放射治疗微球的制作方法

放射治疗微球
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年5月23日提交的美国临时申请序列号62/851,915的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.无。


背景技术：

5.肝细胞癌(hcc)是最常见的肝癌类型。它是第六大最常见的癌症类型和导致癌症死亡的第三大最常见原因。hcc特别具有侵袭性，存活率低(五年存活率《5％)，因此仍然是全球重要的公共卫生问题(globaldata intelligence center-pharma,url pharma.globaldata.com/homepage,2019)。hcc最常见于表现出肝硬化或肝脏瘢痕的肝脏，这可由多种因素引起，包括乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、长期酒精滥用以及可在某些作物(如玉米)上生长的常见真菌黄曲霉毒素。还发现hcc在男性中比女性更常见，比例为2.4:1(balogh等人，j hepatocell carcinoma 3:41-53,2016)。
6.治疗不伴随肝硬化的hcc的主要方法是通过手术切除肿瘤(切除术)。然而，如果患者的肝功能已经受损，肿瘤已经扩散到多个位置或太大，或者如果切除后患者保证手术后的肝功能的肝脏残留量太少，则肿瘤不可视为可切除的。对于肝硬化患者，最好的治疗方法是肝移植，但由于供体器官短缺，满足移植标准的患者等待时间超过2年。
7.对于不可切除的hcc，还有其他几种非手术选择，它们试图减小肿瘤的大小或数量以延缓疾病进展并且改善患者指标以允许切除。最常见的方式是经动脉化疗栓塞术，其中两个主要血管之一，即肝动脉，被阻塞(栓塞)以切断肿瘤的血液供应。在栓塞之前，将化学治疗剂注射到动脉中以将其优先递送至肿瘤细胞。这种方法使肝门静脉完好无损，因此认为保护主要依赖于其供血的非肿瘤肝细胞的健康。最近，建议使用随时间释放化学治疗剂的珠子来提高这些治疗的有效性。
8.类似地，经动脉放射栓塞使用相同类型的颗粒来阻断肿瘤的血液供应；然而，替代化学治疗剂，颗粒依赖于嵌入到递送至肿瘤的颗粒(微球)中的同位素例如钇-90(y-90)发出的辐射。该方式的变体，称为经皮局部消融，在放射栓塞之后，在几天中将乙醇直接注射到肿瘤中。
9.最后，还有微波消融，它使用频率大于900khz的电磁波以将肿瘤加热至高于100℃的温度。这允许更快、更均匀地消融肿瘤，但研究尚未显示与放射栓塞相比在效率上有任何统计差异。
10.对于被认为太晚期而不能切除或局部消融的hcc患者，标准的护理是全身化疗。唯一显示治疗组平均生存期改善的治疗方法是拜耳的多吉美(索拉非尼)，它只能将生存期延长三个月。因此，需要针对hcc和其他癌症的额外治疗选择。


