一种核苷类化合物及其药物组合物和用途的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种核苷类化合物及其药学上或生理上可 接受的盐的组合物在制备抗冠状病毒或抗流感病毒药物中的用途。


背景技术：

2.2019新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种新型的冠状病毒，具有极强的传播 能力。它是一种有包膜的单链rna病毒，rna长度达到近30kb，n蛋白 (nucleocapsid)外壳的包膜中含有s(spikeprotein，刺突蛋白)、m(membraneprotein，膜蛋白)和e(envelope protein，包膜蛋白)三种蛋白。目前发现 的最主要的感染途径是病毒的s蛋白的rbd(receptor binding domain，受体 结合区)与细胞膜表面的ace2蛋白结合，导致细胞膜与病毒包膜融合，最终病 毒感染宿主细胞。
3.研发治疗和预防新型冠状病毒sars-cov-2感染的抗病毒新药，对于降低 covid-19患者的重症率和死亡率、阻断疫情的蔓延和再度爆发均具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供具有抗sars-cov-2新型冠状病毒或抗流感病毒作用的化合物。
5.本发明提供以下所示的发明。
6.具体涉及一种核苷类化合物及其药学上或生理上可接受的盐的组合物在制备抗冠状病 毒或抗流感作用药物中的用途。其特征是：
[0007][0008]
其中：
[0009]
(1)r1、r2、r3、r5、和r6各自独立地选自氢或氘；
[0010]
(2)r4选自氢、氘、氰基、叠氮基、巯基、氨基、卤素、烷基、烯基、炔基；
[0011]
(3)r7、r8、和r9各自独立地选自h、各种天然或非天然氨基酸酰基、羧酸酰基、 多肽酰基、磺酰胺基；r8和r9可以成环；
[0012]
(4)r
10
选自羟基、氨基或羟胺基。
[0013]
在一些实施方案中，本发明涉及到以下其中之一的化合物或其药学上或生理上可接受的 盐，其特征在于，所述的化合物选自如下结构，但绝不限于这些化合物：
[0014]
[0015]
[0016][0017]
另一方面，本发明提供了所述化合物或所述药物组合物在制备药物中的用途，其中所述 药物用于预防、处理、治疗或减轻患者病毒感染性疾病。
[0018]
在一些实施方案中，该药物组合物为抗病毒药物组合物，其中还选择性地包含一种或多 种治疗剂，
[0019]
所述治疗剂，选自肽类药物、其它抗新型冠状病毒或抗流感病毒药物。
[0020]
一种所述的药物组合物在制备具有抗新冠病毒或流感病毒的制剂中的应用。
[0021]
本发明所涉及的化合物制备方便，效果确切。
具体实施方式
[0022]
下面结合实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。本发明 使用的试剂和原料均为商购所得。
[0023]
实施例1.
[0024][0025][0026]
化合物3的制备
[0027]
在250毫升的圆底烧瓶中加入化合物2(1.2g,10.2mmol),bsa(4.8ml,19.66mmol) 和无水乙腈(40ml)。在80℃下，混合物搅拌反应半小时后，冷却至室温，加入化合 物1(6.5g,20.4mmol),滴加tmsotf(3.6ml，19.85mmol)。反应混合物在80℃下搅 拌反应2小时后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(200ml),分别用饱和碳酸氢钠(2x50ml), 饱和食盐水(60ml)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，残留物经柱层 析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物3(3.5g,91％)。1h nmr(400mhz,cdcl3) δ9.31(br s,1h,nh),6.03(d,j＝4.8hz,1h,h-1
′
),5.37
–
5.29(m,2h),4.39
–
4.28(m,3h), 2.13(s,3h,aco),2.12(s,3h,aco),2.09(s,3h,aco).lcms(esi):m/z 373.2(m h)

。
[0028]
化合物i-5的制备
[0029]
在125毫升的圆底烧瓶中加入1,2,4-三氮唑(1.55g,22.5mmol)和无水乙腈(30ml), 用冰浴冷却至0℃，滴加三氯氧磷(0.48ml,5mmol),加毕，搅拌15分钟；0℃下滴 加三乙胺(3.1ml,22.5mmol),加毕，反应混合物在0℃下搅拌1小时。向反应混合物 中加入化合物3(0.93g,2.5mmol)的乙腈(30ml)溶液,随后室温搅拌过夜至反应完 成。加入ph 7的缓冲溶液(100ml)终止反应，用二氯甲烷(3x100ml)萃取，合并 的有机相用无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，柱层析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得 化合物4。将化合物4溶解在乙腈(50ml)中，加入50％羟胺水溶液(1ml),室温下搅 拌反应20分钟至完成，蒸去溶剂后，残留物经柱层析(0-15％甲醇/二氯甲烷)纯化得 化合物i-5(660mg,68％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ5.83(d,j＝4.8hz,1h),4.38(m, 2h),4.28
–
4.11(m,3h),2.15(s,3h,aco),2.13(s,3h,aco),2.10(s,3h,aco).lcms (esi):m/z 388.1(m h)

。
[0030]
化合物i-1的制备
[0031]
在250毫升的圆底烧瓶中加入化合物i-5(400mg)及饱和的氨/甲醇溶液(100ml), 室温下搅拌反应2天，蒸去溶剂后，残留物经柱层析(0-20％甲醇/二氯甲烷)纯化得白 色固体化合物i-1(192mg,71％)。1h nmr(400mhz,d2o)δ5.85(d,j＝5.6hz,1h),4.18 (t,j＝5.5hz,1h),4.12(dd,j＝5.6hz,3.8hz,1h),3.95(q,j＝3.4hz,1h),3.78(dd,j＝12.2 hz,2.9hz,1h),3.65(dd,j＝12.2hz,3.4hz,1h)；lcms(esi):m/z262.1(m h)

