的移动的改变，颗粒的特性改变，例如其生存力或代谢活动性水平改变，代谢状态例如休眠、静止细胞、对不同化学物质的敏感性或抗性改变。
83.该方法还可以包括执行一个或更多个统计分析，例如小提琴图和/或箱形图。例如，能够想到将颗粒的经成像的移动——特别是每帧的经成像的移动——绘制为小提琴图和/或盒须图，也进一步参见下文。
84.可以根据单个颗粒的经成像的移动确定移动参数。自然地，可以根据两个或更多个颗粒的经成像的移动确定两个或更多个移动参数，其中，每个移动参数与特定颗粒相关联。然而，同样能够想到，根据两个或更多个颗粒、优选地多个颗粒的经成像的移动确定移动参数，并且其中，使用与空间位移和/或相关联的速度或者空间位移或速度的分布相关联的均值或平均值。当应当研究若干颗粒例如细胞群时，优选地应用该后一情况。
85.该方法还可以包括针对移动参数的确定而选择一个或更多个颗粒，其中，所述选择对应于人工选择和/或自动选择。例如，当人工选择一个或更多个颗粒时，用户可以在用于关于一个空间方向(例如x方向)的位移的颗粒的至少一部分上绘制方框或圆圈或任何其他选择标记以跟踪关于所述x方向的位移，并且在用于关于第二空间方向(例如y方向)的位移的颗粒的至少一部分上绘制第二方框。自动选择优选地通过应用一个或更多个形态学算子和/或霍夫(hough)变换和/或神经网络和/或深度学习技术来执行。
86.因此，特别是在应当单独研究一个或更多个单个颗粒的情况下，优选的是从图像中选定或选择所述一个或更多个单个颗粒。如刚才说明的，所述选择可以人工进行或借助于本领域公知的一个或更多个算法来进行。
87.鉴于以上，因此可以说该方法可以包括使用至少一种算法来选择一个或更多个颗粒和/或来确定至少一个颗粒的移动参数例如空间位移和/或来量化至少一个颗粒的移动参数例如空间位移。
88.该方法可以包括使用神经网络。所述神经网络可以应用于在诸如细胞的颗粒的位移、纳米运动被检测之前对该颗粒的选择。神经网络操作以生成模拟颗粒的多个合成图像，并且将这样的合成图像提供给颗粒检测模型以用于训练模型和更新模型，评估模型并改进该模型，以获得训练模型。
89.该方法可以包括使用训练模型对至少一个颗粒的检测。
90.该方法可以包括对使用训练模型对至少一个颗粒的检测进行细化。
91.该方法可以包括使用深度学习技术。深度学习技术优选地对应于操作以检测各个颗粒并且跟踪各个颗粒的运动的算法。
92.然而，也可以使用本领域中使用的不同图像识别算法。
93.至少一个自由漂浮的颗粒可以在静止液体环境中和/或在流动液体环境中被提供。流动液体环境可以被理解为移动的液体环境，例如沿流动方向流动的液体。为此，优选的是液体环境易受流，特别优选地易受强制对流，使得其成为流动液体环境。因此，能够想到液体环境易受人造流。
94.至少一个自由漂浮的颗粒可以是未接合至对象的表面或更大颗粒的表面的颗粒。而是，自由漂浮的颗粒优选地是分散在液体环境中的颗粒。液体环境可以在诸如腔室或储
存器或通道的限制元件中被提供，优选地在微流体设备的通道中。换言之，能够想象颗粒沉积到诸如微观分析室或宏观分析室的分析室中，或培养皿中，或微流体通道中。因此，限制元件被理解为一种物理结构，其包括或包含被添加颗粒的液体。限制元件优选地未经处理。未处理的限制元件被理解为未关于颗粒到限制元件的附着或链系而修改的限制元件。因此，颗粒将不会附着或链系到限制元件，而是自由漂浮的。
95.然而，同样能够想到以无限制的方式提供液体环境。例如，如以下将进一步说明的，被添加颗粒的液体可以直接放置在用于对颗粒的移动进行成像的光学传感器上。例如，可以借助于放置在光学传感器上的小液滴或大液滴来提供液体环境。同样在这种情况下，颗粒没有被链系或附着到任何表面等，而是自由漂浮的。
96.液体环境可以是扩散环境，其中，颗粒的移动不被对流干扰。换言之，颗粒的移动优选地在没有对流的情况下成像。液体可以对应于任何种类的液体，比如优选地生物相容的和/或水基的人造流体或天然流体例如生物流体，其中诸如细胞的颗粒可以存活并且可以在暴露于物理化学剂时测试其代谢或存活，也参见下文。天然流体的示例是尿液、脑脊液、痰或血液。另外地或可替选地，液体环境可以易受优选地强制对流。
97.至少一个自由漂浮的颗粒可以经受一个或更多个化学刺激和/或一个或更多个物理刺激，并且其中，在所述一个或更多个化学刺激和/或物理刺激作用之前和/或期间和/或之后，对至少一个自由漂浮的颗粒的移动进行成像。
98.例如，化学刺激可以对应于化学物质、药物或试剂的添加或对生物分子的暴露。物理刺激可以对应于包括颗粒的液体环境的温度的改变、光例如uv光的照射、液体环境的压力的施加或改变等。
99.因此，该方法可以包括将一个或更多个化合物添加至液体环境，并且其中，从移动参数得出一个或更多个化合物对至少一个自由漂浮的颗粒的影响。
100.一个或更多个化合物可以与液体环境基本上互不相溶。另外地或可替选地，一个或更多个化合物可以在一个或更多个其他化合物中被提供，一个或更多个其他化合物优选地与液体环境基本上互不相溶。
101.例如，能够想到，在第一步骤中，将与构成液体环境的液体例如油互不相溶的一个或更多个第一化合物的一个或更多个液滴等添加至液体，并且然后将一个或更多个第二化合物例如抗生素或抗真菌剂添加至液滴。此后，可以使得颗粒与液滴能够相互作用或连通，其中，研究了液滴中包括的第二化合物对颗粒的影响。为此，应当注意，构成液滴的化合物可以彼此相同或不同。同样，添加至液滴的化合物可以彼此相同或不同。还能够想到，将相同种类的化合物以不同浓度添加至液滴。同样能够想到更多的修改，例如对不同的液滴施加不同的物理刺激等。
102.因此，该方法可以包括对响应于化学刺激和/或物理刺激的至少一个颗粒的研究。特别地，该方法可以包括执行抗生素易感性测试和/或抗真菌剂易感性测试和/或细胞生存力的表征和/或代谢监测和/或执行诊断和/或药物筛选的步骤。
103.可以在物理暴露和/或化学暴露之前和/或期间和/或之后而且对于一个或更多个单个颗粒和/或一个或更多个颗粒显示所述研究的结果。
104.至少一个自由漂浮的颗粒的移动优选地利用至少一个光学传感器来被成像，光学传感器优选地是ccd或cmos相机。
105.因此，该方法优选地包括提供至少一个光学传感器例如相机。所述光学传感器被配置成检测一个或更多个图像。
106.至少一个光学传感器优选地以1微秒或更多、优选地1秒或更多、更优选地10秒或更多、特别优选地50秒或更多的帧速率对至少一个自由漂浮的颗粒的移动进行成像。另外地或可替选地，至少一个光学传感器以亚像素分辨率对至少一个自由漂浮的颗粒的移动进行成像。
107.光学传感器的帧速率优选地高于所研究的颗粒的振荡。所述帧速率优选地为至少2赫兹，更优选地至少4赫兹，特别优选地至少6赫兹。然而，应当注意，同样能够想到更高的帧速率。例如，至少100赫兹、或至少500赫兹、或至少1000赫兹的帧速率也是可能的。
108.该方法可以包括在多个时刻处通过在预定时间段内记录视频来对至少一个自由漂浮的颗粒的移动进行成像。
109.在至少一个自由漂浮的颗粒的移动被成像期间，至少一个光学传感器可以是静止的。如果在一个空间方向上研究颗粒的空间位移，例如颗粒沿微流体设备的流体通道流动，则优选静止的光学传感器。在至少一个自由漂浮的颗粒的移动被成像期间，至少一个光学传感器可以是移动的。
110.至少一个自由漂浮的颗粒的移动可以在被至少一个放大设备比如显微镜放大的同时被成像。
111.因此，该方法可以进一步包括放大至少一个颗粒的移动。这样，优选的是，该方法还包括提供放大设备，例如显微镜。
112.因此，颗粒的移动可以通过视频记录或在线运动分析来监测，所述在线运动分析使用光学传感器例如ccd芯片或cmos芯片，或者使用放大设备比如显微镜与光学传感器的组合。例如，显微镜可以是光学显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜或超分辨率显微镜。如果要确定关于三个空间方向的空间位移，则优选使用共聚焦显微镜。
113.该方法可以包括配准不同的图像。
114.所述成像可以包括对至少一个颗粒的移动进行光学记录。
115.所述成像可以包括利用光学系统和相机进行光学记录。
116.所述成像可以包括在预定时间段内记录颗粒的视频。
117.此外，可以当颗粒的移动被成像时以及/或者在颗粒的移动被成像之后确定移动参数。另外地或可替选地，可以当颗粒的移动被成像时以及/或者在颗粒的移动被成像之后从移动参数得出颗粒的特性。换言之，该方法可以当记录图像时并且/或者在记录图像之后实现对成像的运动数据的数据处理。
118.该方法还可以包括以下步骤：i)颗粒制备，例如在分析缓冲液和/或生长培养基中制备颗粒的悬浮液，ii)所述悬浮液的稀释和/或浓缩，例如在生长培养基中培养以增加细胞的数目，iii)荧光标记，以及iv)在颗粒沉积之前或之后暴露于物理刺激和/或化学刺激。应当注意，可以应用这些步骤中的仅一个或更多个。换言之，能够想到省略这些步骤中的一个或更多个。例如，能够想到不执行颗粒的荧光标记。荧光标记简化了颗粒的检测，而非强制性步骤。
119.在一个方面，本发明涉及一种包括指令的计算机程序产品，当程序由计算机系统执行时，指令使计算机系统进行如上所述的方法。
120.在另一方面，本发明还涉及一种包括指令的计算机可读介质，指令在由计算机系统执行时使计算机系统进行如上所述的方法。
121.在一个方面，本发明涉及一种用于得出颗粒特性的处理器，该处理器包括：
122.输入装置，其用于获得液体环境中的至少一个自由漂浮的颗粒在至少一个时刻处的经成像的移动，
123.处理器，其用于针对至少一个时刻、基于液体环境中的自由漂浮的颗粒的经成像的移动来确定至少一个移动参数，并且用于从至少一个移动参数得出至少一个颗粒的至少一个特性。
124.处理器可以被配置用于执行如上所述的方法。
125.在一个方面，本发明还涉及一种用于得出颗粒特性的系统，该系统包括：
126.至少一个光学传感器，优选地为包括相机的光学系统，用于对液体环境中的至少一个自由漂浮的颗粒在至少一个时刻处的移动进行成像，以及
127.如上所述的处理器。
128.如以上已说明的，光学传感器优选地为ccd芯片或cmos芯片。系统还可以包括放大设备，例如显微镜。例如，显微镜可以是光学显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜或超分辨率显微镜。
129.在另一方面，本发明涉及一种如上所述的系统用于抗生素易感性测试的用途。
130.在另一方面，本发明涉及一种如上所述的系统用于抗真菌剂易感性测试的用途。
