一种采用可溶性的标签为载体制备司美诺肽的方法与流程

1.本发明涉及司美诺肽合成技术领域，具体涉及一种采用可溶性的标签(tag)为载体制备司美诺肽(setmelanotide)的方法。


背景技术：

2.世界卫生组织报告显示，全球肥胖症患者自1975年以来已几乎增加了三倍。我国成人和儿童肥胖率以及因肥胖导致的经济成本上升非常显著。同时，肥胖症也增加了其它并发症的患病风险，如二型糖尿病、心血管疾病等的患病风险。
3.黑素皮质素(melanocortin)，也称促黑激素、促黑色素细胞激素、黑细胞促素等，是一类肽类激素，其中包含促肾上腺皮质激素(acth)和各类黑色素细胞刺激素(msh)。这类激素由前脑啡黑细胞促素皮促素(pomc)在脑下垂体产生，通过结合并激活黑素皮质素受体(melanocortin receptor)(mcr)产生作用。黑素皮质素受体(melanocortin receptor)(mcr)共有5种，且均为g蛋白偶联受体：在大脑中仅表达mc3r与mc4r两种受体，二者配体为α-msh，而刺鼠肽基因相关蛋白(agouti-related peptide)(agrp)是其内源性拮抗剂。
4.黑素皮质素系统在哺乳动物体内与瘦蛋白等竞争，共同调节了摄食活动。目前已知的释放黑素皮质素的神经仅有弓状核，位于下丘脑。弓状核其中有pomc神经细胞和agrp神经细胞等神经元。当pomc神经释放α-msh，食欲减退；而当agrp神经细胞释放agrp(agouti-related peptide)，食欲则增强。瘦蛋白是一种负责调控饱腹感的蛋白，食欲刺激素(ghrelin)则是一种负责刺激食欲的激素，二者共同调节了大脑内黑素皮质素系统的上游通路。这两种激素共同参与黑素皮质素在内的激素调节，而瘦蛋白-黑素皮质素之间在大脑内的平衡如果失去，则会引起早发的肥胖在内的各类新陈代谢类疾病，还将抑制免疫功能。
5.黑皮质素受体4(mc4r)主要在下丘脑中表达，参与控制食物摄取，能量消耗，体重维持等。实验和临床证据也表明，mc4r是肥胖症治疗的重要靶点。司美诺肽是一款寡肽类黑素皮质素-4受体(melanocortin-4 receptor，mc4r)激动剂，作用于人和大鼠黑皮质素4受体；mc4r是机体独立调节能量消耗和食欲的关键生物学通路的一部分。基因变异可能会损害mc4r通路的功能，而这可能会导致极度饥饿(食欲过盛)和早发性严重肥胖。司美诺肽作为一种靶向疗法，恢复受损mc4r通路的功能，重新建立罕见肥胖遗传性疾病患者的能量消耗和食欲控制，减少饥饿感、降低体重。
6.司美诺肽是内源性黑素皮质素肽α-msh(α黑素细胞刺激素)的一种8个氨基酸环肽类似物。司美诺肽醋酸酯的化学名称为乙酰基-l-精氨酰-l-半胱氨酸-d-丙氨酰-l-组氨酸-d-苯丙氨酸基-l-精氨酰-l-色氨酰-l-半胱氨酸酰胺环(2
→
8)-二硫化物醋酸酯。分子式为c49h68n18o9s2(无水游离碱)，分子量为1118.5道尔顿。
7.司美诺肽的化学结构式为：
[0008][0009]
司美诺肽的制备方法已有报道，中国专利cn102686601a报道了应用液相(lpps)片段缩合法制备司美诺肽的方法，该方法提供了含有8个氨基酸环型司美诺肽的制备方法，但由于司美诺肽中不含不易消旋的氨基酸，比如以半胱氨酸(cys)或组氨酸(his)为片段的c末端氨基酸进行活化进行片段间酰胺键的连接可能产生非常严重的消旋副产物而导致产物不纯，增加纯化成本，并且由于此液相合成过程中频繁使用氯甲酸异丁基酯，其形成酰胺键过程条件苛刻，经常需要使用-15℃以下的温度缩合，过程控制困难不便于大规模生产，而且每一个氨基酸缩合后的酸性水溶液洗涤、水洗或碱性水溶液洗涤均会产生大量的含有机废水，后续的处理成本非常高。中国专利cn111718408a提供了一种固相法(spps)制备司美诺肽的方法，该方法采用含有氨基的树脂采用从c末端按照氨基酸顺序逐个向n末端缩合的方法制备司美诺肽，其减少了液相片段制备过程中的消旋问题，但固相合成多肽本身采用的固相载体树脂价格昂贵；每个保护氨基酸及缩合剂在缩合过程中的过量使用引起的成本增加，比如专利中提到的保护氨基酸及缩合剂过量优选为2.5-4倍，较液相合成氨基酸1.0-1.5倍比例成本大大增加；并且缩合及脱除fmoc的溶剂洗涤会产生大量的有机废液，由于成分复杂回收及处理困难，焚烧处理又会增加环境污染；并且专利中的司美诺肽cys
2-cys8位的二硫键环化优选了碘作为氧化剂氧化，这种氧化方式容易使肽序中的色氨酸发生氧化产生环化杂质，并且固相合成过程中没有中间体的纯化步骤从而导致合成过程产生的杂质一直到合成切断完成才进行纯化，其纯化成本会非常高。


技术实现要素：

[0010]
基于以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种采用可溶性的标签(tag)为载体制备司美诺肽(setmelanotide)的方法；该方法保护氨基酸使用量少，试剂使用量少，消旋副产物低，收率高，纯化简单、成本可控、环境友好，可以满足司美诺肽原料的制备。
[0011]
本发明采用一种疏水苯醇(hbas)作为lpps中的可溶性标签，它是一种相对固相载体来讲较小的疏水性小分子，有明确的结构，在芳香环上可以通过改变它们的替代模式进行微调并连接小分子手臂(linker)，形成适合c末端为酰胺的多肽产物。
[0012]
具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0013]