。
[0032]
实施例2
[0033][0034]
化合物5的制备
[0035]
将丁基锂/己烷(1.6m,0.8ml,1.28mmol)逐滴加入搅拌的三氟乙醇(2ml)中，并且 发生适度放热。将所得溶液加入到含有化合物3(238mg,0.64mmol)的单口烧瓶中，反 应混合物在室温下搅拌半小时至选择性脱酰化完成(tlc跟踪)。加入乙酸(0.5ml， 8.33mmol)，减压除去溶剂后，残留物经柱层析(0-15％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物 5(148mg,80％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.12(d,j＝5.0hz,1h),4.39(m,2h),4.27
ꢀ–
4.13(m,3h),2.12(s,3h)；lcms(esi):m/z 289.2(m h)

。
[0036]
化合物i-3的制备
[0037]
在50毫升的圆底烧瓶中加入化合物5(144mg,0.5mmol)和乙腈(5ml)，氮气保护下， 在0℃下滴加三乙胺(1.26ml,9mmol),随后滴加三甲基氯硅烷(256ul,2.0mmol), 反应混合物在室温搅拌1小时后，再用冰浴冷却至0℃，滴加三氯氧磷(150ul,1.6mmol), 加毕，搅拌15分钟后，加入1,2,4-三氮唑(345mg,5.0mmol)，反应混合物在0℃下 搅拌1小时。随后室温搅拌过夜至反应完成。加入ph 7的缓冲溶液(20ml)终止反应， 用二氯甲烷(3x100ml)萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，柱层 析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得中间体化合物。将中间体化合物溶解在乙腈(2ml) 中，加入50％羟胺水溶液(60ul),室温下搅拌反应20分钟至完成，蒸去溶剂后，残留 物加入醋酸/甲醇(1:4，1ml),室温搅拌1小时，减压下蒸去溶剂后，残留物经柱层 析(0-25％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物i-3(62.2mg,41％)。1h nmr(400mhz, cd3od)δ5.93(d,j＝5.0hz,1h),4.34(d,j＝3.4hz,2h),4.20
–
4.11(m,3h),2.11(s,3h). lcms(esi):m/z 304.1(m h)

。
[0038]
实施例3.
[0039][0040]
化合物8的制备
[0041]
α/β-d-呋喃核糖-1,2,3,5-四-o-异丁酸酯。向1.24g(6.09mmol)1-o甲基-α/β-d
‑ꢀ
呋喃核糖添加25ml(150mmol)异丁酸酐和1.0ml(11mmol)异丁酸。将反应在100℃ 下加热2小时，然后将其冷却至室温。随后，加入0.3ml(5.6mmol)98％浓硫酸， 并将溶液在室温下搅拌2小时至反应完成。将整个混合物倒入50ml冰冷的1.2m碳 酸氢钠溶液中，混合物用二氯甲烷(2
×
50ml)萃取，然后合并的二氯甲烷层用水反萃 取。根据需要过滤提取物以破坏任何乳液。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩 成油。残留物经柱层析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化，α和β异头异构体分不开， 而是合并在一起得到异头异构体产物混合物。为了除去最后痕量的异丁酸，将油状产物 混合物溶解在乙酸乙酯中，然后用1.2m碳酸氢钠水溶液和盐水萃取。有机层用无水硫 酸钠干燥，过滤并真空浓缩成油。将其在高真空(《1mmhg，环境温度)下干燥3天，得 到2.40g(74％)浅黄色油状的产物7。
[0042]
在圆底烧瓶中加入化合物2(0.3g,2.55mmol),bsa(1.2ml,4.92mmol)和无水 乙腈(15ml)。在80℃下，混合物搅拌反应半小时后，冷却至室温，加入化合物7(2.2g, 5.1mmol),滴加tmsotf(0.9ml，4.96mmol)。反应混合物在80℃下搅拌反应2小时 后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(100ml),分别用饱和碳酸氢钠(2x30ml),饱和食 盐水(30ml)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-2％ 甲醇/二氯乙烷)纯化得化合物8(1.9g,83％)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ9.25(s,1h), 6.13
–
6.02(m,1h),5.34
–
5.27(m,2h),4.42
–
4.25(m,3h),2.67
–
2.48(m,3h),1.26
–
1.06(m, 18h)；lcms(esi):m/z 457.5(m h)

。
[0043]
化合物i-6的制备
[0044]
用合成i-5的方法，制备化合物i-6。lcms(esi):m/z 472.3(m h)

。
[0045]
实施例4.
[0046][0047]
化合物9的制备
[0048]
将丁基锂/己烷(1.6m,0.8ml,1.28mmol)逐滴加入搅拌的三氟乙醇(2ml)中，反应 发生适度放热。将所得溶液加入到含有化合物8(292mg,0.64mmol)的单口烧瓶中，反 应混合物在60℃下搅拌2小时至选择性脱酰化完成(tlc跟踪)。加入乙酸(0.5ml， 8.33mmol)终止反应，减压除去溶剂后，残留物经柱层析(0-15％甲醇/二氯甲烷)纯化 得化合物9(121mg,60％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ5.92(d,j＝4.8hz,1h),4.32(d, j＝3.6hz,2h),4.18
–
4.10(m,3h),2.65(m,1h),1.21(d,j＝7.0hz，6h)；lcms(esi): m/z 317.3(m h)

。
[0049]
化合物i-2的制备
[0050]
用合成i-3的方法，制备化合物i-2。1h nmr(400mhz,cd3od)δ5.83(d,j＝4.8hz,1h), 4.32(d,j＝3.6hz,2h),4.19
–
4.11(m,3h),2.64(m,1h),1.22(d,j＝7.0hz，6h)；lcms (esi):m/z 332.2(m h)