131.为此，优选的是将要测试的颗粒沉积在基底上。例如，可以将包括要测试的颗粒的生物流体放入储存器、孔或微孔中。此后，颗粒的移动作为时间的函数而被成像。此后，将颗粒暴露于药物或物理或化学试剂/刺激。此后，记录暴露于刚才提及的刺激时颗粒移动的修改或改变，并且如上所述处理由此获得的数据。
132.以下给出一个非限制性示例：
133.通过记录在400倍的显微镜放大倍率下拍摄的12s长的影像(1000帧)来监测细胞x、y位移。通过定期记录这些影像，细胞的时间行为被表征为不同浓度的抗真菌剂的函数。为了跟踪单个细胞的细胞位移，使用互相关图像配准算法。计算每一帧的细胞位移、跟踪的细胞的轨迹以及总位移的均方根。通过将每帧位移的分布绘制为小提琴图来表征单个细胞位移即纳米运动。通过将每帧分组的细胞位移绘制为小提琴图并且将一组20个细胞在1000帧内的总位移绘制为盒须图来表征20个细胞的运动。
134.在另一方面，本发明涉及一种如上所述的系统用于表征细胞生存力和/或用于代谢监测的用途。
135.即，并且如已经提及的，根据本发明的方法能够确定诸如细胞的颗粒的空间位移和/或与所述空间位移相关联的振荡，其中，所述空间位移或振荡指示细胞的状况。事实上，当细胞的生存力受到损害时，确定振荡或空间位移的改变。类似的发现适用于诸如细胞的颗粒的代谢或代谢状态或活力等的表征。
136.在另一方面，本发明涉及一种如上所述的系统用于诊断和/或药物筛选和/或抗有丝分裂(antimitotic)药物易感性测试的用途。
137.在诊断的情况下，优选的是使用如上所述的方法找到对特定抗真菌剂具有抗性的菌株和/或找到对特定抗真菌剂具有持久性的菌株。在药物筛选的情况下，优选的是使用如
上所述的方法找到减少空间位移或与所述空间位移相关联的振荡的化合物。以此方式，可以以高效的方式发现有效的抑真菌或杀真菌化合物或者抑菌或杀菌化合物。
138.应当注意，本文中关于该方法提供的任何陈述和说明同样适用于计算机程序产品、计算机可读介质、处理器、系统、所述系统的使用，反之亦然。在所附独立权利要求和从属权利要求中阐述了本发明的特定方面和优选方面。来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征适当地组合，而不仅仅是如权利要求中明确阐述的那样。
139.参考在下文中描述的实施方式，本发明的这些方面和其他方面将变得明显并得以阐明。
附图说明
140.下面参照附图描述本发明的优选实施方式，这些附图是出于说明本发明的当前优选实施方式的目的，而不是出于限制本发明的目的。在附图中，
141.图1a至图1d示出了可以在本发明的实施方式中使用的互相关光学纳米运动检测方法的概述。a，细胞在生长培养基中的时间段，随后进行抗真菌剂处理。b，在不同的时间点，记录1000帧(每秒83帧)的影像。检测和分析盒内的细胞运动。c，使用互相关算法计算各个细胞的x y位移。对于每个采样点计算20个细胞的总位移的平均值；
142.图2a示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是乙醇(70％v/v)和卡泊芬净(100μg/ml)在12s(1000帧，83fps)期间对白色念珠菌dsy294、光滑念珠菌dsy562的x y位移的影响。圆圈内的点表示抗真菌剂卡泊芬净或乙醇处理后细胞的位置；
143.图2b示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是乙醇(70％v/v)和卡泊芬净(100μg/ml)在12s(1000帧，83fps)期间对葡萄牙念珠菌dsy4606和酿酒酵母by4742细胞的x y位移的影响。圆圈内的点表示抗真菌剂卡泊芬净或乙醇处理后细胞的位置；
144.图2c示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是关于白色念珠菌dsy294、光滑念珠菌dsy562、葡萄牙念珠菌dsy4606和酿酒酵母by4742，乙醇(70％v/v)对作为时间的函数的12s测量期间总位移的影响。备注：将乙醇溶液添加至顶部处的同一孔，并且仅通过扩散发生混合，这增加了观察到对生存力的影响的时间。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
145.图2d示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是两性霉素b(100μg/ml)、卡泊芬净(100μg/ml)和氟康唑(400μg/ml)对白色念珠菌dsy294的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
146.图2e示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是卡泊芬净(10μg/ml)对candin抗性白色念珠菌dsy4614临床菌株的影响。“对照”表示在ypd生长培养基中生长的未处理细胞。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显
著；
147.图2f示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是卡泊芬净(10μg/ml)对高度易感(外排系统突变体)白色念珠菌dsy1024菌株的影响。“对照”表示在ypd生长培养基中生长的未处理细胞。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
148.图2g示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是处理1h后白色念珠菌caf2-1野生型菌株的两性霉素b剂量-反应曲线的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
149.图2h示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是处理2h后白色念珠菌caf2-1野生型菌株的两性霉素b剂量-反应曲线的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
150.图2i示出了乙醇和抗真菌剂对酵母细胞的光学纳米运动检测(onmd)的影响，特别是白色念珠菌dsy294的两性霉素b剂量反应曲线的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
151.图3a示出了温度和营养环境对酵母细胞的光学纳米运动的影响，特别是温度对白色念珠菌dsy294、葡萄牙念珠菌dsy4606和酿酒酵母by4742的总位移的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
152.图3b示出了温度和营养环境对酵母细胞的光学纳米运动的影响，特别是温度对总位移的影响：利用自动检测方法获得的结果。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
153.图3c示出了温度和营养环境对酵母细胞的光学纳米运动的影响，特别是存在于pbs或ypd生长培养基中的酿酒酵母by4742的总位移的时间演变。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
154.图3d示出了温度和营养环境对酵母细胞的光学纳米运动的影响，特别是深度学习细胞检测方法。处理不同视频时以高置信度(由箭头指示)自动检测细胞。尽管遗漏了几个细胞，但是细胞中的大多数均以高置信度被正确地检测到。用白色箭头指示的细胞表示高置信度细胞，用黑色箭头指示的细胞表示阈值置信度，检测到的伪影用括号中的低值指示，其周围没有方形；
155.图4a示出了补充念珠菌结果，特别是卡泊芬净对光滑念珠菌dsy562的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
156.图4b示出了补充念珠菌结果，特别是卡泊芬净(10μg/ml)对葡萄牙念珠菌dsy4606
临床野生型和抗性菌株dsy4590的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
157.图5a示出了酿酒酵母结果，特别是卡泊芬净(10μg/ml)对酿酒酵母by4742的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
158.图5b示出了酿酒酵母结果，特别是氟康唑(400μg/ml)对酿酒酵母by4742的影响。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
159.图6a至图6c示出了比较不同的表面处理(伴刀豆球蛋白a、未处理的玻璃和pll-g-peg)的另外的补充念珠菌结果，特别是用卡泊芬净(10μg/ml)处理白色念珠菌dsy1024(高度易感)、dsy294(野生型)和dsy4614(卡泊芬净抗性)。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
160.图6d示出了使用以较低帧速率(每秒10.5帧的1200帧)的较长影像分析的另外的补充念珠菌结果，特别是用乙醇(70％v/v)处理白色念珠菌dsy294、光滑念珠菌dsy562、葡萄牙念珠菌dsy4606和酿酒酵母by4742。在12s期间记录的1.5iqr内的20个单个细胞的盒图须；配对student t检验：****：p＜0.0001，***：p＜0.001，**：p＜0.01，*：p＜0.1，ns：不显著；
161.图7a示出了临界频率和细胞运动的频率范围的确定，特别是从一个白色念珠菌细胞在水平和垂直方向上移动的两个光学记录信号获得的典型fft谱，以及它们的平均值。插入：相同的ftt谱高达40hz；
162.图7b示出了临界频率和细胞移动的频率范围的确定，特别是3h后，一种典型的酿酒酵母by4742细胞在pbs中经由drim方法对临界频率(f
crit
＝2.54hz)的确定；
163.图7c示出了临界频率和细胞移动的频率范围的确定，特别是未处理的卡泊芬净抗性dsy4614、敏感型(dsy1024)和野生型(dsy294)白色念珠菌的f
crit
直方图；
164.图7d示出了临界频率和细胞运动的频率范围的确定，特别是卡泊芬净处理的抗性、高度易感和野生型白色念珠菌的f
crit
直方图。结果汇集了1至5小时的治疗；
165.图8示出了其中人工选择细胞的根据本发明的实施方式的用于表征颗粒的方法的示例性算法；