本发明提供一种司美诺肽的制备方法，采用可溶性的hba标签为载体的液相肽合
成法。
[0014]
作为本发明的一个实施方案，所述可溶性的hba标签为fmoc pal amide tag或fmoc-rink amide tag。
[0015]
作为本发明的一个实施方案，所述可溶性的hba标签为：
[0016][0017]
作为本发明的一个实施方案，按司美诺肽的氨基序列依次接入相应的保护氨基酸得到全保护的司美诺肽标签结合物；在连接过程中，每一步的保护氨基酸偶联及脱fmoc保护都是在hba标签上执行。且fmoc保护氨基酸缩合及去除fmoc保护基团是在溶液状态中进行。
[0018]
作为本发明的一个实施方案，所述连接包括如下步骤：
[0019]
s1、以脱fmoc试剂脱除fmoc pal amide tag或fmoc-rink amide tag连接臂上的fmoc，得pal amide tag或rink amide tag；
[0020]
s2、偶联fmoc保护氨基酸、封头：
[0021]
s2-1、加入fmoc-cys(trt)-oh,缩合试剂进行偶联反应；加入适量一级胺或二级胺(包括丙胺、丁胺、戊胺等)使过量的fmoc-cys(trt)-oh的羧基活化端封闭形成fmoc-cys(trt)-ca；
[0022]
或s2-2、加入fmoc-cys(mmt)-oh,缩合试剂进行偶联反应；加入适量一级胺或二级胺使过量的fmoc-cys(mmt)-oh的羧基活化端封闭形成fmoc-cys(mmt)-ca；
[0023]
s3、脱fmoc：
[0024]
s3-1、加入脱fmoc试剂脱除步骤s2-1得到的fmoc-cys(trt)-rink amide tag上的fmoc及fmoc-cys(trt)-ca上的fmoc，得到h-cys(trt)-rink amide tag；
[0025]
或加入脱fmoc试剂脱除步骤s2-1得到的fmoc-cys(trt)pal amide tag上的fmoc及fmoc-cys(trt)-ca上的fmoc，得到h-cys(trt)pal amide tag；
[0026]
或加入脱fmoc试剂脱除步骤s2-2得到的fmoc-cys(mmt)-rink amide tag上的fmoc及fmoc-cys(mmt)-ca上的fmoc，得到h-cys(mmt)-rink amide tag；
[0027]
或加入脱fmoc试剂脱除步骤s2-2得到的fmoc-cys(mmt)-pal amide-tag上的fmoc及fmoc-cys(mmt)-ca上的fmoc，得到h-cys(mmt)-pal amide tag；
[0028]
s4、按司美诺肽的氨基序列顺序，根据步骤s2、s3的方法再进行下一个偶联fmoc保护氨基酸、封头、脱fmoc直至司美诺肽序列缩合完毕，得到全保护的司美诺肽标签结合物。
[0029]
作为本发明的一个实施方案，所述全保护的司美诺肽标签结合物包括：
[0030]
ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-rink amide tag，
[0031]
ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-rink amide tag，
[0032]
ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)pal amide tag，
[0033]
ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)pal amide tag。
[0034]
作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，将fmoc-rink amide tag或fmoc pal amide tag溶解在第一溶剂中，以脱fmoc试剂脱除连接臂上的fmoc，以第二溶剂沉淀rink amide tag或pal amide tag并与助滤剂混合，第二溶剂洗涤去除脱fmoc试剂、fmoc烯后加入第一溶剂溶解rink amide tag或pal amide tag。
[0035]
作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，脱除fmoc后，加入第二溶剂沉淀，添加助滤剂并过滤及以第二溶剂洗涤去除脱fmoc试剂、fmoc烯、h-cys(trt)-ca及过量的缩合试剂，得到纯净的h-cys(trt)-rink amide tag、h-cys(trt)pal amide tag、h-cys(mmt)-rink amide tag或h-cys(mmt)-pal amide tag。
[0036]
作为本发明的一个实施方案，步骤s4中，缩合完毕后采用乙酸酐或乙酰咪唑对n末端氨基酸的α-氨基进行封头，待封头反应完全后向反应混合液中加入第二溶剂析出沉淀，过滤后得到全保护的司美诺肽标签结合物。
[0037]
作为本发明的一个实施方案，第一溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、甲苯或其混合物；第二溶剂选自乙腈或甲醇；助滤剂选自硅藻土、珍珠岩、活性炭或石墨粉。
[0038]
作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括如下步骤：