。
[0051]
类似方法合成下列化合物:
[0052][0053][0054]
实施例5.
[0055][0056]
化合物11的制备
[0057]
在0℃下，将α-d-1,3,5-三-o-苯甲酰基呋喃核糖10(5.0g,10.8mmol)添加到 dess-martin periodinane(7.73g,16.2mmol)在二氯甲烷(50ml)的悬浮液中，混合物升 温至室温并搅拌12小时。真空除去溶剂，残余物加入乙醚(100ml)研磨。通过无水硫 酸镁过滤后，将有机层与等体积的硫代硫酸钠(12.5g)在100ml饱和碳酸氢钠中的溶 液一起搅拌，直到有机层变得清澈(约10分钟)。分离有机层，用盐水洗涤，无水硫 酸镁干燥，然后真空除去溶剂。从乙醚和己烷的混合物中沉淀出酮11(4.47g，90％)； 1
h nmr(400mhz,cdcl3)8.13-7.98(m,6h),7.64-7.33(m,9h),6.39(s,1h),6.19(s,1h), 5.86(d,j＝8.8hz,1h),5.22(d,j＝5.4hz,1h),5.02(dd,j＝4.3,8.7hz,1h),5.01(bd s, 1h),4.82(dd,j＝3.5,12.5hz,1h),4.61(dd,j＝4.5,12.5hz,1h),4.09(bd s,1h)。
[0058]
化合物12的制备
[0059]
干燥的七水氯化铈(iii)(2.25g,9.1mmol)和11(4.2g,9.1mmol)加入到四氢呋喃(50ml) 中，混合物在室温下搅拌30分钟。一次性加入氘代硼氢化钠(764mg，18.2mmol)，并 将混合物在室温下搅拌1小时。随后缓慢滴加氘代醋酸(4.4g，72mmol)淬灭反应。搅 拌1小时后，加入乙醚(200ml)稀释并用水洗涤。如上所述干燥并浓缩有机层，得到粗 化合物12(3.85g，91.4％)。这种粗产物在随后的反应中与重结晶物质一样有效。通 过从乙醇:二氯乙烷(1:1,24ml)中结晶进一步纯化，得到纯化合物12(3.19g,75.6％)： 1
h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.12-8.01(m,6h),7.62-7.35(m,9h),6.66(s,1h),5.56(d,j ＝1.9hz,1h),4.73(ddd,j＝3.3,1.9,1.2hz,1h),4.62(dd,j＝1.4,1.9hz,2h),2.73(s,1h)。
[0060]
化合物13的制备
[0061]
新蒸馏的苯甲酰氯(7.0g,50.1mmol)用注射器将其加入到12(2.32g,5.0mmol) 的吡啶溶液中(25毫升)。搅拌12小时后，加入水(25ml)将反应淬灭，然后分批加 入碳酸氢钠(8.4g,100mmol)。混合物用乙醚(2x200ml)萃取，饱和食盐水洗涤， 无水硫酸镁干燥，浓缩,残留物经柱层析(20-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物13 (3.5g,91％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.12-8.02(m,6h),7.86-7.83(m,2h), 7.59-7.24(m,12h),6.94(s,1h),5.90-5.89(d,j＝2.2hz,1h),4.92-4.90(m,1h),4.79-4.64 (m,2h)。
[0062]
化合物15的制备
[0063]
100ml的圆底烧瓶中加入尿嘧啶(400mg,3.6mmol)和无水乙腈(30ml),向反应瓶 中加入bsa(1.5g,7.3mmol),混合物在80℃下反应30分钟得澄清溶液，冷却至室温。 将干燥的13(1.93g,0.34mmol)加入到上述甲硅烷基化反应瓶，在-10℃下通过注射器 将四氯化锡(2.8g,11mmol)加入到反应溶液中，搅拌并在12小时内升温至室温，反应 液加入乙酸乙酯(200ml)，用饱和碳酸氢钠溶液(3x50ml)和盐水(50ml)洗涤， 然后用无水硫酸钠干燥浓缩,
残留物经柱层析(40-70％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物 14(1.33g,70％)。化合物14加入饱和氨甲醇溶液(60ml)，室温搅拌反应2天进行氨 解去保护，反应完成，蒸去溶剂，残留物经柱层析(5-20％甲醇/乙酸乙酯)纯化得2'
‑ꢀ
氘代尿苷15(571mg，96％)。1h nmr(400mhz,d2o)δ8.01(d,j＝8.0hz,1h),5.88(s,1h), 5.69(d,j＝8.0hz,1h),4.15(d,j＝4.7hz,1h),3.99(m,1h),3.86-3.69(m,2h)。
[0064]
化合物16的制备
[0065]
将化合物15(500mg,2.05mmol)溶解在吡啶(10ml)中,并在10分钟内缓慢加入乙酸酐。 将溶液在60℃加热3小时，加入冰淬灭反应，将粗产物溶解在乙酸乙酯(50ml)中并 用5％盐酸(20ml)、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(20ml)、盐水(20ml)并经无水硫酸镁 干燥，真空除去溶剂得到胶状固体，将其与乙醇一起搅拌得到定量白色粉末状产物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.31(br s,1h),7.39(d,j＝8.2hz,1h),6.03(d,j＝4.8hz,1h), 5.79(d,j＝8.1hz,1h),5.37
–
5.29(m,1h),4.39
–
4.28(m,3h),2.13(s,3h),2.12(s,3h), 2.09(s,3h)；lcms(esi):m/z 372.2(m h)

。
[0066]
化合物i-23的制备
[0067]
用合成i-5的方法，制备化合物i-23。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.18(d,j＝8.4hz, 1h),5.88(s,1h),5.63(d,j＝8.4hz,1h),4.34(m,1h),4.05
–
3.68(m,3h),2.15(s,3h), 2.12(s,3h),2.11(s,3h).lcms(esi):m/z387.2(m h)

。
[0068]
化合物i-19的制备
[0069]
在250毫升的圆底烧瓶中加入化合物i-23(401mg,1mmol)及饱和的氨/甲醇溶液 (100ml),室温下搅拌反应2天，蒸去溶剂后，残留物经柱层析(0-20％甲醇/二氯甲烷) 纯化得白色固体化合物i-19(215mg,82％)。1h nmr(400mhz,d2o)δ7.18(d,j＝8.0 hz,1h),5.88(s,1h),5.68(d,j＝8.0hz,1h),4.16(d,j＝4.8hz,1h),3.99(m,1h),3.91
–ꢀ
3.68(m,2h)；lcms(esi):m/z 261.1(m h)

