一种直立石墨烯材料及其制备方法和在外泌体捕获中的应用与流程

1.本发明涉及直立石墨烯材料技术领域，尤其涉及一种直立石墨烯材料及其制备方法和在外泌体捕获中的应用。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡，最早由pan和johnstone在绵羊网织红细胞中发现并命名。随着研究的深入，人们发现包括血细胞、免疫细胞、癌细胞、干细胞等在内的几乎所有细胞都可以产生外泌体，所产生的外泌体不仅存在于细胞培养液中，也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔积液等体液中。外泌体包含大量跨膜蛋白质和胞内蛋白质，虽然不同细胞来源的外泌体的大部分蛋白质组成相近，但是也有少量蛋白质具有细胞特异性，能够反映分泌细胞的类型和病理生理条件。因此通过对外泌体进行蛋白质组学分析，可以获得有关来源细胞生理状态的重要信息。如何高效、高纯度地富集外泌体是实现其组学分析和功能研究的关键。然而外泌体体积小，密度低，加之在粒径与组成方面存在异质性，即使同种细胞产生的外泌体也有可能形态各异，给外泌体的提取带来巨大困难。如今已发展了多种基于外泌体尺寸、密度及免疫表型的提取方法，包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法等。现有的外泌体提取方法存在耗时长、费用高、不易操作、提取效率不高等不足。为了弥补现有方法的不足，本发明提供了一种直立石墨烯材料及其制备方法和在捕获外泌体中的应用。该直立石墨烯材料具有三维立体纳米森林结构(如图1)，该结构使其表面积相对于平面结构增加了数百倍，这大大增加了对外泌体的捕获率。且外泌体提取更加快速、简单、高效，成本相较于传统方法更低廉。


技术实现要素：

3.本发明提供一种直立石墨烯材料及其制备方法和在捕获外泌体中的应用。本发明中的直立石墨烯材料的表面积相对于平面结构增加了数百倍，大大增加了本材料对外泌体的捕获率。本发明中的直立石墨烯层数为3及以下层，为少层石墨烯，具有纯度高、耐化学性能优异、微观力学性能好、不易脱落等特点，其石墨烯花瓣尺寸可以控制在几十纳米到几百纳米之间，与外泌体基团的尺寸相接近，更易于捕获外泌体。
4.本发明的技术方案具体如下：
5.首先，本发明提供了一种直立石墨烯材料的制备方法，包括以下步骤：
6.清洗并干燥基材；
7.通过等离子体增强化学气相沉积，将碳原子沉积在基材上，形成直立石墨烯层，包括：
8.抽真空，使pecvd设备中真空度达到要求，
9.对基材进行加热保温处理，
10.通入一定量碳源气体和缓冲气体，腔体内保压，
11.开启pecvd设备进行等离子体增强化学气相沉积，生长形成直立石墨烯层，
12.停止加热，冷却至一定温度后取出；
13.通过物理气相沉积在得到的直立石墨烯层表面形成纳米粒子层，最终得到直立石墨烯材料；或通过化学修饰在得到的直立石墨烯层上形成化学基团，最终得到直立石墨烯材料。
14.进一步地，所述基材为石墨纸、碳纸、陶瓷、硅片、石英片、金属薄膜中的一种或多种。
15.进一步地，所述加热保温处理依次包括：在200-300℃保温10-20min；在700-800℃保温10-20min；在850-1200℃保温30-60min。
16.进一步地，所述碳源气体包括：甲烷、乙炔、丙烯中的一种或多种；所述缓冲气体包括：氢气、氮气、氩气中的一种或多种；所述碳源气体的通入量为10-25sccm，所述缓冲气体的通入量为5-10sccm，腔体内气压保持在3-25pa。
17.进一步地，所述pecvd设备的功率设定为650-1400w，直立石墨烯层的生长时间为8-40min，冷却至150-200℃后取出。
18.进一步地，所述物理气相沉积为启动pvd设备，在所述直立石墨烯层材料表面溅射形成纳米粒子层，包括：
19.将获得的直立石墨烯层放入pvd设备中，抽真空，
20.通入一定量惰性气体，并进行保压，
21.其中，所述惰性气体为he、ne、ar中的一种或多种，所述惰性气体的流量为5-10sccm，设备内气压保持在0.5-3pa。