[0039]
对于含cys(trt)的全保护的司美诺肽标签结合物，采用浓酸切断去除所述司美诺肽标签结合物的侧链保护基团、tag及pal amide或rink amide连接臂得到司美诺肽粗肽，以氧化剂氧化形成分子内的二硫键，经纯化得到司美诺肽；
[0040]
对于含cys(mmt)的全保护的司美诺肽标签结合物，先脱除所述司美诺肽标签结合物cys上的保护基团，以氧化剂形成分子内的二硫键，再经过浓酸切断去除其它氨基酸侧链保护基团及tag得到司美诺肽粗肽，经纯化得到司美诺肽。
[0041]
司美诺肽是一种8个氨基酸环肽类似物，属于氨基酸数量少的小肽类，从理论上来讲传统的液相肽合成(lpps)比固相肽合成(spps)有优势，因为其所需氨基酸的量、耦合剂和溶剂量均可以达到最小化，然而液相肽合成的整个过程明显更耗时，主要时缺乏有效的分离技术，很难从反应混合物中特异性的提取延长的多肽，所以液相肽合成法中的每个中间体产生步骤都需要进行结晶或色谱纯化。本发明提供了采用可溶性“标签”的液相肽合成(lpps)方法合成司美诺肽(setmelanotide)，从而解决了液相肽合成法目标产物从混合物中分离困难的问题，同时使使用的氨基酸的量、耦合剂和溶剂量均可以达到最小化，克服了
液相肽合成(lpps)和固相肽合成(spps)的固有问题，提供了一种绿色、可持续放大的化学法合成司美诺肽(setmelanotide)的方法。
[0042]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0043]
1.本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽(setmelanotide)的制备，fmoc保护氨基酸缩合及去除fmoc保护基团是在溶液状态中进行，所以需要的fmoc保护氨基酸及缩合剂过量倍数较固相多肽合成(spps)的2.5-4.0倍降低至1.0-1.5倍，节约了大量的原物料成本。并且采用乙腈或甲醇析出沉淀可溶性标签类似物，其沉淀及洗涤成本较固相多肽合成使用的dmf、nmp要低很多，对环境更为友好。
[0044]
2.本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽(setmelanotide)的制备，其可以定量的检测缩合完成度，较固相多肽合成(spps)经常遇到的消旋杂质、缩合不完全的封头杂质或断头杂质，本发明得到的沉淀产物更为单一，可以通过tlc或hplc定量检测，不存在缩合不完全状态，所以最终得到的产物纯度较固相合成多肽要高。
[0045]
3.固相多肽合成(spps)脱除fmoc时常常使用的哌啶及其类似物，哌啶不但对人体危害大，而且作为易制毒化学品在购买及使用上有诸多限制。本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽(setmelanotide)的制备，可以采用有机胺、无机碱类在溶液中脱除fmoc保护基团，脱除反应可以通过tcl或hplc检测，不但成本较低而且操作简单易于定量检测。
[0046]
4.本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽(setmelanotide)的制备，每缩合及脱除fmoc后以乙腈或甲醇析出肽标签复合物，较液相多肽合成的每步纯化即缩合后结晶纯化、脱除fmoc后仍需纯化所需的步骤更少，使用的溶剂及析出条件更为简单、易行。同时本发明在可溶性肽标签析出后加入助滤剂硅藻土、珍珠岩、活性炭或石墨粉等固化肽标签复合物，使得沉淀析出后的过滤更为易行，而液相合成多肽往往会出现结晶条件不好、析晶不完全的的现象从而导致低的产物收率及过滤操作困难。
[0047]
5.本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽(setmelanotide)的制备，每步缩合后处理过程不像液相合成多肽时需要碱水洗、水洗及酸水洗以去除缩合试剂，产生大量含有机废水，后续的处理成本很高。本发明采用乙腈或甲醇析出肽标签复合物，产生的少量废甲醇或乙腈回收容易，对环境的污染少。
[0048]
6.本发明在合成司美诺肽(setmelanotide)过程中，对于cys2和cys8保护基采取不同的保护策略，第1种策略是采取cys(trt)2和cys(trt)8的策略，在合成完毕后以浓酸将其与其它氨基酸侧链保护基及标签复合物一起去除，再氧化形成cys2和cys8二硫键。第2种策略是采取cys(mmt)2和cys(mmt)8的策略，在合成完毕后以稀酸先脱去mmt，在复合物上先形成氧化形成二硫键，再以浓酸脱除其它氨基酸侧链保护基及标签复合物，hplc纯化后得到最终司美诺肽。第1种策略是常规的合成及环化策略，未将cys上的保护基单独脱除；第2种策略先将cys上的保护基单独去除，形成二硫键环后再脱除其它氨基酸保护基。策略2的好处是避免环化反应氧化剂对色氨酸(trp)吲哚环的氧化副产物，得到的产物纯化收率更高。
tag，再进行下一个偶联fmoc保护氨基酸、封头、脱fmoc、沉淀步骤直至所需的司美诺肽(setmelanotide)序列缩合完毕。然后向全保护的司美诺肽(setmelanotide)tag中加入稀酸脱除cys(mmt)2和cys(mmt)8，以氧化剂氧化形成分子内的二硫键，再以浓酸脱除可溶性tag、rink amide连接臂及序列上其它氨基酸的侧链保护基团，以醚沉淀得到司美诺肽(setmelanotide)粗肽，经纯化步骤形成最终的司美诺肽(setmelanotide)产品。