。
[0070]
实施例6.
[0071][0072]
用合成i-3的方法，从化合物16制备i-21。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.17(d,j＝8.0 hz,1h),5.98(s,1h),5.75(d,j＝8.0hz,1h),4.43
–
4.21(m,4h),1.20(s,3h)；lcms (esi):m/z 303.2(m h)

。
[0073]
实施例7.
[0074][0075]
用合成化合物16、i-6的方法，制备化合物i-24。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.21(d, j
＝8.0hz,1h),5.93(s,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),4.48
–
4.27(m,4h),2.68
–
2.54(m, 3h),1.22
–
1.16(m,18h)；lcms(esi):m/z 471.2(m h)

。
[0076]
实施例8.
[0077][0078]
用合成i-2的方法，制备化合物i-20。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.16(d,j＝8.0hz, 1h),5.89(s,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),4.43
–
4.18(m,4h),2.61(m,1h),1.20
–
1.16(m, 6h)；lcms(esi):m/z 331.2(m h)

。
[0079]
实施例9.
[0080][0081]
化合物21的制备
[0082]
参考文献(j.am.chem.soc.1985,107,7628-32)以双丙酮-d-葡萄糖为原料，经多步反应 制备化合物21。1h nmr(400mhz,acetone-d6)δ8.07
–
8.01(m,4h),7.71
–
7.48(m,6h), 6.22(s,1h),5.54(s,1h),4.76
–
4.80
–
4.50(m,3h),2.10(s,3h),1.96(s,3h).
[0083]
化合物22的制备
[0084]
在250毫升的圆底烧瓶中加入尿嘧啶(2.25g,20.3mmol)、bsa(9.5ml,38.6mmol)和无水 乙腈(60ml),混合物在80℃搅拌半小时得一澄清溶液，冷却至室温，加入化合物21(5g, 11.2mmol)，随后滴加tmsotf(7.0ml,38.6mmol),混合物在80℃搅拌反应2小时后， 冷却至室温，加入乙酸乙酯(200ml)稀释，饱和碳酸氢钠(2x60ml)、饱和食盐水 (60ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，
[0085]
浓缩,残留物经柱层析(20-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物22(4.71g,85％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.2(s,1h),8.10
–
8.03(m,4h),7.70
–
7.45(m,4h),7.36(d,j＝ 8.4hz,1h),6.23(d,j＝5.6hz,1h),5.62
–
5.52(m,2h),4.85
–
4.60(m,3h),2.10(s,3h)； lcms(esi):m/z 496.2(m h)

。
[0086]
化合物i-25的制备
[0087]
用合成i-1的方法，以化合物22为原料制备化合物i-25。1h nmr(400mhz,cd3od) δ7.18(d,j＝8.0hz,1h),5.88(d,j＝5.6hz,1h),5.65(d,j＝8.0hz,1h),4.21(d,j＝5.6 hz,1h),3.96(t,j＝3.2hz,1h),3.80(dd,j＝12.0,2.8hz,1h),3.71(dd,j＝12.0,3.2hz, 1h)；
lcms(esi):m/z 261.1(m h)

。
[0088]
实施例10.
[0089][0090]
化合物24的制备
[0091]
在250毫升的圆底烧瓶中加入化合物22(990mg,2mmol)和饱和氨甲醇溶液(100ml)， 室温搅拌2天至反应完成，减压除去溶剂后，残留物经柱层析(0-25％甲醇/二氯甲烷) 纯化得化合物24(407mg,83％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.77(d,j＝8.0hz,1h), 5.90(d,j＝4.8hz,1h),5.70(d,j＝8.0hz,1h),4.19(d,j＝4.8hz,1h),4.01(t,j＝2.8hz, 1h),3.85(dd,j＝12.0,2.8hz,1h),3.74(dd,j＝12.0,3.2hz,1h)；lcms(esi):m/z 246.2 (m h)

。
[0092]
化合物25的制备
[0093]
圆底烧瓶中加入化合物24(245mg,1mmol)和无水吡啶(5ml),随后在0℃下滴加异丁 酸酐(6mmol),反应混合物室温搅拌过夜，减压蒸去溶剂后，加入乙酸乙酯(100ml), 分别用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)、饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，减 压蒸去溶剂后，残留物经柱层析(20-55％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物25(383mg, 84％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.67(d,j＝8.0hz,1h),5.95(d,j＝4.8hz,1h),5.75 (d,j＝8.0hz,1h),5.48(d,j＝4.8hz,1h),4.42
–
4.32(m,3h),2.68
–
2.56(m,3h),1.21
–ꢀ
1.18(m,18h)；lcms(esi):m/z 456.2(m h)

。
[0094]
化合物i-30的制备
[0095]
用制备化合物23的方法，合成化合物i-30.1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.95(d,j＝8.0 hz,1h),5.96(d,j＝6.0hz,1h),5.65(d,j＝8.0hz,1h),5.40(d,j＝6.0hz,1h),4.43
–ꢀ
4.27(m,3h),2.69
–
2.55(m,3h),1.22
–
1.16(m,18h)；lcms(esi):m/z 471.3(m h)

。
[0096]
实施例11.
[0097][0098]
用合成i-2的方法，制备化合物i-26。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.01(d,j＝8.0hz, 1h),5.93(d,j＝4.8hz,1h),5.66(d,j＝8.0hz,1h),5.47(d,j＝4.8hz,1h),4.41
–
4.30 (m,3h),2.66
–
2.55(m,1h),1.21
–
1.18(m,6h)；lcms(esi):m/z 331.2(m h)

。
[0099]
实施例12.
[0100][0101]
化合物i-29的制备
[0102]
用合成化合物25和i-30的方法制备化合物i-29。1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.98(d, j＝8.0hz,1h),5.98(d,j＝4.8hz,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),5.48(d,j＝4.8hz,1h), 4.43
–
4.30(m,3h),1.20(s,3h),1.16(s,3h),1.14(s,3h)；lcms(esi):m/z 387.2(m h)
。
[0103]
实施例13.
[0104][0105]
化合物i-27的制备
[0106]
用合成i-3的方法，制备化合物i-27。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.09(d,j＝8.0hz, 1h),5.89(d,j＝6.0hz,1h),5.65(d,j＝8.0hz,1h),4.18(d,j＝6.0hz,1h),3.95(t,j＝ 3.2hz,1h),3.80(dd,j＝12.0,2.8hz,1h),3.70(dd,j＝12.0,3.2hz,1h),1.22(s,3h)； lcms(esi):m/z 303.2(m h)