166.图9示出了其中深度学习选择细胞的根据本发明的实施方式的用于表征颗粒的方法的示例性算法；
167.图10a、图10b示出了可以用在本发明的实施方式中的用于训练检测的示例性算法；
168.图11使用4个ibidi微孔示出了抗真菌剂对作为时间的函数的纳米运动(12s测量期间的平均位移)的影响。备注：将抗真菌剂溶液添加至顶部处的同一孔，并且仅通过扩散发生混合，这增加了观察到对生存力的影响的时间。(1)卡泊芬净对白色念珠菌dsy294临床菌株的影响(2)两性霉素b对白色念珠菌dsy294的影响，(3)氟康唑对白色念珠菌dsy294的影响以及(4)氟康唑对酿酒酵母by4741的影响。误差条表示12s期间记录的20个单个细胞的
位移的标准偏差；配对student t检验：***p＜0.001；**p＜0.01。b.温度对酿酒酵母by4741、临床菌株白色念珠菌dsy294和葡萄牙念珠菌dsy4606的平均位移的影响。在温度逐步升高后温度稳定15分钟后，在约12s期间记录每种条件20个单个细胞的移动并进行分析；
169.图12示出了白色念珠菌(野生型、敏感型和抗性菌株)的移动；以及酿酒酵母by4742的移动。卡泊芬净在5h培养期间的影响。ypd培养基中的卡泊芬净浓度为10μg/l；
170.图13a示出了细胞在生长培养基中随后进行抗真菌剂处理的时间段；
171.图13b示出了在不同时间点记录的1000帧影像；
172.图13c示出了使用互相关算法计算的各个细胞(通常为20个细胞)的x、y位移；
173.图13d示出了对于每个细胞，计算每帧的位移，并且该分布由组合的小提琴和箱形图表示；
174.图13e示出了表示为组合的小提琴图和箱形图的条件/采样点的所有细胞的每帧位移；
175.图13f示出了针对每种条件/采样点计算并且以箱形图表示的20个细胞的总位移的平均值；
176.图14a示出了2h后在ypd生长培养基中生长的20个酿酒酵母by4742细胞的每帧位移的分布(上图)以及20个细胞的位移的合并分布的时间演变(下图)；
177.图14b示出了2h后在pbs中存在的20个酿酒酵母by4742细胞的每帧位移的分布(上图)以及20个细胞的位移的合并分布的时间演变(下图)；
178.图14c示出了生长培养基中分组位移的时间演变。温度对酿酒酵母by4742和白色念珠菌dsy294的位移分布(20个细胞)的影响；
179.图14d示出了温度对酿酒酵母by4742和白色念珠菌dsy294的总位移的影响。wilcoxon检验：****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，ns：不显著；
180.图15a示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是对于白色念珠菌dsy294在时间0min(上图)、10min(中图)和60min(下图)20个细胞的位移的分布；
181.图15b示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是对于光滑念珠菌dsy562在时间0min(上图)、10min(中图)和60min(下图)20个细胞的位移的分布；
182.图15c示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是对于葡萄牙念珠菌dsy4606在时间0min(上图)、10min(中图)和60min(下图)20个细胞的位移的分布；
183.图15d示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是对于酿酒酵母by4742在时间0min(上图)、10min(中图)和60min(下图)20个细胞的位移的分布；
184.图15e示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是20个细胞的每帧位移/帧的时间演变(上图)和作为时间的函数的12s测量期间总位移的对应图(下图)。wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：对于白色念珠菌dsy294不显著；
185.图15f示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，
特别是20个细胞的每帧位移/帧的时间演变(上图)和作为时间的函数的12s测量期间总位移的对应图(下图)。wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：对于光滑念珠菌dsy562不显著；
186.图15g示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是20个细胞的每帧位移/帧的时间演变(上图)和作为时间的函数的12s测量期间总位移的对应图(下图)。wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：对于葡萄牙念珠菌dsy4606不显著；
187.图15h示出了通过观察在乙醇存在下酵母细胞的细胞纳米运动的生命-死亡转变，特别是20个细胞的每帧位移/帧的时间演变(上图)和作为时间的函数的12s测量期间总位移的对应图(下图)。wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：对于酿酒酵母by4742不显著；
188.图16a示出了抗真菌剂两性霉素b(500μg/ml)对白色念珠菌dsy294的细胞纳米运动的影响，特别是20个细胞的位移分布的时间演变(上图)和12s期间总位移的对应图(下图)；
189.图16b示出了抗真菌剂卡泊芬净(100μg/ml)对白色念珠菌dsy294的细胞纳米运动的影响，特别是20个细胞的位移分布的时间演变(上图)和12s期间总位移的对应图(下图)；
190.图16c示出了抗真菌剂氟康唑(400μg/ml)对白色念珠菌dsy294的细胞纳米运动的影响，特别是20个细胞的位移分布的时间演变(上图)和12s期间总位移的对应图(下图)；
191.图16d示出了抗真菌剂卡泊芬净(10μg/ml)对高度易感白色念珠菌dsy1024的细胞纳米运动的影响，特别是20个细胞的位移分布的时间演变(上图)和总位移的对应图(下图)；
192.图16e示出了抗真菌剂卡泊芬净(10μg/ml)对candin抗性白色念珠菌dsy4614的细胞纳米运动的影响，特别是20个细胞的位移分布的时间演变(上图)和总位移的对应图(下图)；
193.图16f示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294的影响，特别是细胞位移(左图)和用wilcoxon检验处理1h后20个细胞的总位移(右图)：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：不显著；
194.图16g示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294的影响，特别是细胞位移(左图)和处理2h后20个细胞的总位移(右图)，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.1；ns：不显著；
195.图17a示出了营养环境对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是在ypd生长培养基中生长的20个酿酒酵母by4742细胞的每帧位移的分布；
196.图17b示出了营养环境对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是pbs中存在的20个酿酒酵母by4742细胞的每帧位移的分布；
197.图17c示出了营养环境对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于ypd生长培养基中的细胞(c)作为时间的函数的12s测量期间总位移的时间演变，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；*p＜0.1；ns：不显著；
198.图17d示出了营养环境对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于pbs中的细胞作为时间的函数的12s测量期间总位移的时间演变，使用wilcoxon检验：****p＜
0.0001；*p＜0.1；ns：不显著；
199.图18a示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是玻璃表面上的20个珠的位移/帧；
200.图18b示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是pll-peg处理表面上的20个珠的位移/帧；
201.图18c示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是玻璃和pll-peg处理表面上的所有20个珠的每帧位移；
202.图18d示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是玻璃和pll-peg处理表面上的珠在12s测量期间的总位移，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；
203.图18f示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是对于野生型白色念珠菌dsy294，5h后20个未处理的细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
204.图18g示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是对于高度易感白色念珠菌dsy1024菌株，5h后20个未处理的细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
205.图18h示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是所有20个白色念珠菌dsy294的每帧位移；
206.图18i示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是所有20个白色念珠菌dsy1024细胞的每帧位移；