[0062]
在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见下表。
[0063]
[0064][0065]
实施例1
[0066]
rink amide tag1的制备
[0067]
称取14.35g的fmoc-rink amide tag1(10mmol)溶解在200ml的25％的二乙胺/四氢呋喃中。全溶后搅拌保温(25-30℃)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入600ml乙腈(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入硅藻土(15g)并充分混合。硅藻土与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯及二乙胺检测物，然后用thf(60ml)洗涤成浆。过滤去除硅藻土后，滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到rink amide tag的四氢呋喃溶液。
[0068]
实施例2
[0069]
h-cys(trt)-rink amide tag1的制备
[0070]
将7.03g的fmoc-cys(trt)-oh(12mmol)、6.24g的pybop(12mmol)和1.62g的hobt(12mmol)以80ml的thf溶解，待全溶后与约100ml的rink amide tag1的四氢呋喃溶液混合,并向混合溶液中滴加入4.85ml的tmp(40mmol)。滴加完毕后混合液在保温(25-30℃)搅拌反应，通过tlc或hplc检测直至反应完成。再在混合液中加入0.18ml的丙胺消耗过量的fmoc-cys(trt)-obt使其成为惰性的fmoc-cys(trt)-oca，反应完全后。搅拌状态下溶液中加入二乙胺直至其浓度为25％(v/v)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入600ml乙腈(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入硅藻土(15g)并充分混合。硅藻土与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯、h-cys(trt)-oca、活化剂及二乙胺等检测物，然后用thf(60ml)洗涤硅藻土与沉淀物并成浆状物。过滤去除硅藻土，硅藻土滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到h-cys(trt)-rink amide tag1的四氢呋喃溶液。
[0071]
实施例3
[0072]
ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-rink amide tag1的制备
[0073]
按照司美诺肽从c端到n端的氨基酸顺序，fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-(d)-phe-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-(d)-ala-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf-oh)，重复实施例2，最后采用乙酸酐或乙酰咪唑对n末端氨基酸的α-氨基进行封头，待封头反应完全后向反应混合液中加入600ml乙腈(3eq)析出沉淀，过滤后得到34.32g的全保护的ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-rink amide tag1，收率：94.08％。
[0074]
实施例4
[0075]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的制备
[0076]
称取34.32g ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-rink amide tag 1肽标签复合物，加入300ml tfa:phenol:h2o:thioaniso le:edt(82.5:5:5:5:2.5)混合液，室温搅拌反应2.5小时，减压浓缩至体积100ml，然后保温(2-8℃)搅拌下向浓缩液中加入300ml的mtbe，有大量白色沉淀析出，过滤滤饼以mtbe洗涤后干燥得10.2g粗肽，收率：91.9％，通过hplc分析其纯度为94.7％。
[0077]
实施例5
[0078]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的二硫键环化
[0079]
称取10.2g的ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2置入20l反应釜内，搅拌下加入10l的纯水溶解后调ph 6.2-6.5，然后加入500ml的dmso进行分子内二硫键的氧化，通过ellman测定巯基残余情况，环化72小时完成。减压浓缩至体积约1l，冷冻干燥得到胶状物，以5％醋酸水溶液溶解后通过sephadex g15，主峰收集液hplc检测纯度为93.4％.