。
[0107]
实施例14.
[0108][0109][0110]
参照文献(j.org chem,1976,3010),8(2),257-71)以尿苷为原料
[0111]
化合物30的制备
[0112]
将尿苷(15.0g，60.2mmol)溶解在含有浓硫酸(1.0毫升)的丙酮(200毫升)中。在 室温下搅拌过夜后，将混合物减压浓缩。残留物经柱层析(0-5％甲醇/二氯甲烷)纯化 得化合物30(16.5g,98％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(br s,1h),7.32(d,1h),5.73 (dd,1h),
5.55(d,1h),5.11-4.93(m,2h),4.31-4.23(m,1h),3.92-3.71(m,2h),2.61-2.50 (br-s,1h),1.56(s,3h),1.34(s,3h).lcms(esi):m/z 285.2(m h)

。
[0113]
化合物32的制备
[0114]
将化合物30(2.2g，7.74mmol)悬浮在二氯甲烷(30ml)中。加入二甲氨基吡啶 dmap(2.4g，19.7mmol，2.5eq)并将混合物在室温下搅拌直至化合物30完全溶解。将 反应混合物用冰浴冷却至约0℃，甲苯磺酰氯(1.8g,9.4mmol,1.2eq)分5份加入。 添加完成后，移除冰浴并将混合物在室温下搅拌反应至完成(约1.5小时,tlc跟踪反 应)。将混合物转移到分液漏斗中并用1n hcl水溶液(2
×
40ml)、饱和碳酸氢钠水溶 液(50ml)和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机溶液用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗 产物甲苯磺酸31(3.3g)。将干燥的粗甲苯磺酸酯31(3.3g)溶解在thf(50ml)中并冷 却至-10℃。搅拌下加入叔丁醇钾(2.2g，19.6mmol)，反应混合物在室温下搅拌90分钟， tlc表明反应完成。加入硅胶并将混合物减压浓缩,残留物经柱层析(0-5％甲醇/二氯 甲烷)纯化得化合物32(1.8g,87％).1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.38(br s,1h),7.22(d, 1h),5.77(dd,1h),5.65(s,1h),5.41-5.01(m,2h),4.68-4.38(m,2h),1.55(s,3h),1.45(s, 3h)。
[0115]
化合物33的制备
[0116]
将化合物32(720mg,2.7mmol,1eq)和细碎的氟化银(1.75g,13.8mmol,5eq)加 入含有二氯甲烷(50ml)快速搅拌悬浮液并冷却至0℃。在单独的瓶中，将碘(1.5g， 5.4mmol，2eq)溶解在thf(4ml)中。将碘溶液转移到滴液漏斗,在0℃下，在70 分钟内缓慢滴加到反应混合物中。加毕，混合物在0℃下继续搅拌15分钟，tlc显示 反应完成。加入饱和硫代硫酸钠(15ml)和饱和碳酸氢钠(15ml)的水溶液的混合物 来淬灭反应，混合物通过硅藻土过滤，滤垫用二氯甲烷洗涤。将两相混合物转移到分液 漏斗中并分离各相。有机相用无水硫酸钠干燥，混合物在减压下浓缩，残留物经柱层析 (0-25％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物33(910mg,82％)。1h nmr(400mhz,cdcl3) δ9.06(br s,1h),7.22(d,1h),5.73(d,1h),5.66(s,1h),5.20-5.09(m,2h),3.55-3.45(m, 2h),1.57(s,3h),1.39(s,3h)；
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-101.93(1f,r-isomer,major),
ꢀ‑
94.22(0.1f,s-isomer,minor).
[0117]
化合物34的制备
[0118]
将化合物33(2.4g，5.8mmol，1eq)溶解在dmf(25ml)中。加入叠氮化钠(1.9g, 29mmol,5eq)并将混合物搅拌并在105℃加热过夜。tlc分析表明反应不完全。添加 另外的叠氮化钠(378mg，5.8mmol，1eq)并且反应继续另外3小时，tlc表明反应完成。 让反应混合物冷却至室温并加入乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)。然后将混合物转移到 分液漏斗中并分相，水相用乙酸乙酯(30ml)萃取。用水(5
×
50ml)洗涤合并的有机层， 用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物经柱层析(20-80％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化 合物34(1.45g,77％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.98(br s,1h),7.15(d,1h),5.73 (dd,1h),5.69(s,1h),5.18-5.05(m,2h),3.57(d,1h),3.53(s,1h),1.58(s,3h),1.38(s, 3h)；
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-110.31(1f,r-isomer,major),-103.12(0.1f,s-isomer, minor).
[0119]
化合物36的制备
[0120]
将叠氮化合物34(988mg,3.2mmol,1eq)溶解在乙腈(20ml)中。将混合物用冰浴冷却 至0℃，一次性加入四氟硼酸亚硝基酯nobf4(1.06g，9.06mmol，3eq)。在0℃下搅 拌混合物30分钟。撤去冰浴，混合物在室温下搅拌1小时,tlc显示反应完成。加入 饱和食盐水和饱
和磷酸氢二钠(1:1，30ml)淬灭反应,将混合物转移至分液漏斗并用 二氯甲烷(3x50ml)萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩，得 粗产物35，并溶解在thf/h2o(9:1,12ml)中。加入tfa(60μl)并将混合物在室温搅 拌1小时。tlc表明反应完成，在减压下浓缩混合物，残留物经柱层析(0-5％甲醇/二 氯甲烷)纯化得化合物36(347mg,38％)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.11(br s,1h), 7.21(d,1h),5.76(d,1h),5.71(s,1h),5.29-5.08(m,2h),3.85(d,2h),2.33(br s,1h),1.57 (s,3h),1.37(s,3h)；
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-115.65；lcms(esi):m/z 303.2(m h)
。
[0121]
化合物37的制备
[0122]
将化合物36(151mg,5mmol)溶解在无水吡啶(5ml)中，室温下滴加醋酸酐(310ul,3 mmol),反应混合物搅拌过夜至完成，加入水(1ml)淬灭反应,在减压下浓缩混合物， 残留物经柱层析(0-3％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物37(155mg,90％)；1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.77(br s,1h),7.2(d,j＝8.0hz,1h),5.77(d,j＝8.0hz,1h),5.68(s,1h), 5.18-5.07(m,2h),4.41-4.25(m,2h),2.13(s,3h),1.60(s,3h),1.38(3h)；
19
f nmr(376 mhz,cdcl3)δ-113.02；lcms(esi):m/z 345.2(m h)