207.图18j示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是20个(h)白色念珠菌dsy294在12s测量期间的总位移；
208.图18k示出了二氧化硅微珠的移动和伴刀豆球蛋白a使细胞对玻璃表面的附着。a，特别是20个(k)白色念珠菌dsy1024细胞在12s测量期间的总位移；
209.图19a示出了温度对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于酿酒酵母by4742，作为温度(13℃，20℃，25℃)的函数的20个细胞的每帧位移的分布；
210.图19b示出了温度对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于酿酒酵母by4742，作为温度(30℃，35℃)的函数的20个细胞的每帧位移的分布；
211.图19c示出了温度对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于白色念珠菌dsy294，作为温度(13℃，20℃，25℃)的函数的20个细胞的每帧位移的分布；
212.图19d示出了温度对酵母细胞的细胞纳米运动的影响，特别是对于白色念珠菌dsy294，作为温度(30℃，35℃)的函数的20个细胞的每帧位移的分布；
213.图20a示出了抗真菌剂对白色念珠菌的细胞纳米运动的影响。用两性霉素b(500μg/ml)处理的20个白色念珠菌dsy294细胞的位移/帧；
214.图20b示出了抗真菌剂对白色念珠菌的细胞纳米运动的影响。用卡泊芬净(100μg/ml)处理的20个白色念珠菌dsy294细胞的位移/帧；
215.图20c示出了抗真菌剂对白色念珠菌的细胞纳米运动的影响。用氟康唑(400μg/ml)处理的20个白色念珠菌dsy294细胞的位移/帧；
216.图20d示出了20个(d)高度易感白色念珠菌dsy1024细胞的位移/帧；
217.图20e示出了20个(d)高度易感白色念珠菌dsy1024细胞(e)和用卡泊芬净(10μg/ml)处理的candin抗性白色念珠菌dsy4614细胞的位移/帧；
218.图21a示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于未处理的细胞1h后每帧的细胞位移；
219.图21b示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于0.1μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
220.图21c示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于0.5μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
221.图21d示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于1μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
222.图21e示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于4μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
223.图21f示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于10μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
224.图21g示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于50μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
225.图21h示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于100μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
226.图21i示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于未处理的细胞2h后每帧的细胞位移；
227.图21j示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于0.1μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
228.图21k示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于0.5μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
229.图21l示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于1μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
230.图21m示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于4μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
231.图21n示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于10μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
232.图21o示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于50μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
233.图21p示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响，特别是对于100μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
234.图22a示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于未处理的细胞1h后每帧的细胞位移；
235.图22b示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于0.1μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
236.图22c示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是
对于0.5μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
237.图22d示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于1μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
238.图22e示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于4μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
239.图22f示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于10μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
240.图22g示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于50μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
241.图22h示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于100μg/ml在1h后每帧的细胞位移；
242.图22i示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于未处理的细胞2h后每帧的细胞位移；
243.图22j示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于0.1μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
244.图22k示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于0.5μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
245.图22l示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于1μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
246.图22m示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于4μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
247.图22n示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于10μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
248.图22o示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于50μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
249.图22p示出了增加两性霉素b浓度对白色念珠菌caf2-1野生型菌株的影响，特别是对于100μg/ml在2h后每帧的细胞位移；