[0080]
实施例6
[0081]
rink amide tag2的制备
[0082]
称取11.67g的fmoc-rink amide tag2(10mmol)溶解在100ml的1％(v/v)dbu和2％哌啶的1：1(v/v)thf/dcm中。全溶后搅拌保温(25-30℃)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入300ml乙腈(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入珍珠岩(15g)并充分混合。珍珠岩与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯及二乙胺检测物，然后用thf(50ml)洗涤成浆。过滤去除珍珠岩后，滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到rink amide tag的四氢呋喃溶液。
[0083]
实施例7
[0084]
h-cys(mmt)-rink amide tag2的制备
[0085]
将7.39g的fmoc-cys(mmt)-oh(12mmol)、4.55g的hbtu(12mmol)和1.62g的hobt(12mmol)以80ml的nmp溶解，待全溶后与约80ml的rink amide tag2的thf溶液混合,并向混合溶液中滴加入4.85ml的tmp(40mmol)。滴加完毕后混合液在保温(25-30℃)搅拌反应，通过tlc或hplc检测直至反应完成。再在混合液中加入0.22ml的丁胺消耗过量的fmoc-cys(mmt)-obt使其成为惰性的fmoc-cys(mmt)-oca，反应完全后。搅拌状态下溶液中加入二乙胺直至其浓度为25％(v/v)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入600ml乙腈(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入珍珠岩(15g)并充
分混合。珍珠岩与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯、h-cys(mmt)-oca、活化剂及二乙胺等检测物，然后用thf(60ml)洗涤珍珠岩与沉淀物并成浆状物。过滤去除珍珠岩，珍珠岩滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到h-cys(mmt)-rink amide tag2的四氢呋喃溶液。
[0086]
实施例8
[0087]
ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-rink amide tag2的制备
[0088]
按照司美诺肽从c端到n端的氨基酸顺序，fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-(d)-phe-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-(d)-ala-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh，重复实施例2，最后采用乙酸酐或乙酰咪唑对n末端氨基酸的α-氨基进行封头，待封头反应完全后向反应混合液中加入600ml乙腈析出沉淀，过滤后得到全保护的31.15g的ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-rink amide tag2，收率：90.53％
[0089]
实施例9
[0090]
ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-rink amide tag2(cys
2-cys8二硫键环)的制备
[0091]
称取31.15g的ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-rink amide tag2，加入300ml的1％tfa/dcm:thf(1:1),保温(25-30℃)搅拌反应1hr，通过tlc或hplc检测脱除mmt完全，将反应液置于冰浴条件下加入1.2ml的diea中和tfa，搅拌30min后加入900ml的乙腈析出肽标签复合物，过滤，以3*50ml乙腈洗涤滤饼。将滤饼置入茄型瓶内加入150mldmf/dcm(1:1)含2.67g的ncs(20mmol)溶液，室温搅拌反应，通过hplc测定环化反应完全，向反应混合液中加入500ml乙腈析出沉淀，过滤洗涤后得到全保护的28.70g ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-rink amide tag 2(cys
2-cys8二硫键环)，收率：99.1％
[0092]
实施例10
[0093]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2(cys
2-cys8二硫键环)的制备
[0094]
称取28.70g ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-rink amide tag 2(cys