。
[0123]
化合物i-33的制备
[0124]
将化合物37(50mg)溶解在90％甲酸水溶液(5ml)中，室温搅拌90分钟至反应完成， 减压下浓缩反应混合物物，残留物经柱层析(0-10％乙醇/氯仿)纯化得化合物i-33 (33.2mg,75％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.61(d,j＝8.0hz,1h),5.88(d,1h),5.72 (d,j＝8.0hz,1h),4.51(dd,j＝19.2,6.8hz,1h),4.43-4.36(m,2h),4.28(d,1h),2.10(s, 3h),
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-123.33；lcms(esi):m/z 327.2(m na)

。
[0125]
化合物i-32的制备
[0126]
用合成i-33的方法，以化合物36为原料制备化合物i-32。1h nmr(400mhz,cd3od) δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),5.85(d,j＝2.0hz,1h),5.68(d,j＝8.0hz,1h),4.50(dd,j＝ 19.2,6.9hz,1h),4.44
–
4.34(m,2h),4.28(dd,j＝11.9,8.1hz,1h),2.71
–
2.50(m,1h), 1.19(dd,j＝7.0,4.8hz,6h).
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-123.36；lcms(esi):m/z 355.2(m na)

。
[0127]
实施例15.
[0128][0129]
化合物38的制备
[0130]
在250毫升的圆底烧瓶中加入化合物36(160g,0.53mmol)、无水二恶烷(15ml)及1:1 混合物linde 4a和aw-500分子筛(6g),在室温下加入氨磺酰氯(185mg,1.6mmol)，混 合物在室温下搅拌18小时，tlc(氯仿-甲醇，9:1)显示反应完成，加入氢氧化铵(1m， 2ml)。过滤混合物，减压蒸除滤液，留下糖浆，将其用甲醇研磨并过滤以除去氯化铵。 减压蒸除滤液，残留物经柱层析(0-5％甲醇/氯仿)纯化得化合物38(140mg,70％)；样品 可从丙酮-己烷中结晶，熔点为163.5-166.5℃。lcms(esi):m/z 382.1(m h)

。
[0131]
化合物i-34的制备
[0132]
将38(125mg,0.32mmol)加入到90％甲酸(3ml)中，室温下搅拌反应2小时，减压蒸
mhz,cd3od)δ1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.15(s,1h),5.84(d,j＝4.2hz,1h), 4.19-4.10(m,2h),4.02-3.75(m,3h),1.22(s,3h),1.16(s,3h)；lcms(esi):m/z 424.2(m h)

。
[0145]
实施例18.
[0146][0147]
类似的方法合成化合物i-67.1h nmr(400mhz,cd3od)δ1h nmr(400mhz, cd3od)δ6.90(d,j＝8.0hz,1h),5.84(d,j＝4.8hz,1h),5.62(d,j＝8.0hz,1h), 4.22-4.12(m,2h),4.03-3.75(m,3h)；lcms(esi):m/z 339.1(m h)

。
[0148]
类似的方法合成化合物i-68.1h nmr(400mhz,cd3od)δ1h nmr(400mhz, cd3od)δ6.85(s,1h),5.82(d,j＝4.8hz,1h),5.64(d,j＝8.0hz,1h),4.19-4.11(m,2h), 4.02-3.78(m,3h),1.20(s,3h),1.13(s,3h)；lcms(esi):m/z 423.2(m h)

。
[0149]
类似方法合成下列化合物:
[0150][0151]
实施例19.
[0152][0153]
化合物45的制备
[0154]
在室温下，将dmtrcl(8.67g,25.6mmol)分四份加入到尿苷29(5.00g,20.5mmol)的吡 啶(50ml)溶液中，反应混合物继续搅拌1小时至反应完成。减压蒸去溶剂，残留物加 水和二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥并真空浓缩，残留物经柱层析(0-10％甲醇/ 二氯甲烷)纯化得白色固体泡沫状化合物45(11.0g,98％)。1hnmr(400mhz,cdcl3): δ10.35(s,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.22-7.38(m,9h),6.82-6.84(m,4h),5.90(s,1h), 5.47(m,1h),
5.34(d,j＝8.0hz,1h),4.45-4.17(m,3h),3.76(s,6h),3.43-3.52(m,3h)。
[0155]
化合物46的制备
[0156]
向250ml的反应瓶中加入化合物45(2.733g,5.0mmol)和二氯甲烷(50ml)，随后一次性 加入羰基二咪唑(cdi，892mg,5.5mmol)，混合物在室温下搅拌反应，2小时后tlc(乙 酸乙酯)显示反应完成。混合物用氯仿(100ml)稀释，用水(150ml)、5％柠檬酸(150ml) 和水(150ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-5％甲醇 /二氯甲烷)纯化得白色固体化合物46(2.857g,99.8％)。1hnmr(400mhz,cdcl3): δ11.45(s,1h),7.76(d,j＝8.0hz,1h),7.39
–
7.16(m,9h),6.86(m,4h),5.99(d,j＝1.6hz, 1h),5.64(d,j＝8.0hz,1h),5.59(dd,j＝1.6,7.6hz,1h),5.20(dd,j＝7.6,4.2hz,1h), 4.41(m,1h),3.72(s,6h),3.37(m,1h),3.13(m,1h)；lcms(esi):m/z 595.5(m na)