22.进一步地，所述纳米粒子层中的纳米粒子为au、ag、pt、zr、cu、al、zro2、cuo、al2o3中的一种或多种，，所述pvd设备的功率为50-500w，溅射时间为5-300s。
23.进一步地，所述化学基团包括：羟基、羧基、硝基、甲基中的一种或多种。
24.其次，本发明还提供一种利用以上制备方法制得的直立石墨烯材料，其包括依次结合在一起的：基材层、直立石墨烯层、纳米粒子层和/或化学基团，所述直立石墨烯层为直立型少层石墨烯，其由3层及以下石墨烯层组成，所述直立石墨烯层的石墨烯花瓣的尺寸为200-1000nm，比表面积为1000-1200
㎡
/g；纳米粒子均匀分布于所述直立石墨烯层表面上，所述纳米粒子层的纳米粒子的粒径为20-50nm。
25.另外，本发明还要求保护以上所述的直立石墨烯材料在外泌体捕获中的应用。
26.采用上述方案，本发明提供一种直立石墨烯材料及其制备方法和在捕获外泌体中的应用，其具有以下有益效果：
27.(1)本发明的直立石墨烯材料是石墨烯花瓣与外泌体基团的尺寸相接近，易于捕获外泌体，材料还包括物理修饰后的纳米粒子层和/或化学修饰后的化学基团，使其在常温下即可与外泌体的基团充分、快速、牢固地结合，从而实现快速、简单、高效地提取外泌体。
28.(2)本发明的直立石墨烯材料的制备方法的工艺条件温和，易于操作，生产成本低，通过本制备方法制得的直立石墨烯层呈三维立体纳米森林结构，其表面积相对于平面结构增加了数百倍，从而大大增强了本材料对外泌体的捕获率，另外还具有纯度高、耐化学性能优异、微观力学性能好、不易脱落等特点。
29.(3)本发明的直立石墨烯材料应用于外泌体捕获中，开创了一新型的外泌体捕获手段，应用该直立石墨烯材料用于外泌体捕获耗时短、费用低、易操作、提取效率高。
附图说明
30.图1为本发明的直立石墨烯材料的sem正面照片(表面溅射au)。
31.图2为本发明的直立石墨烯材料的sem截面照片(表面溅射au)。
32.图3为本发明的直立石墨烯材料的sem正面照片(表面溅射zr)。
33.图4为本发明的直立石墨烯材料捕获外泌体的正面照片。
具体实施方式
34.以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
35.本发明的直立石墨烯材料，包括依次结合在一起的：基材层、直立石墨烯层、纳米粒子层。其中所述基材层可以为石墨纸、碳纸、陶瓷、硅片、石英片、金属薄膜中的一种或多种，选取利于直立石墨烯层生长的基材即可。所述直立石墨烯层为直立型少层石墨烯，其由1-3层石墨烯层所组成，具有纯度高、耐化学性能优异、微观力学性能好、不易脱落等特点，其石墨烯花瓣尺寸控制在200-1000nm，在实际操作中，可根据要捕获的为谜题基团的尺寸控制石墨烯花瓣的尺寸，以使石墨烯花瓣的尺寸与外泌体基团的尺寸相接近，更易于捕获外泌体，提高捕获效率。所述直立石墨烯层的厚度为1-2μm，其表面呈三维立体纳米森林结构(如图1-4所示)，本实施例中其比表面积为1000-1200
㎡
/g，相比平面结构的表面积增加了数百倍，因此大大增加了直立石墨烯材料对外泌体的捕获率。另外在所述直立石墨烯层上通过溅射纳米粒子进行物理修饰后，纳米粒子均匀分布于所述直立石墨烯层表面上，修饰后的直立石墨烯材料可以在常温下与外泌体的基团充分、快速、牢固地结合，提高了外泌体捕获的速度。优选的，所述纳米粒子层中的纳米粒子可以为金属或金属氧化物，优选为au、ag、pt、zr、cu、al、zro2、cuo、al2o3等中的一种或多种，所述纳米粒子层30的纳米粒子太小不能捕获外泌体，太大则会降低捕获的效率，因此纳米粒子的粒径优选为20-50nm。图1和图2中表面溅射的纳米粒子为au，图3中表面溅射的纳米粒子为zr。
36.本发明还提供一种以上所述的直立石墨烯材料的制作方法，其包括以下步骤：
37.s10、清洗并干燥基材；
38.提供一基材，如石墨纸、碳纸、陶瓷、硅片、石英片、金属薄膜中的一种或多种，置于超声波中进行清洗10-20min，清洗液可以选用酒精、丙酮、盐酸、硫酸、氢氧化钠溶液、去离子水中的一种或多种，也可采用其他可以使用的清洗液。
39.s20、通过等离子体增强化学气相沉积，将碳原子沉积在基材上，形成直立石墨烯层，该步骤包括：