250.图22q示出了1h处理后，每帧的细胞位移(左图)和20个细胞的每帧总位移(右图)，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；*p＜0.1；ns：不显著；
251.图22r示出了2h处理后，每帧的细胞位移(左图)和20个细胞的每帧总位移(右图)，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；*p＜0.1；ns：不显著；
252.图23a示出了表面对白色念珠菌的细胞移动的影响，特别是在pll-peg处理玻璃表面上未处理的20个白色念珠菌dsy294细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
253.图23b示出了在pll-peg处理表面上所有20个细胞的每帧位移；
254.图23c示出了在12s测量期间，在pll-peg处理表面上20个细胞的总位移，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；
255.图23d示出了表面对白色念珠菌的细胞移动的影响，特别是玻璃表面上未处理的20个白色念珠菌dsy294细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
256.图23e示出了在玻璃处理表面上所有20个细胞的每帧位移；
257.图23f示出了在12s测量期间，在玻璃处理表面上20个细胞的总位移，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；
258.图23g示出了在pll-peg处理表面上未处理的20个白色念珠菌dsy1024细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
259.图23h示出了在pll-peg处理表面上所有20个细胞的每帧位移；
260.图23i示出了在12s测量期间，在pll-peg处理表面上20个细胞的总位移，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001；***p＜0.001；
261.图23j示出了在玻璃表面上未处理的20个白色念珠菌dsy1024细胞(上图)和卡泊芬净(10μg/ml)处理的细胞(下图)的位移/帧；
262.图23k示出了在玻璃处理表面上所有20个细胞的每帧位移；
263.图23l示出了在12s测量期间，在玻璃处理表面上20个细胞的总位移，使用wilcoxon检验：****p＜0.0001，***p＜0.001；
264.图24示出了人工选择各个细胞的示例，这些细胞将通过互相关算法进行分析。
具体实施方式
265.将针对特定实施方式并且参照某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限制。尺寸和相对尺寸不对应于实践本发明的实际减少量。
266.此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二等用于区分相似的元件并且不一定用于在时间上、空间上、按等级或以任何其他方式描述序列。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文中描述的本发明的实施方式能够以不同于本文所描述或示出的其他序列进行操作。
267.此外，说明书和权利要求中的术语顶部、在
……
下等用于描述性目的，而不一定用于描述相对位置。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文中描述的本发明的实施方式能够以不同于本文所描述或示出的其他取向进行操作。
268.应当注意，在权利要求中使用的术语“包括”不应当被解释为限制于其后列出的装置；其不排除其他元件或步骤。其因此应当被解释为指定所提到的特征、整数、步骤或部件的存在，但是不排除一个或更多个其他特征、整数、步骤或部件或其组的存在或添加。因此，表述“包括装置a和装置b的设备”的范围不应当限于仅包括装置a和装置b的设备。这意指关于本发明，设备的仅相关部件是a和b。
269.在整个本说明书中对“一个实施方式”或“实施方式”的引用意指结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在整个本说明书中在多个位置中出现短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定全部指相同的实施方式，但是也可以全部指相同的实施方式。此外，如本领域普通技术人员从本公开内容将显而易见的，在一个或更多个实施方式中，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式进行组合。
270.类似地，应当认识到，在本发明的示例性实施方式的描述中，出于简化本公开内容以及有助于理解各种发明方面中的一个或更多个方面的目的，本发明的各种特征有时在单个实施方式、图或其描述中被组合在一起。然而，本公开内容的该方法不应当被解释为反映
所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确叙述的特征更多的特征的意图。而是，如所附权利要求所反映的，创造性方面在于少于单个前述公开实施方式的所有特征。因此，具体实施方式之后所附的权利要求特此明确地并入该具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为该发明的单独实施方式。
271.此外，虽然本文中描述的一些实施方式包括一些特征但不包括另一些实施方式中包括的其他特征，但是如本领域技术人员将理解的，不同实施方式的特征的组合意在处于本发明的范围内，并且形成不同的实施方式。例如，在所附权利要求中，任何要求保护的实施方式可以以任何组合来使用。
272.在本文中提供的描述中，阐述了许多具体细节。然而，应理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明的实施方式。在其他实例中，为了不混淆对本描述的理解，没有详细示出公知的方法、结构和技术。
273.在一个方面，本发明可以涉及用于得出颗粒特性的方法。方法可以包括检测一个颗粒或多个颗粒的特性。颗粒可以是任何类型的颗粒，例如在一个示例中是细胞。方法包括对液体环境中的至少一个自由漂浮的颗粒在至少一个时刻处的移动进行成像。因此，颗粒通常不需要附着到表面或更大颗粒。因此颗粒可以是未附着的。成像可以是光学成像。成像可以是视频记录。这样的视频记录可以是在预定时间(例如，至少2秒、至少5秒或至少10秒)内移动的视频。这些视频记录可以重复多次。这可以对应于在记录之间以预定时间间隔隔开的不同记录。
274.方法还包括针对至少一个时刻、基于液体环境中的自由漂浮的颗粒的经成像的移动来确定移动参数。移动参数可以是颗粒的x、y移动。移动参数可以是自由漂浮的颗粒的振荡移动的振荡频率。方法还包括从移动参数得出至少一个颗粒的特性。
275.根据本发明的一些实施方式，为了确定移动参数，方法可以利用用于配准图像的算法。这样的算法得出颗粒随时间的移动的一个示例可以利用用于配准图像的算法，例如由manuale guizar-sicairos等在题为“efficient subpixel image registration algorithms”的optics letters 33，156-158(2008)中描述的。可替选地，也可以使用其他算法。
276.在一些实施方式中，方法可以是如图8所示的算法。在其他实施方式中，方法可以是如图9所示的算法。
277.在一些实施方式中，可以利用自学习算法来在测量纳米运动之前自动选择细胞。例如可以利用神经网络。在一个示例中，可以利用如图10a、图10b所示的自学习算法。这样的方法可以例如包括生成模拟细胞的图像例如大量图像，例如约50000个或更多个图像，并且因此获得一组合成细胞图像，将这样的图像提供给细胞检测模型以用于训练模型并更新模型，评估模型并改进该模型，以最终得到训练模型。
278.以下，通过例示的方式，将对本发明的实施方式的特征和优点进行说明，但本发明的实施方式不限于此。以下示例示出了使用光学纳米运动检测快速、无标记和无附着表征单细胞抗真菌剂易感性的方法的优点。
279.以下示出的示例是在近年来全球真菌病发病率急剧增加的情况下建立的。抗真菌的酵母菌株的出现现在代表了对人类的严重挑战。开发快速抗真菌剂易感性测试(afst)以指导治疗和临床管理决策是限制这些生物体传播的选择之一。在以下示出的示例性实施方
式中，描述了快速且简单的方法，其允许用非常基本的实验室材料即光学显微镜、相机和计算机来评估单个真菌细胞对抗真菌药物的易感性。有利地，技术是无标记的并且不需要将细胞附着在基底上，这显著地简化和拓宽了其适用性，甚至在发展中国家的偏远医生的实践中也适用。开发了基于通过显微镜的连续记录的光学图像的互相关的“光学纳米运动检测”(onmd)方法，并且证明了记录的“纳米运动”大小与细胞的活动性成比例。在视频分析流水线中实现深度学习单细胞检测算法，以自动检测视频序列内的数百到数千个细胞中的各个细胞。因此，所开发的方法可以处理单个细胞以及整个细胞群的纳米运动模式。在本实施方式中应用该方法来评估各种白色念珠菌、光滑念珠菌和葡萄牙念珠菌菌株(包括临床菌株)和模式酿酒酵母对各种抗真菌剂的抗真菌剂易感性。另外，为白色念珠菌菌株建立两性霉素b剂量-反应曲线，其使得能够确定最小抑制浓度(mic)。除了检测生命-死亡转变，方法还对细胞的代谢活动性敏感，如通过在细胞的纳米运动模式与温度和营养物可用性之间发现的相关性所证明的。针对该特定示例执行在频域中酵母纳米运动模式的分析，其突出显示在活酵母细胞和死亡酵母细胞之间改变最多的振荡频率位于0.5hz至4hz之间。
280.在本示例中，示出了配备有视频相机的光学显微镜可以检测活细胞的纳米尺度振荡。通过定期(在本示例中每小时)记录细胞在不存在和存在药物的情况下12s长的影像并且用可以突出显示亚像素尺度移动的算法处理影像来监测振荡(图1)。有趣的是，与现有技术相反，细胞不必附着在悬臂或基底上。附着的缺乏使细胞振荡更容易用中等至高放大倍率光学显微镜检测。该技术也是无标记的，允许非常快速且简单的设置。重要的是，由于深度学习检测算法和显著加速数据处理的进一步自动化的实现，方法适用于单个细胞以及适用于整个群体(100至1000个细胞)。