。
[0157]
化合物i-70的制备
[0158]
在125毫升的圆底烧瓶中加入1,2,4-三氮唑(155mg,2.25mmol)和无水乙腈(3.0ml), 用冰浴冷却至0℃，滴加三氯氧磷(48ul,0.5mmol),加毕，搅拌15分钟；0℃下滴 加三乙胺(310ul,2.25mmol),加毕，反应混合物在0℃下搅拌1小时。向反应混合物 中加入化合物46(143mg,0.25mmol)的乙腈(3ml)溶液,随后室温搅拌过夜至反应完 成。加入ph 7的缓冲溶液(10ml)终止反应，用二氯甲烷(3x30ml)萃取，合并的 有机相用无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，柱层析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得三 氮唑中间体。将该化合物溶解在乙腈(5ml)中，加入50％羟胺水溶液(0.1ml),室温 下搅拌反应20分钟至完成，减压蒸去溶剂后，残留物在零度下加入3％三氯乙酸的二氯 甲烷溶液(5ml)，室温搅拌30分钟至反应完成，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-20％ 甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物i-70(22.8mg,32％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.95 (d,j＝8.0hz,1h),5.83(d,j＝4.8hz,1h),5.62(d,j＝8.0hz,1h),4.38(m,2h),4.28
ꢀ–
4.11(m,3h)；lcms(esi):m/z 286.1(m h)

。
[0159]
实施例20.
[0160][0161]
化合物47的制备
[0162]
100毫升的圆底烧瓶中加入化合物46(1.72g,3mmol)，在零度下加入3％三氯乙酸 的二氯甲烷溶液(30ml)，室温搅拌30分钟至反应完成，减压下蒸去溶剂，残留物经 柱层析(0-10％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物47(738mg,91％)。1h nmr(400mhz, dmso-d6)；δ11.48(brs,1h)；7.77-7.71(d,j＝8.1hz,1h)；6.00-5.95(d,j＝2.2hz,1h)； 5.68-5.63(dd,j＝8.0hz,2.1hz,1h)；5.59-5.52(dd,j＝7.8hz,2.2hz,1h)；5.25-5.20(dd,, j＝7.7hz,3.8hz,1h)；5.18-5.13(t,j＝5.5hz,1h)；4.29-4.24(q,j＝5.5hz,4.1hz,1h)； 3.63-3.58(t,j＝5.5hz,2h)；lcms(esi):m/z 271.1(m h)

。
[0163]
化合物48的制备
[0164]
将化合物47(81mg,0.3mmol)溶解在吡啶(2ml)中,在零度下加入乙酸酐(60ul, 0.6mmol),反应混合物室温搅拌过夜，加入冰淬灭反应，减压下蒸去溶剂，残留物加入 乙酸
乙酯(60ml)中并用5％盐酸(5ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)、盐水(20ml) 洗涤并经无水硫酸镁干燥，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-5％甲醇/二氯甲烷) 纯化得化合物48(89mg,95％)。1hnmr(400mhz,cdc13)9.85(brs,1h),7.28(d,j＝8.1 hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.63(d,j＝1.8hz,1h),5.02-4.82(m,2h),4.42-4.28(m, 3h),2.03(s,3h)；lcms(esi):m/z 313.1(m h)

。
[0165]
化合物i-71的制备
[0166]
在50毫升的圆底烧瓶中加入1,2,4-三氮唑(124mg,1.8mmol)和无水乙腈(2.0ml), 用冰浴冷却至0℃，滴加三氯氧磷(36ul,0.38mmol),加毕，搅拌15分钟；0℃下滴 加三乙胺(240ul,1.72mmol),加毕，反应混合物在0℃下搅拌1小时。向反应混合物 中加入化合物48(62mg,0.2mmol)的乙腈(2ml)溶液,随后室温搅拌过夜至反应完成。 加入ph 7的缓冲溶液(10ml)终止反应，用二氯甲烷(3x30ml)萃取，合并的有机 相用无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，柱层析(30-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化得三氮唑 中间体。将该化合物溶解在乙腈(3ml)中，加入50％羟胺水溶液(60ul),室温下搅拌 反应20分钟至完成，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-10％甲醇/二氯甲烷)纯化 得化合物i-71(23mg,35％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.92(d,j＝8.0hz,1h),5.82 (d,j＝4.8hz,1h),5.63(d,j＝8.0hz,1h),4.38(m,2h),4.26
–
4.10(m,3h),1.21(s,3h)； lcms(esi):m/z 329.1(m h)

。
[0167]
类似的方法合成下列化合物：
[0168][0169]
实施例21.
[0170]
[0171][0172]
化合物49的制备
[0173]
250毫升的圆底烧瓶中加入化合物i-33(2.0g,6.57mmol)和氨甲醇溶液(50ml),反应 混合物在室温下搅拌2小时，减压下蒸去溶剂，加入二氯甲烷，固体过滤并用二氯甲烷 洗涤，干燥得产物49(1.38g,81％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.72(d,j＝7.6hz,1h), 6.07(s,1h),5.69(d,j＝7.6hz,1h),4.47-4.38(m,1h),4.25(d,j＝7.6hz,1h),3.74-3.72 (m,2h)；lcms(esi):m/z 263.1(m h)

。
[0174]
化合物i-75的制备
[0175]
在室温下，将dmtrcl(1.73g,5.1mmol)分三份加入到化合物49(1.08g,4.1mmol) 的吡啶(12ml)溶液中，反应混合物继续搅拌1小时至反应完成。减压蒸去溶剂，残留 物加水和二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥并真空浓缩，残留物经柱层析(0-10％甲 醇/二氯甲烷)纯化得化合物50(2.2g,95％)。向250ml的反应瓶中加入化合物50(2.2g, 3.9mmol)和二氯甲烷(50ml)，随后一次性加入羰基二咪唑(cdi，714mg,4.4mmol)， 混合物在室温下搅拌反应过夜至反应完成。混合物用氯仿(100ml)稀释，用水(100ml)、 5％柠檬酸(100ml)和水(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压下蒸去溶剂，残留物经 柱层析(0-5％甲醇/二氯甲烷)纯化得白色固体化合物51(2.1g,91％)。化合物51(2.1g, 3.55mmol)加入到100ml的反应瓶中,在零度下加入3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(50ml)， 室温搅拌30分钟至反应完成，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-20％甲醇/二氯甲 烷)纯化得化合物i-75(910mg,89％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.72(d,j＝8.0hz, 1h),6.07(s,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.66-5.58(m,2h),4.88-4.41(m,2h)；lcms (esi):m/z 311.2(m na)