40.s201、将清洗并干燥后的基材放入pecvd设备的真空腔中，对腔体抽真空，至气压达到10-3
到10-2
pa。
41.s202、对基材进行加热保温处理，该加热保温处理包括：在200-300℃保温10-20min；在700℃-800℃保温10-20min；在850℃-1200℃保温30-60min。分段加热保温使得基材受热更均匀，有利于直立石墨烯的均匀生长，提高了直立石墨烯层的品质。
42.s203、通入碳源气体和缓冲气体，其中所述碳源气体包括：甲烷、乙炔、丙烯中的一种或多种，所述缓冲气体包括：氢气、氮气、氩气中的一种或多种，所述碳源气体的通入量为10-25sccm，所述缓冲气体的通入量为5-10sccm使腔体内气压保持在3-25pa。
43.s204、开启pecvd设备进行等离子体增强化学气相沉积，生长形成直立石墨烯层，
其中所述pecvd设备的功率设定为650-1400w，直立石墨烯层的生长时间为8-40min，形成三层及以下的少层直立石墨烯层，其厚度为1-2μm，比表面积为1000-1200
㎡
/g，石墨烯花瓣的尺寸在200-1000nm间。
44.s205、停止加热，冷却至150-200℃后取出。
45.s30、通过物理气相沉积在得到的直立石墨烯层表面形成纳米粒子层，最终得到直立石墨烯材料，该步骤具体包括：
46.s301、将获得的直立石墨烯层放入pvd设备中，抽真空至气压达到10-5-10-4
pa。
47.s302、通入惰性气体，所述惰性气体为he、ne、ar中的一种或多种，所述惰性气体的流量为5-10sccm，使设备内的气压保持在0.5-3pa。
48.s303、启动pvd设备，将靶材的粒子溅射到所述直立石墨烯层表面，形成直立石墨烯材料，所述靶材优选为金属靶材或金属氧化物靶材，优选的，所述靶材为au、ag、pt、zr、cu、al、zro2、cuo、al2o3靶材中的一种或多种。其中，所述pvd设备的功率设定为50-500w，溅射时间为5-300s，直至在所述直立石墨烯层的花瓣表面上形成一层均匀的纳米粒子层。在该步骤中，形成的纳米粒子的粒径为20-50nm。
49.本发明还要求保护以上所述的直立石墨烯材料在在捕获外泌体中的应用，如图4所示，为捕获外泌体后直立石墨烯材料的sem正面照片，箭头指出的即为捕获的外泌体基团。在外泌体捕获中，实际捕获外泌体的是dna探针，直立石墨烯材料作为框架提供更多的空间和表面积，可以让更多的dna探针附着在其表面，实现外泌体的捕获。具体的捕获过程如下：dna探针的一端修饰了磷酸根，另一端修饰了脂质分子。直立石墨烯材料上的纳米粒子通过配位作用与dna探针中一端的磷酸根离子结合，形成石墨烯-金属离子-dna探针的结构。加入外泌体后，dna探针另一端的脂质分子能够自发嵌入外泌体脂质双分子层中，实现快速捕获，形成石墨烯-金属离子-dna探针-外泌体的结构。
50.在另一实施例中，所述纳米粒子还可以用化学基团所取代，或化学基团和纳米粒子共同生成于所述直立石墨烯层上，共同实现外泌体捕获。该化学基团可以通过化学修饰形成于所述直立石墨烯层上。由于石墨烯是一种单层的二位碳纳米材料，其所有原子均位于表面，因此对石墨烯进行表界面化学修饰可有效调控其电学性能。本发明中通过在直立石墨烯层表面形成化学基团，可取代纳米粒子层，实现在外泌体捕获中的应用。该化学基团可以为羟基、羧基、硝基、甲基等化学基团，通过现有技术的化学修饰方法形成于所述直立石墨烯层上。
51.综上所述，本发明提供一种直立石墨烯材料及其制备方法和在外泌体捕获中的应用。本发明的直立石墨烯材料的制备方法的工艺条件温和，易于操作，生产成本低，通过本制备方法制得的直立石墨烯层呈三维立体纳米森林结构，其表面积相对于平面结构增加了数百倍，从而大大增强了本材料对外泌体的捕获率，另外还具有纯度高、耐化学性能优异、微观力学性能好、不易脱落等特点。本发明的直立石墨烯材料在常温下即可与外泌体的基团充分、快速、牢固地结合，从而实现快速、简单、高效地提取外泌体，其开创了一新型的外泌体捕获手段，应用该直立石墨烯材料用于外泌体捕获耗时短、费用低、易操作、提取效率高，值得大力推广使用。
52.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。