281.方法在不同类型的酵母例如不同念珠菌属物种和模式酵母酿酒酵母上进行测试。这些念珠菌属物种能够参与念珠菌病，所述念珠菌病是由于获得性抗性而难以治疗的人真菌感染。评估的酵母菌株中的一些对所应用的抗真菌药物是高度易感的或抗性的以激发它们的生存力。在每种情况下，结果用经典的敏感性测试证实。进行抗真菌剂剂量依赖性以及温度依赖性测试，并且证明光学纳米运动检测(onmd)不限于生命-死亡转变检测，而且还可以监测代谢速率变化。
282.为了跟踪单个细胞，在本示例中，使用互相关图像配准算法。该方法被记载为高效地跟踪活细胞中角蛋白网络的细微修改和成肌细胞的位移。该算法基于第一帧与每个后续帧之间的互相关峰值的初始估计。其提供了具有亚像素(亚微米)分辨率的图像平移的数值，并且不需要繁重的计算。本发明的程序计算每一帧的细胞位移，并且将跟踪的细胞的轨迹以及位移的均方根保存到ms excel文件中。
283.在第一组实验中，评估了乙醇对各种念珠菌菌株和模式酵母酿酒酵母的纳米运动的抗微生物活动性。因此，探究了高乙醇浓度(70％)对白色念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母细胞的x y位移的影响(图2a和图2b下图)。结果显示，对于乙醇处理的细胞，x y位移快速且显著减少。在仅10分钟的治疗之后，在1000帧内的总位移显著减少(图2c)。在添加乙醇并扩散混合十分钟后，检测到光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母的显著(t-检验)减少。白色念珠菌似乎在一定程度上对乙醇更耐受，因为仅在60min后才测量到总位移的显著减少。乙醇是念珠菌菌株代谢葡萄糖的产物之一。其可以用作唯一碳源，并且其耐受性被记载是菌株依赖性的。酿酒酵母也可以产生乙醇——其在中等浓度(5％至7％)
时影响生长速率，并且在较高浓度(＞10％)时将损害细胞膜完整性，最终导致凋亡性的细胞死亡。乙醇改变酵母细胞膜的流动性并且耗散跨膜电化学电位，这导致离子物质渗透性和代谢物的泄漏。乙醇可以在细胞内自由扩散，并且将直接扰动细胞内蛋白并且使细胞内蛋白变性。
284.在下一步骤中，评估onmd执行afst的效率。用抗真菌剂处理酵母细胞后，x y位移显著减少。作为示例，图2a和图2b(上图)示出用卡泊芬净处理后白色念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母细胞的位移减少。图2d示出了抗真菌剂两性霉素b、卡泊芬净和氟康唑对白色念珠菌dsy294野生型菌株的影响。对于所有3种抗真菌剂，在1h处理后检测到平均总位移的显著减少(图2d)。两性霉素b是该菌株最有效的抗真菌剂，因为在已经1h后，纳米运动信号降低到接近在死亡细胞上记录的这些值的值。多烯两性霉素b选择性地接合至细胞膜中的麦角固醇并且导致孔的形成(这导致更快死亡)，而吡咯氟康唑选择性地抑制细胞色素p450依赖性羊毛甾醇-14-α-脱甲基酶，并且棘球白素卡泊芬净抑制真菌β-1,3-葡聚糖合酶。报道的白色念珠菌dsy菌株的两性霉素b mic值为0.5μg/ml。卡泊芬净不影响candin抗性白色念珠菌dsy4614临床菌株的纳米运动(图2e)，但却杀死高度易感(外排系统突变体)(表1)白色念珠菌dsy1024菌株(图2f)。报道的白色念珠菌的卡泊芬净mic值在0.03μg/ml到8μg/ml的范围内。卡泊芬净对光滑念珠菌dsy562临床野生型菌株的纳米运动afst显示处理2h后细胞死亡(图4a)。卡泊芬净也快速杀死葡萄牙念珠菌dsy4606临床野生型菌株(图4b右图)，而抗性dsy4590临床菌株不受治疗影响(图4b左图)。在处理3h后检测卡泊芬净对酿酒酵母by4742的影响，观察到总位移显著减少(图5a)。与氟康唑对白色念珠菌dsy294的影响(图2d)相比，在处理1h后氟康唑对酿酒酵母没有影响(图5b)；在处理5h后，总位移的显著减少是明显的。这可以解释为与白色念珠菌dsy294的氟康唑mic值(0.3μg/l)相比，酿酒酵母的更大的氟康唑mic值(1μg/ml至8μg/ml)。
285.也通过使用onmd方法研究了白色念珠菌caf2-1野生型菌株的两性霉素b剂量-反应曲线(图2g和图2h)。对于10μg/ml的浓度，1h后平均总位移增加(图2gl)，并且对于4μg/ml的浓度，2h后平均总位移增加(图2h)；而对于更高的药物浓度，平均总位移则减少。记录白色念珠菌dsy294临床野生型菌株的类似两性霉素b剂量-反应曲线(图2i)。这表明两性霉素的作用机制增加了细胞在约其mic移动，即抗真菌剂作用增加了细胞的代谢活动性。先前也观察到细菌百日咳鲍特菌的纳米运动(使用afm-悬臂方法测量)在约抗生素的mic增加。结果还显示，较低浓度能够被检测为纳米运动的改变需要更多的时间，并且onmd使得能够记录细胞死亡的动力学。可以观察到纳米运动改变的最低浓度对应于mic值。检测到mic值为1μg/ml至4μg/ml，并且对于该菌株使用经典的“微量滴定板方法”报道的是0.3μg/ml，并且对于白色念珠菌报道的是0.1μg/ml至4.0μg/ml的范围。
286.在下一组实验中，探究了onmd方法监测酵母在化学-物理刺激下的代谢改变的能力。首先，评估温度(在13℃到35℃的范围)对白色念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母的影响(图3a)。对于所有三种酵母菌株，在约30℃检测到最大活动性。该值与记载的最佳生长温度一致，即对于白色念珠菌为33℃至38℃，对于酿酒酵母by4247为30℃至35℃。其次，通过比较悬浮在生长培养基中的细胞的总位移与悬浮在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的细胞的总位移来评估营养物影响酵母细胞的onm活动性的方式。如图3c所描绘的，与在pbs中获得的测量结果相比，生长培养基中的细胞的纳米运动活动性在1h后显著增加。
287.最后，评估onmd是否可以用于执行表面附着的细胞的afst。因此，白色念珠菌dsy1024(敏感型)、dsy294(野生型)和dsy4614(卡泊芬净抗性)牢固地附着在涂覆有伴刀豆球蛋白a的玻璃表面上(图6a至图6c上图)。伴刀豆球蛋白a是凝集素，其通过其甘露糖聚糖将酵母细胞壁交联到玻璃表面。在这样的情况下，与syal和同事对松散附着的大肠杆菌细胞执行抗生素易感性测试相比，没有检测到总位移的显著减少。最后，在沉积于防污涂层表面即pll-g-peg处理的载玻片的酵母细胞上进行卡泊芬净afst。这些实验显示了与在未处理的玻璃表面上获得的结果在一定程度上类似的结果(图6a至图6c)。然而，在高度易感和野生型菌株的情况下，对于未处理的玻璃表面，可以检测到纳米运动的更快的显著减少。未处理的玻璃和pll-g-peg涂覆的玻璃对于抗性菌株给出了类似的结果。基于这些实验，可以得出方法观察到悬浮的、非附着的细胞的“天然”纳米运动这一结论。
288.在频域中进行数值分析以突出显示在生命-死亡转变期间发生的振荡模式的差异(图7a，图7b)。每个频率范围由其低频极限和高频极限表征。利用本记录方法，低频极限被确定为信号持续时间的倒数值，其对于12s等于0.083hz。计算高极限更复杂并且在不同细胞之间变化。高频极限被称为临界频率(f
crit
)，并且设计了针对f
crit
的计算的过程。这些分析揭示，未处理的抗性白色念珠菌细胞在f
crit
从0.7hz变化到1.5hz的频率范围(0.083至f
crit
)内显示最大活动性。有趣的是，白色念珠菌dsy294野生型细胞也具有较高频率(2.5hz至3.0hz)的f
crit
(图7c)，而卡泊芬净处理的细胞显示其f
crit
变宽，这对于高度易感(敏感型)dsy1024细胞扩展最大(图7d)。在该情况下，观察到约2hz的附加f
crit
。这些结果证明，活酵母细胞与死亡酵母细胞之间的频域的振荡模式的最大差异位于非常低的频率范围内。这些结果补充了突出显示酿酒酵母在0.8khz至1.6khz的范围内的定期运动的gimzewski和同事所公布的那些结果。这些测量是通过afm对机械地截留在过滤器孔中的酵母细胞实现的。不幸的是，目前的onmd设置不能达到这样的高采样率以证实或反驳这些结果。
289.为了加速数据处理，开发了深度学习算法，其检测各个酵母细胞(图3d)并且以亚像素分辨率跟踪酵母细胞的纳米运动。深度学习模型在自动化对象和细胞检测任务中已经广泛成功。使用中等大小的浅yolo架构。与人工选择细胞相比，该方法允许自动分析显著更大量的细胞(100至1000)。作为原理的证据，重新分析了表明温度对三种酵母菌株的影响的视频数据(图3b)。与在第一分析中使用的每种温度条件下20个人工选择的细胞相比，可以自动检测更多的细胞：对于白色念珠菌分析194个细胞(每种条件平均39个细胞)，对于葡萄牙念珠菌分析159个细胞(每种条件平均32个细胞)，对于酿酒酵母分析147个细胞(每种条件平均29个细胞)。如所预期的，用于分析的样本大小的这样的增加导致总位移的较小分布，并且提供了所计算的平均位移的更准确的值(图3b相对于图3a)。
290.在进一步提高方法的效率并降低其计算成本的尝试中，以低频记录速率(10.5fps而不是83fps)执行额外的实验。这些修改是由所获得的结果推动的，这些结果证明活酵母细胞与死亡酵母细胞之间的最大差异发生在低于4hz的频率。对于白色念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母(图6d)，用与以前相同的乙醇处理，获得83fps的较高帧速率(图2c)。这些结果显示，对于较小的数据文件，可以用更快的分析获得类似的结果。
291.进一步通过例示的方式，研究了暴露于抗真菌剂的细胞的平均位移，并在图11a、图11b和图12将其示出。使用监测具有亚微米分辨率的细胞位移的专用算法，测定各个细胞的2d位移。在本示例中，测量来自ibidi(德国)的微孔插入物的移动，该微孔插入物具有圆
锥形状，其在底部处具有400μm的直径。对于几个细胞和抗真菌化合物，将暴露于抗真菌剂的细胞的平均位移与未处理的对照进行比较(图1a)。执行student t检验以确定细胞的移动的减少是否显著。在图11a中，示出了12s测量期间对作为时间的函数的平均位移的影响。在4ibidi微孔中执行测量。将抗真菌剂溶液添加至顶部处的同一孔，并且仅通过扩散发生混合，这增加了观察到对生存力的影响的时间。示出了(1)卡泊芬净对白色念珠菌dsy294临床菌株的影响(2)两性霉素b对白色念珠菌dsy294的影响，(3)氟康唑对白色念珠菌dsy294的影响以及(4)氟康唑对酿酒酵母by4741的影响。误差条表示12s期间记录的20个单个细胞的位移的标准偏差；配对student t检验：***p＜0.001；**p＜0.01。还研究了作为温度的函数的细胞(白色念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母)的活动性。在图11b中示出了温度对酿酒酵母by4741、临床菌株白色念珠菌dsy294和葡萄牙念珠菌dsy4606的平均位移的影响。在温度逐步升高后温度稳定15分钟后，在约12s期间记录每种条件20个单个细胞的移动并进行分析。