。
[0176]
化合物i-76的制备
[0177]
将化合物75(86.5mg,0.3mmol)溶解在吡啶(2ml)中,在零度下加入乙酸酐(60ul, 0.6mmol),反应混合物室温搅拌过夜，加入冰淬灭反应，减压下蒸去溶剂，残留物加入 乙酸乙酯(60ml)中并用5％盐酸(5ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)、盐水(20ml) 洗涤并经无水硫酸镁干燥，减压下蒸去溶剂，残留物经柱层析(0-5％甲醇/二氯甲烷) 纯化得化合物i-76(77.2mg,78％)。1hnmr(400mhz,cd3od)7.67(d,j＝8.0hz,1h), 6.12(s,1h),5.71(d,j＝8.0hz,1h),5.68-5.66(m,2h),4.45(d,j＝3.2hz,1h),4.42(s, 1h),2.11(s,3h)；
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-115.23；lcms(esi):m/z 353.1(m h)

。 类似的方法合成下列化合物：
[0178]
[0179][0180]
实施例22抗β-冠状病毒sars-cov-2活性测定
[0181]
在12孔一次性细胞培养板中,制备融合的细胞培养物单层.将vero e6细胞在维持 在补充有10％fbs的dmem中,并补充1％青霉素/链霉素。vero e6细胞培养物的顶端表 面在用1
×
pbs感染前24小时和1小时洗涤，然后在37℃用1
×
pbs感染1.5小时。使 用表达绿色荧光蛋白(covid-19rfp)的重组covid-19、以0.1pfu/细胞的感染复数感染 vero e6细胞。为了vero e6细胞，除去顶端清洗液，加入病毒接种物，并将接种的培 养物在37℃,5％co 2孵育3小时。除去接种物，vero e6细胞的顶端表面用500μl 1
×
pbs洗涤3次以除去残余病毒。以10um开始制备实施例化合物的3倍系列稀释液， 一式三份，并在感染前大约30分钟将其加入培养物基底外侧的vero e6细胞培养基中。 在48小时温育后通过细胞培养物的荧光成像评估病毒复制。此外，通过在vero细胞单 层上通过空斑测定测量vero e6顶端洗液中感染性病毒的产量以及通过实时pcr测定定 量来自总细胞rna的病毒rna产量来定量病毒复制。
[0182]
化合物抗sars-cov-2活性测试结果
[0183]
[0184][0185]
由以上结果可知，所有化合物显示很高的抑制sars-cov-2的效果，因此，实施例化合 物可以制备用作由sars-cov-2病毒感染所诱发的症状/疾病的治疗药物。
[0186]
实施例23流感聚合酶抑制试验
[0187]
抗病毒和细胞毒性试验。
[0188]
抗病毒检测基于eichelberger等人描述的神经氨酸酶活性检测。简而言之，将 madin-darby犬肾上皮细胞(mdck、atcc)以1
×
105细胞/ml(1
×
104细胞/孔)的密 度接种在测定培养基(dmem补充有0.3％fbs、1％青霉素/链霉素和1％dmso)在96 孔板中。24小时后，将连续稀释的化合物加入细胞中并再培养24小时。细胞用250iu/ 孔流感病毒株a/wsn/33(h1n1)(virapur,san diego ca)感染，并在37℃、5％co2下 孵育20小时。吸出细胞培养上清液并加入50μl 25μm 2'-(4-甲基伞形酮)-α-d-n-乙酰神 经氨酸(sigma-aldrich)溶于33mm mes,ph 6.5(emerald biosystems,bainbridge island, wa)被添加到细胞中。在30℃下孵育45分钟后，通过添加150μl终止溶液(100mm 甘氨酸，ph 10.5，25％乙醇，均为sigma-aldrich)终止反应。在victor x3多标记读板 机(perkinelmer,waltham,ma)上，分别用355和460nm的激发和发射滤光片测量 荧光。未感染的平行培养物的细胞毒性通过添加100μl celltiter-gloreagent(promega, madison,wi)并在室温下孵育10分钟来确定。在victor x3多标记读板机上测量发光。
[0189]
重组甲型流感聚合酶复合物的抑制。
[0190]
如前所述，测定化合物对重组流感聚合酶复合物pa/pb1/pb2的半数抑制浓度ic
50
。总 之，每个10μl反应在37℃下进行40在含有反应缓冲液(25mm tris-cl，ph 7.5， 100mm nacl，5mm mgcl2，0.5mm edta，2mm dtt，5％甘油)、0.15μm聚合酶 复合物、0.4mm 5'-apg引物、1.5μm 50-nt 3'vrna模板、1.6μm 15-nt 5'vrna、0.20 u/μl rnasein、500μm utp、atp和ctp、1μm gtp、2.5μci[α-33
p]gtp和各种化 合物浓度。用含有甲酰胺和50mm edta的淬灭溶液终止反应。样品在95℃下孵育 5分钟。样品在15％变性page凝胶(invitrogen)上以190v运行50分钟。将凝胶暴 露在储能磷屏上并观察通过台风扫描仪(ge医疗保健)。rna产物的量与使用 imagequant软件(ge healthcare)量化的凝胶上条带的强度成正比。以rna产物减少 50％时的化合物浓度表示其活性。
[0191]
化合物抗流感活性测试结果
[0192]
[0193][0194]
由以上结果可知，所有化合物显示很高的抑制流感病毒的效果，因此，实施例化合物可 以制备用作由流感病毒感染所诱发的症状/疾病的治疗药物。