2-cys8二硫键环)的肽标签复合物，加入200ml tfa:tis:phenol:h2o(90:5:4:1)混合液，室温搅拌反应2.5小时，减压浓缩至体积100ml，然后保温(2-8℃)搅拌下向浓缩液中加入300ml的mtbe，有大量白色沉淀析出，过滤滤饼以mtbe洗涤后干燥得10.5g粗肽，收率：94.6％，通过hplc分析其纯度为93.8％。
[0095]
实施例11
[0096]
pal amide tag3的制备
[0097]
称取10.98g的fmoc-pal amide-tag3(8mmol)溶解于1％(v/v)dbu和2％哌啶的1：1(v/v)thf/dcm(100ml)中。全溶后搅拌反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入300ml甲醇(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入活性炭(15g)并充分混合。活性炭与沉淀物经过滤、甲醇洗涤至洗液中无fmoc烯及二乙胺检测物，真空干燥去除残余的甲醇。得到的活性炭与沉淀物固体研碎后用thf/dcm(100ml)浸泡成浆。室温搅拌1-2小时后过滤去除活性炭，活性炭滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及
洗液得到pal amide tag3的四氢呋喃溶液，真空浓缩至体积约为80ml待用。
[0098]
实施例12
[0099]
h-cys(trt)pal amide tag3的制备
[0100]
将5.86g的fmoc-cys(trt)-oh(10mmol)、1.26ml的dic(10mmol)和1.35g的hobt(10mmol)溶解于1:1甲苯/dcm(40ml),待全溶后于约80ml的pal amide tag四氢呋喃溶液混合,混合液保温(25-30℃)搅拌反应，通过tlc或hplc检测直至反应完成。再在混合液中加入0.22ml的丁胺消耗过量的fmoc-cys(trt)-obt使其成为惰性的fmoc-cys(trt)-oca，反应完全后。搅拌状态下溶液中加入二乙胺直至其浓度为25％(v/v)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入360ml乙腈(3eq)析出沉淀，再向沉淀中加入活性炭(15g)并充分混合。活性炭与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯、h-cys(trt)-oca、活化剂及二乙胺等检测物，然后用thf(100ml)洗涤活性炭与沉淀物并成浆状物。过滤去除活性炭，活性炭滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到h-cys(trt)pal amide tag3的四氢呋喃溶液。
[0101]
实施例13
[0102]
ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)pal amide tag3的制备
[0103]
按照司美诺肽从c端到n端的氨基酸顺序，fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-(d)-phe-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-(d)-ala-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh，重复实施例5，最后采用乙酸酐或乙酰咪唑对n末端氨基酸的α-氨基进行封头，待封头反应完全后向反应混合液中加入600ml乙腈析出沉淀，过滤后得到27.43g得全保护ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-pal amide tag3.收率：95.61％。
[0104]
实施例14
[0105]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的制备
[0106]
称取27.43g ac-arg(pbf)-cys(trt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(trt)-pal amide tag 3肽标签复合物，加入250ml tfa:dtt:h2o:tis(88:5:5:2)混合液，室温搅拌反应3.0小时，减压浓缩至体积100ml，然后保温(2-8℃)搅拌下向浓缩液中加入300ml的mtbe，有大量白色沉淀析出，过滤滤饼以mtbe洗涤后干燥得8.21g粗肽，收率：91.8％，通过hplc分析其纯度为94.4％。
[0107]
实施例15
[0108]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的二硫键环化
[0109]
称取8.21g的ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2置入20l反应釜内，搅拌下加入8l的纯水溶解后调ph 6.2-6.5，然后加入400ml的dmso进行分子内二硫键的氧化，通过ellman测定巯基残余情况，环化96小时完成。减压浓缩至体积约800ml，通过sephadex g15进行去盐及粗纯，主峰收集液hplc检测纯度为94.9％.