292.在图12中示出了卡泊芬净对野生型、抗性和敏感型白色念珠菌和酿酒酵母的平均位移的影响。示出了卡泊芬净在5h培养期间的影响。ypd培养基中的卡泊芬净浓度为10μg/l。
293.示出4个孔中细胞的测量移动的实验说明了本发明的实施方式的特征和优点。
294.如最初提及的，先前已经开发了评估化学物质对细菌的生存力的影响的基于afm的化验[8]。检测基于以下观察：活生物体以纳米尺度振荡并将这些振荡传递到它们所附着的afm悬臂。一旦细胞的生存力受到损害，这些振荡就停止。已经证明这些振荡存在于活细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中[9]。附着到表面的活细菌细胞的纳米运动已经通过使用其他检测方法得到证实，其他检测方法例如细菌的z移动的等离子体成像[10]，跟踪附着的细菌的亚微米尺度x-y移动[11]，用共振晶体的相位噪声感测附着的细菌振动[12]，以及亚细胞波动成像[13]。
[0295]
如已经提及的，注意到，配备有视频相机的光学显微镜可以检测沉积在玻璃表面上的单个酵母细胞的移动。单个活酵母细胞在纳米尺度上显示出特定细胞移动——其大小与细胞的细胞活动性成比例。使用经典的光学显微镜表征未附着的单个酵母细胞的这种细胞纳米运动模式。短时间段内细胞位移的分布不同于随机移动。这样的纳米运动位移分布的范围和形状根据细胞的代谢状态而显著改变。对纳米运动频率模式的分析证明单个活酵母细胞以约2hz的相对低频振荡。技术的简单性将为许多应用开辟道路，在这些应用中抗真菌剂易感性测试似乎是最直接的。
[0296]
图13至图24进一步示出了本发明。特别地，探究了使用该光学纳米运动检测(onmd)方法的非附着的酵母细胞的纳米运动。统计分析进一步基于用prism8(graphpad)创建的小提琴图和盒须(10百分位数至90百分位数)图。执行wilcoxon匹配对符号登记检验以确定条件之间的显著差异(1000帧内的平均总位移的箱形图)。
[0297]
通过记录在400倍的放大倍率下拍摄的12s长的影像(1000帧)来监测细胞x-y移动(图13)。通过定期记录这些影像，细胞的时间行为被表征为不同化学刺激和物理刺激的函数(图13a至图13b)。为了跟踪单个细胞的细胞移动，使用互相关图像配准算法[14]。该算法基于第一帧与每个后续帧之间的互相关峰值的初始估计。其提供了具有亚像素(亚微米)分辨率的图像平移的数值。计算每一帧的细胞位移、跟踪的细胞的轨迹(图13c)以及总位移的
均方根(图13f)。通过将每帧位移的分布绘制为小提琴图来表征单个细胞纳米运动(图13d)。通过将每帧分组的细胞位移绘制为小提琴图并且将一组20个细胞在1000帧内的总位移绘制为盒须图来表征20个细胞的移动(图13e)。
[0298]
在另一组实验中，比较了在存在营养物的情况下生长(通过在ypd生长培养基中生长)的酿酒酵母细胞的单细胞纳米运动与在无营养物生理pbs缓冲液中的细胞。在4h期间每小时记录一次单个细胞位移(图14a至图14b以及图17a至图17b)。活跃生长的单个细胞显示出大的位移分布。位移的分布是不对称的，并且这反映了细胞的非随机行为(也可以从x-y位移图(图2a至图2b)中观察到)，即细胞可以不时地跳跃。该移动行为也反映在表示位移分布的小提琴图的形状上。在这组中，几个细胞(1至3)显示出非常小的位移分布，并且可以被分类为非活动。相比之下，在不存在营养物的情况下，尤其是在培养3h至4h后，存在显著更多的非活动细胞(图14b和图17b)。该行为也反映在分组位移小提琴图(图14a至图14b下图)和总位移箱形图(图17c至图17d)中。在这些最后的图中，可以清楚地观察到细胞对新生长条件的适应，即1h后总位移的显著增加，这与pbs中获得的测量结果相反。
[0299]
还将细胞纳米运动与在相同条件下记录的二氧化硅珠的移动进行比较(图18a至图18d)。位移的分布是对称的。移动的大小与活细胞相比大大降低，并且与死亡细胞的数量级相同(图18e)。
[0300]
为了评估温度对酵母的纳米运动模式的影响，监测了在13℃至35℃范围内不同温度下的细胞振荡(图14c至图14d以及图19)。每个菌株由分组位移分布的不同分布来表征。对于两种酵母菌株，在约30℃检测到最大活动性。该值与记载的酿酒酵母by4742的最佳生长温度30℃至35℃[15]以及白色念珠菌的最佳生长温度33℃至38℃[16]一致。这些实验表明，细胞活动性的大小与位移的分布的大小和1000帧内的总位移成比例。
[0301]
接下来，表征念珠菌和酿酒酵母细胞在暴露于杀伤剂时的细胞移动。念珠菌属物种能够参与念珠菌病，所述念珠菌病是由于获得性抗性而难以治疗的人真菌感染[17]。评估的酵母菌株中的一些对所应用的抗真菌药物是高度易感的或抗性的以激发它们的生存力。首先，探究了高乙醇浓度(70％)对白色念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母细胞的影响。在添加乙醇后，x-y位移快速且显著减少(图2a至图2b)。单个细胞的位移分布(图15)、20个细胞的分组位移(图15e至图15f，上图)和总位移(图15e至图15f，下图)减少。在添加乙醇十分钟后，观察到所有菌株的一组20个细胞中的位移减少。光滑念珠菌以及——在较小程度上——酿酒酵母在一定程度上比光滑念珠菌和葡萄牙念珠菌对乙醇更耐受，因为仅在60min后才观察到总位移的显著减少。乙醇耐受性是菌株依赖性的[18，19]，影响生长速率并且将损害细胞膜完整性[20]，这导致离子物质渗透性和代谢物的泄漏[21]；并且乙醇在细胞内自由扩散，其在细胞内直接扰动细胞内蛋白并且使细胞内蛋白变性[22]。
[0302]
其次，通过将细胞暴露于不同浓度的各种抗真菌剂来评估细胞的杀伤对细胞纳米运动的改变的影响。在用抗真菌剂处理细胞后，x-y位移显著减少(图2a至图2b)。在图16a至图16c以及图20a至图20c中示出了两性霉素b、卡泊芬净和氟康唑对白色念珠菌dsy294野生型菌株的细胞移动的影响。多烯两性霉素b选择性地接合至细胞膜中的麦角固醇并且导致孔的形成(这导致更快死亡)，而吡咯氟康唑选择性地抑制细胞色素p450依赖性羊毛甾醇-14-a-脱甲基酶，并且棘球白素卡泊芬净抑制真菌b-1,3-葡聚糖合酶[23]。对于所有3种抗
真菌剂，在1h处理后检测到细胞位移和总位移的显著减少。高浓度的两性霉素b是非常有效的，因为在已经1h后，细胞纳米运动减少到接近关于整组20个细胞中的死亡细胞记录的值(图20a)。卡泊芬净不影响candin抗性白色念珠菌dsy4614临床菌株的纳米运动(图16e)，但却杀死高度易感(外排系统突变体)白色念珠菌dsy1024菌株(图16d)(表1)。报道的白色念珠菌的卡泊芬净mic值在0.03μg/ml至8μg/ml的范围内[24-26]。1h后氟康唑显著减少白色念珠菌dsy294的细胞纳米运动(图16c)。
[0303]
为了观察生命-死亡转变，白色念珠菌dsy294临床野生型菌株暴露于较低两性霉素浓度——包括最小抑制浓度(mic)(已经报道了对于白色念珠菌dsy菌株，mic值为0.5μg/ml[6，27])。总位移曲线显示对于10μg/ml的浓度1h后增加(图16f)；处理2h后增加减少(图16g)。记录白色念珠菌caf2-1野生型菌株的相似两性霉素b反应(图22)。在单个细胞水平上，更大数目的细胞显示对于0.1μg/ml至0.5μg/ml的范围内的两性霉素b浓度的显著减少的移动(图21至图22)，这对应于报道的该菌株的mic值0.3μg/ml[24]。
[0304]
为了评估细胞是否与玻璃表面显著相互作用——这可能影响测量的位移，将细胞排斥表面(pll-peg涂覆的玻璃表面)上的细胞纳米运动与未处理的玻璃表面上的细胞纳米运动进行比较。对于用卡泊芬净处理的白色念珠菌dsy294和dsy1024获得了类似结果(图23)。二氧化硅珠在pll-peg涂覆的表面上的移动显示，对位移分布和总位移有小的影响(图18a至图18d)。当念珠菌细胞通过伴刀豆球蛋白a附着到玻璃表面时，位移大大减少，并且在卡泊芬净处理的细胞与未处理的细胞之间没有检测到显著差异(图18f至图18k)。
[0305]
为了突出显示在生命-死亡转变期间发生的振荡模式的差异，在频域中执行数值分析(图7a至图7d)。每个频率范围由其低频极限和高频极限表征。利用本记录方法，低频极限被确定为信号持续时间的倒数值，其对于12s等于0.083hz。计算高极限更复杂并且在不同细胞之间变化。将高频极限命名为临界频率(f
crit
)并且设计了针对f
crit
的计算的过程。这些分析揭示，未处理的抗性白色念珠菌细胞在f
crit
从0.7hz变化到1.5hz的频率范围(0.083至f
crit
)内显示最大活动性。有趣的是，白色念珠菌dsy294也具有较高频率(2.5hz至3.0hz)的f
crit
(图7c)，而卡泊芬净处理的细胞显示其f
crit
变宽，这对于高度易感(敏感型)dsy1024细胞扩展最大(图7d)。在该情况下，还观察到约2hz的附加f
crit
。这些结果显示，暴露于低抗真菌剂浓度的垂死细胞由增加的细胞振荡频率来表征，并且活酵母细胞与死亡酵母细胞之间的频域中的振荡模式的最大差异位于非常低的频率范围内。
[0306]
通过使用检测各个酵母细胞的深度学习算法进一步加速数据处理(图3d)。深度学习模型在自动化对象[28，29]和细胞检测[30，31]任务中已经广泛成功。与人工选择细胞相比，该方法可以允许自动分析显著更大量的细胞(100至1000)。所开发的算法基于中等大小的浅yolo[30]架构。
[0307]
该示例中使用的对于afst的这种新开发的onmd方法基于基本的实验室材料，即光学显微镜、相机和计算机。该技术是无标记的，并且不需要将活样本附着在基底上。该技术允许快速测定许多酵母物种的抗真菌剂易感性和代谢活动性；并且可能扩展到其他微生物例如细菌和哺乳动物细胞。该技术还允许突出显示活酵母细胞以相对低的频率即4hz以下振荡。方法可以处理单个细胞以及整个细胞群的纳米运动模式。onmd具有在大的群体中检测单个抗性细胞的潜力。当前onmd方法的限制是仅记录x-y移动。可以通过还考虑z轴移动[10]来扩展测量包络，这将进一步增加方法的灵敏度。