[0110]
实施例16
[0111]
pal amide tag4的制备
[0112]
称取11.05g的fmoc-pal amide-tag4(10mmol)溶解在120ml的25％的二乙胺/四氢呋喃中。全溶后搅拌反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后
向反应混合液中加入360ml甲醇析出沉淀，再向沉淀中加入石墨粉(20g)并充分混合。石墨粉与沉淀物经过滤、甲醇洗涤至洗液中无fmoc烯及二乙胺检测物，真空干燥去除残余的甲醇。得到的石墨粉与沉淀物固体研碎后用thf/dcm(100ml)浸泡成浆。室温搅拌1-2小时后过滤去除石墨粉，石墨粉滤饼以3*10ml四氢呋喃洗涤，合并滤液及洗液得到pal amide tag3的四氢呋喃溶液，真空浓缩至体积约为80ml待用。
[0113]
实施例17
[0114]
h-cys(mmt)pal amide tag4的制备
[0115]
将7.39g的fmoc-cys(mmt)-oh(12mmol)、1.51ml的dic(12mmol)和1.61g的hoa t(12mmol)溶解于1:1dmf/dcm(60ml),待全溶后与约130ml的pal amide tag的四氢呋喃溶液混合,混合液保温(25-30℃)搅拌反应，通过tlc或hplc检测直至反应完成。再在混合液中加入0.25ml的戊胺消耗过量的fmoc-cys(mmt)-obt使其成为惰性的fmoc-cys(mmt)-oca，反应完全后。搅拌状态下溶液中加入二乙胺直至其浓度为25％(v/v)反应脱除fmoc保护基团，通过tlc检测fmoc的脱除情况，待脱除完全后向反应混合液中加入600ml乙腈析出沉淀，再向沉淀中加入石墨粉(20g)并充分混合。石墨粉与沉淀物经过滤、乙腈洗涤至洗液中无fmoc烯、h-cys(mmt)-oca、活化剂及二乙胺等检测物，然后加入100ml的thf/dcm(1:1)洗涤石墨粉与沉淀物并成浆状物。过滤去除石墨粉，石墨粉滤饼以3*10mlthf/dcm(1:1)洗涤，合并滤液及洗液得到h-cys(mmt)pal amide tag4的四氢呋喃溶液。
[0116]
实施例18
[0117]
ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)pal amide tag4的制备
[0118]
按照司美诺肽从c端到n端的氨基酸顺序，fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-(d)-phe-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-(d)-ala-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh，重复实施例5，最后采用乙酸酐或乙酰咪唑对n末端氨基酸的α-氨基进行封头，待封头反应完全后向反应混合液中加入600ml乙腈析出沉淀，过滤后得到32.11g得全保护ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-pal amide tag4.收率：95.08％。
[0119]
实施例19
[0120]
ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-pal amide tag4(cys
2-cys8二硫键环)的制备
[0121]
称取32.11g的ac-arg(pbf)-cys(mmt)-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys(mmt)-pal amide tag2，加入300ml的1％tfa/dcm:thf(1:1),保温(25-30℃)搅拌反应1hr，通过tlc或hplc检测脱除mmt完全，将反应液置于冰浴条件下加入1.2ml的diea中和tfa，搅拌30min后加入900ml的乙腈析出肽标签复合物，过滤，以3*50ml乙腈洗涤滤饼。将滤饼置入茄型瓶内加入150mlnmp/dcm(1:1)含2.67g的ncs(20mmol)溶液，室温搅拌反应，通过hplc测定环化反应完全，向反应混合液中加入500ml乙腈析出沉淀，过滤洗涤后得到全保护的27.95g ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-pal amide tag 4(cys