[0308]
可以通过比较存在和不存在营养物的情况下细胞的纳米运动，以及通过检测最佳生长温度下的最大细胞移动，将单个酵母细胞的细胞纳米运动与其代谢活动性联系起来。从x-y位移图和1000帧期间位移的分布清楚的是，活的单细胞纳米运动显示出非随机行为。
[0309]
对针对白色念珠菌dsy294和白色念珠菌caf2-1的增加的两性霉素b浓度的纳米运动分析显示，基于单个细胞的每帧位移的分布的分析似乎比基于整个细胞群的总位移的分析更灵敏。在20个细胞的群体中，低至该抗真菌剂的mic的浓度的影响变得显著。另外，结果表明，在约mic 10倍的两性霉素b浓度下，细胞纳米运动增加。这表明两性霉素b(其选择性地接合至细胞膜中的麦角固醇并且导致孔的形成[32])的作用机制增加了细胞的移动，即抗真菌剂作用增加了细胞的代谢活动性，这可能是由于外排泵的活动性的增加。先前也观察到细菌百日咳鲍特菌的纳米运动(通过afm-悬臂方法测量)对于抗生素的增加[33]。
[0310]
对纳米运动频率模式的分析证明单个活酵母细胞以约2hz的相对低频振荡。这些结果补充了突出显示酿酒酵母细胞壁在0.8khz至1.6khz的范围内的定期运动的gimzewski和同事所公布的那些结果[34]。这些测量是通过afm对机械地截留在过滤器孔中的酵母细胞实现的。超声激发和干涉运动检测允许检测330khz的范围内的单个酿酒酵母细胞的共振频率，其对应于细胞的刚性体振荡[35]。这样的高频范围太高，以至于不能用光学显微镜装置来测量。因此，观察到的低频振荡可能对应于单个酵母细胞的全身位移。涉及高速光学显微镜和基于afm的测量的未来实验应当突出显示细胞振荡的全谱和低频细胞壁振荡的可能贡献。
[0311]
可能引起所观察到的振荡的分子过程还没有详细研究。包括阻断或激活分子因子(过程)的另外的实验将允许更好地理解观察到的现象。纳米运动信号由产生于许多代谢相关源的振动构成，这些代谢相关源将能量消耗与局部移动或分子重分布相组合[36]。细胞纳米运动可以由诸如dna复制、dna转录、蛋白质组装、细胞骨架重排、离子泵活动性、细胞器运输等的过程引起。细胞骨架的参与已经通过以下而得到证明：由细胞松弛素解聚成骨细胞的肌动蛋白细胞骨架，这导致细胞移动减少(如通过afm-悬臂方法所测量的)[9]。蛋白质的构象改变(如对人拓扑异构酶ii[37]所证明的)也可以促进纳米运动。
[0312]
通过使用深度学习算法使细胞识别自动化，可以避免人工细胞检测，并且扩展分析的细胞的数目，并且减少处理时间。另外，这为分析更大的细胞群开辟了道路。未来的开发将包括专用微流体芯片开发和软件优化，以在低端计算机上运行采集和/或数据处理步骤。这些开发最终会导致容易操作的移动设备，其可以直接在医院中实现，或者甚至在发展中国家的偏远医生的实践中实施，其中其将使得能够在最早可能的治疗阶段执行抗真菌剂易感性测试，并且做出针对个性化有效抗真菌治疗的适当决定。在一个示例中，所使用的软件的可替选方案可以是mobilenet而不是yolo深度学习架构，以在低端计算机上运行采集和/或数据处理步骤。
[0313]
在以上讨论的示例中，菌株和细胞生长如下：
[0314]
通过用来自ypd琼脂(20g/l)板的菌落接种10ml ypd(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖)培养基来培养所有酵母菌株(表1)。培养物在锥形瓶(30℃和200rpm)中生长过夜。将过夜的培养物在5ml ypd培养基中稀释10倍至20倍以获得0.5的od
600
nm，并且然后能够在锥形瓶中在30℃和200rpm下生长1h。之后取决于细胞浓度(od
600nm
值)进一步稀释培养物以获得用于可视化的最佳细胞数。
[0315]
在示例中，光学纳米运动实验执行如下：
[0316]
使用成像微皿(ibidi，德国)中的4孔fultrac微插入物(ibidi，德国)，将10μl的每种酵母细胞培养物分配在微孔中之一中。在开始测量之前，使得酵母细胞沉淀10min的时间段。通过使用emccd相机(andor ixon，牛津仪器公司)以84fps的帧速率拍摄1000帧的影像，使用具有40倍物镜的nikon te-2000显微镜观察细胞的移动。使用显微镜载物台顶部培养箱(ibidi，德国)将培养皿保持在30℃。
[0317]
将乙醇对细胞的生存力的影响与在ypd培养基中生长的细胞作为参考进行比较。因此，记录第一细胞纳米运动视频，并且接下来(在约1min之后)，将200μl乙醇(70％v/v)添加至4个微插入物孔的顶部腔室。在5h的时间段期间，每小时记录一次视频。卡泊芬净、两性霉素b和氟康唑在抗真菌剂易感性测试中用作抗真菌剂，即以评估它们对细胞生存力的影响。在开始用抗真菌剂处理之前，记录了ypd培养基中的酵母细胞的参考(无处理)视频(时间＝0h)。然后(在时间＝1min)将200μl一定浓度的抗真菌剂添加至4个微孔上方的腔室(200μl)。在5h的时间段期间每小时进行一次测量。作为非生物参考颗粒，使用直径为3μm的二氧化硅微珠(单分散二氧化硅标准，怀特豪斯科学公司)。将珠溶解在ypd培养基中，并且在30℃下执行测量。
[0318]
对于评估温度对代谢的影响的实验，通过调整在微孔周围循环的水(来自再循环水浴)的温度来控制微孔内的温度。温度从13℃依次调整到20℃、25℃、30℃以及最后35℃。在测量细胞的纳米运动之前，使得酵母细胞在20min期间适应每个温度。对于在pbs(磷酸盐缓冲盐水；8mg/ml nacl，0.20mg/ml kcl，1.44mg/ml na2hpo4，0.24mg/ml kh2po4)中的细胞活动性与ypd生长培养基进行比较的实验，过夜培养的细胞在ypd培养基或pbs中稀释1000倍，并且立即分配在微孔中。在4h期间每小时测量一次酵母细胞的纳米运动。对于玻璃表面处理的实验，通过用涂覆溶液培养玻璃表面30min，用伴刀豆球蛋白a(2mg/ml，sigma)或pll-g-peg(0.1mg/ml，susos ag，瑞士)涂覆玻璃表面。
[0319]
本示例中使用的纳米运动检测软件如下：
[0320]
光学纳米运动检测算法计算每一帧的细胞位移，并且将跟踪的细胞的轨迹以及位移的均方根保存到ms excel文件中。程序的主要部分基于guizar-sicairos等[14]的算法，在开源图像处理库sci-kit图像中从matlab导入到python[38]。采用python包nd2阅读器(verweij r，在线：http://www.lighthacking.nl/nd2reader/)来导入nd2nikon格式的视频。
[0321]
使用的深度学习细胞检测算法如下：
[0322]
先前描述的所描述的纳米运动分析从每个各个细胞的位置开始，当前通过人工选择第一视频帧中的细胞的边界框来提供该位置。然而，视频和视频中存在的细胞的数目可能相当大，尤其是当确定mic或不同温度条件的影响时。更重要的是，在每几帧而不是仅在第一视频帧提供细胞检测，使得能够校正从其初始位置漂移的这些细胞的位置。在这些情况下，对于多帧注释，人工检测工作可能跨越若干小时，并且因此必须由细胞的自动检测过程来代替。因此，决定使用深度学习算法，即中等大小的yolo架构，来使细胞检测自动化。使用随机生成的一组50000个合成细胞图像来执行训练过程。使用先前提出的相衬成像模型[39]获得的这些合成图像在细胞分布、照明和成像伪影方面与用显微镜获得的细胞图像相比看起来非常相似。一旦yolo模型被训练，它就被用于自动检测真实显微图像中的细胞，并
且每个检测然后被用作初始位置以利用先前描述的互相关算法计算光学纳米运动。整个处理流水线从大量视频序列开始，并且执行每帧自动单细胞检测。接下来，通过平均跨帧的检测置信度和细胞位置来对结果进行细化，以校正连续帧之间的突然改变。最后，提供以高置信度(即＞0.6)检测到的细胞的位置作为纳米运动分析算法的输入(图3d)。
[0323]
过程的进一步自动化如下：
[0324]
整个过程包括读取一系列帧作为包含细胞的图像，以及每10帧应用一次上述细胞检测过程以获得指示自动检测到的每个各个细胞的位置的一组边界框。基于它们的位置，随着视频分析过程展开，跨时间跟踪细胞。最后，在子序列细化阶段中，找出由边界框指示的细胞的轮廓以确认其中心大致对应于边界框的中心，并且然后使用任何失配按比例惩罚细胞检测置信度。另外，跨帧平均边界框位置和检测置信度，以避免细胞检测位置的急剧改变。
[0325]
光学记录的细胞移动的频率区域和临界频率的计算如下：
[0326]
基于计算fft幅度谱的方法被开发用于计算光学记录的酵母细胞移动的频率区域和临界频率，该fft幅度谱是针对细胞移动的两个信号计算的，这两个信号一个在水平(“x”)方向，另一个在垂直(“y”)方向。将该方法称为双区内插法(drim)。该思想是在两个不同的频率区域中对这些平均幅度执行两次线性内插。一次线性内插应当在频谱的宽带噪声部分进行，其充分远离细胞活动区域(例如，5hz至10hz)。另一线性内插在低频区域上执行，其中细胞是活动的。这两条直线之间的交叉点确定细胞活动性区域的上临界频率。
[0327]
确定细胞移动的频率范围的方法基于对两个去趋势信号直接应用fft算法：一个去趋势信号是针对水平(x)方向上的移动获得的，另一去趋势信号是针对垂直(y)方向上的移动获得的。x和y谱两者具有相似的曲线；然而，一些幅度略微不同。因此得出它们的逐频率平均，以同等地合并两个方向上的细胞移动的频率。由于信号是以83帧/s的采样频率记录的，因此在视觉上检查高达41hz的频率，并且确认细胞运动被限制在仅几hz(图7a插入图)。由于每个信号包含1000个样本(12.0482s的持续时间)，因此每个fft频谱从最初的12s获得，导致0.083hz的频率分辨率。为了保持其分辨率，将fft应用于作为整体的每个12s信号，从而避免任何较短的移动窗口。确定细胞移动的频率范围的任务意味着评估其上临界频率和下临界频率两者。
[0328]
图24示出了互相关程序，特别是对将通过互相关算法分析的各个细胞的人工选择。两个框以这样的方式定位，使得它们包围细胞的至少一部分。框1(由白色箭头触及)用于x轴偏移跟踪，框2(由黑色箭头触及)用于y轴偏移跟踪。
[0329]
数据可用性如下：
[0330]
支持本文中的图的数据以及本研究的其他发现能够根据请求从对应的作者获得。
[0331]
表1：
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