2-cys8二硫键环)，收率：98.67％。
[0122]
实施例20
[0123]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2(cys
2-cys8二硫键环)的制备
[0124]
称取27.95g ac-arg(pbf)-cys-(d)ala-his(trt)-(d)phe-arg(pbf)-trp(boc)-cys-pal amide tag 4(cys
2-cys8二硫键环)的肽标签复合物，加入200ml tfa:phenol:h2o:tis(88:5:5:2)混合液，室温搅拌反应3.0小时，减压浓缩至体积100ml，然后保温(2-8℃)搅拌下向浓缩液中加入300ml的mtbe，有大量白色沉淀析出，过滤滤饼以mtbe洗涤后干燥得10.1g粗肽，收率：90.4％，通过hplc分析其纯度为95.1％。
[0125]
实施例21
[0126]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的纯化
[0127]
取实施例5及实施例15的肽溶液，以0.45um的滤芯过滤，滤液采用制备反相高效液相色谱仪(rp-hplc)进行纯化，制备柱选用c18(50x 250mm，8μm)，洗脱溶剂：0.05％甲酸溶于水(溶剂a)，0.05％甲酸溶于乙腈(溶剂b)，采用梯度洗脱：5％-50％b，20min；50％-95％b，10min，95％-5％b，10min。流速50ml/min，紫外280nm进行检测，分段收集主峰并测定后进行合并，以5％的氨水调ph6.5后加入醋酸调ph至4.0完成转盐。溶液经sephadex g15去盐后冷冻干燥。其中实施例5得到7.3g白色冻干粉，纯度为99.5％，最大单杂为0.09％，总收率：65.4％，通过质谱(ms)测定分子量为1118.0，与理论分子量(mw:1118.50)一致。实施例15得到5.9g白色冻干粉，纯度为99.6％，最大单杂为0.08％，总收率66.0％，通过质谱(ms)测定分子量为1117.9，与理论分子量(mw:1118.50)一致。
[0128]
实施例22
[0129]
ac-arg-cys-(d)ala-his-(d)phe-arg-trp-cys-nh2的纯化
[0130]
取实施例10及实施例20的粗肽固体，以纯水溶解后用5％的氨水调ph6.5后加入醋酸调ph至4.0完成转盐。然后0.45um的滤芯过滤，滤液采用制备反相高效液相色谱仪(rp-hplc)进行纯化，制备柱选用c8(50x 250mm，8μm)，洗脱溶剂：0.5％醋酸溶于水(溶剂a)，0.5％醋酸溶于乙腈(溶剂b)，采用梯度洗脱：5％-55％b，25min；55％-95％b，10min，95％-5％b，10min。流速40ml/min，紫外280nm进行检测，分段收集主峰并测定后进行合并后冷冻干燥。其中实施例10得到8.1g白色冻干粉，纯度为99.3％，最大单杂为0.10％，总收率：72.5％；通过质谱(ms)测定分子量为1117.8，与理论分子量(mw:1118.50)一致。实施例20得到7.9g白色冻干粉，纯度为99.4％，最大单杂为0.09％，总收率70.7％。通过质谱(ms)测定分子量为1117.9，与理论分子量(mw:1118.50)一致。
[0131]
上述实施例表明，本发明提供的制备司美诺肽(setmelanotide)方法所得产品纯度大于99.0％，产品总收率大于65％，可以满足司美诺肽原料的制造，并具有广泛的实用价值及应用前景。
[0132]
综上，本发明采用可溶性的hba标签为载体的液相肽合成法，按司美诺肽的氨基序列依次接入相应的保护氨基酸得到全保护的司美诺肽标签结合物；在连接过程中，每一步的保护氨基酸偶联及脱fmoc保护都是在hba标签上执行。本发明采用了可溶性的fmoc pal amide tag及fmoc-rink amide tag进行司美诺肽的制备，fmoc保护氨基酸缩合及去除fmoc保护基团是在溶液状态中进行，所以需要的fmoc保护氨基酸及缩合剂过量倍数较固相多肽合成(spps)的2.5-4.0倍降低至1.0-1.5倍；并且采用乙腈或甲醇析出沉淀可溶性标签类似物，其沉淀及洗涤成本较固相多肽合成使用的dmf、nmp要低很多，对环境更为友好。
[0133]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影
响本发明的实质内容。