技术实现要素：

11.某些实施方案涉及包含含有脂质体的藻酸盐微球的组合物和用于制备含有脂质体的藻酸盐微球的方法，任选地脂质体包封多种有用物质。可包封在脂质体中并且加载到藻酸盐微球中的值得注意的物质包括放射治疗剂(例如，铼-188)、放射性标记(例如，锝-99m)、化学治疗剂(阿霉素)、磁性颗粒(例如，10μm铁纳米颗粒)和不透射线材料(例如，碘造影剂)。在某些方面，含铼-188脂质体的藻酸盐微球(rhe-lam)可用于治疗肝脏肿瘤，特别是肝细胞癌(hcc)。在更特别的方面，hcc治疗可通过放射栓塞术进行，其中微球阻断从动脉对肿瘤的血液供应，同时铼-188还提供主要针对癌细胞的高剂量辐射。
12.通过标准生产方法生产的颗粒通常具有宽的粒度分布、缺乏均匀性、不能提供足够的释放动力学或其他特性，生产困难并且成本高。此外，颗粒可能很大并且易于形成聚集体，需要进行尺寸选择过程以去除认为太大而不能通过注射或吸入施用于患者的颗粒。这需要筛分并且导致产品损失。本文所述的某些实施方案使用超声波喷嘴或雾化器来制备含有脂质体的微球。超声波雾化器使用高频电能产生振动机械能，通常采用压电换能器。这种能量直接或通过耦合流体传递到液体或制剂中以形成微球，产生含有气溶胶的微球，随后固化或交联。通常，超声波能量破坏结合体或形成脂质体的脂质。本文描述的结果是出人意料和不可预期的，因为脂质体在制备过程中抵抗超声波的破坏从而保持完整，导致形成含有脂质体的较小的藻酸盐微球。
13.在某些方面，通过将脂质体/藻酸盐溶液(液体或进料源)喷射到具有藻酸盐交联剂的固化溶液中来制备含有脂质体的藻酸盐微球(lam)。通常，液体由动力泵提供给单一或复合的孔口喷嘴，所述喷嘴将液体流雾化成喷雾液滴，喷雾液滴暴露于固化溶液时发生交联。喷嘴通常主要根据所需的流速范围选择，其次根据液滴大小范围选择。可使用能够从本文所述液体产生液滴的任何喷雾雾化器。合适的喷雾雾化器包括双流体喷嘴、单流体喷嘴、超声波喷嘴例如sono-tek
tm
超声波喷嘴、旋转雾化器或振动孔式气溶胶发生器(voag)等。在某些方面，喷嘴是超声波喷嘴，1hz至约100khz的喷嘴。在一个特定方面，喷嘴是25khz的喷嘴。在某些方面，喷雾雾化器可具有以下规格中的一种或多种。(a)25khz至180khz的喷嘴，特别是25khz的喷嘴。(b)1至10w的发生器，特别是5.0w的发生器。(c)流速能够为0.1ml/min至1.0ml/min、特别是0.5ml/min的泵(对于如此低的流速可能需要微孔)。固化溶液可设置成接收雾化液体。喷嘴和固化溶液之间的距离可以是1cm至10cm，特别地是4cm。系统可在整个喷嘴使用过程中激活。发生器可激活，泵可形成含有脂质体的藻酸盐微球(lam)。微球可在室温(例如，20℃至30℃)下在固化溶液(例如，cacl2溶液)中孵育1分钟至10分钟，特别是5分钟。在某些方面，微球可以被旋转沉降，例如在1000rpm至1200rpm。随后提取上清液以洗涤球体的游离试剂，例如未结合的re-188/tc-99m。微球溶液可通过100μm孔不锈钢网，以排除在交联或离心过程中可能发生的任何团聚。这些lam可用于动脉内施用。在某些方面，微球可在光显微镜下观察到，并且可使用剂量测定器来测量负载有放射性材料的lam中的放射性保留。
14.某些实施方案涉及直径为1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、300μm、350μm、400μm、450μm至500μm的lam，包括其间的所有值及范围(在某些方面，可具体排除任何值或子范围)。在某些方面，lam的平均直径为20μm至80μm，包括其间的所有值和范围。在某些方面，脂质体与藻酸盐的比率(重量/重量或体积/体积)
为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4，包括其间的所有比率及范围(在某些方面，可具体排除任何值或子范围)。在某些方面，lam包含10重量％至80重量％的脂质体/脂质、10重量％至80重量％的藻酸盐溶液、0.01重量％至5重量％的藻酸盐交联剂和1重量％至30重量％的治疗剂和/或显像剂。
15.如本文所用，“脂质体”是指由被一层或多于一层磷脂层包围的含水核组成的囊泡。脂质体可以是单层的，由单个双层组成，或者其可以是多层的，由两个或多于两个同心双层组成。脂质体的范围从小的单层囊泡(suv)到更大的多层囊泡。lmv在搅拌干燥脂质膜/饼通过水化自发形成，干燥脂质膜/饼通常通过将脂质溶解在有机溶剂中、用溶液涂布容器壁并蒸发溶剂而形成。然后，施加能量以将lmv转化为suv、luv等。能量可以是但不限于超声、高压、高温和挤压的形式，以提供较小的单层和多层囊泡。在这个过程中，一些含水介质残存在囊泡中。脂质体也可使用乳液模板法制备。简而言之，乳液模板法包括制备由脂质稳定的油包水乳液，将乳液分层到水相上，将水/油滴离心到水相中并且除去油相以得到单层脂质体的分散体。通过任何方法制备的脂质体，而不仅仅是上述那些，可用于本发明的组合物和方法中。任何前述技术以及本领域已知或将来可能已知的任何其他技术可用作本发明的递送界面之中或之上的治疗剂的组合物。包含磷脂和/或鞘脂的脂质体可用于递送包封在脂质体内部体积内的亲水的(水溶的)或沉淀的治疗化合物和/或用于递送分散在疏水性双层膜内的疏水性治疗剂。在某些方面，脂质体包含选自鞘脂、醚脂质、甾醇、磷脂、磷酸甘油酯和糖脂的脂质。在某些方面，脂质包括例如dspc(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。
16.如本文所用，“藻酸盐”是指可源自海藻的线性多糖。藻酸盐最常见的来源是巨藻(macrocystis pyrifera)物种。藻酸盐由d-甘露糖醛酸(m)和l-古洛糖醛酸(g)的重复单元组成，以交替嵌段和交替单个残基形式存在。可溶性藻酸盐可以是一价盐的形式，包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸铵。在某些方面，藻酸盐包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸铵和三乙醇胺藻酸盐中的一种或多于一种。藻酸盐在配方中的存在量为5重量％至80重量％，优选的量为20重量％至60重量％，最优选约50重量％。在某些方面，藻酸盐是超纯藻酸盐(例如，novamatrix超纯藻酸盐)。可使用通过溶液中的多价阳离子提供的离子凝胶化来交联藻酸盐，例如，其中具有多价阳离子的水溶液或醇溶液与藻酸盐反应。与藻酸盐一起使用的多价阳离子(例如，二价阳离子、单价阳离子不足以交联藻酸盐)包括但不限于钙、锶、钡、铁、银、铝、镁、锰、铜和锌，包括其盐。在某些方面，阳离子是钙并且以氯化钙水溶液的形式提供。
17.在某些方面，治疗剂或显像剂是化学治疗剂、放射治疗剂、热疗剂或造影剂。
18.在某些方面，放射治疗剂包括放射性标记物，例如β发射体(
131
i、
90
y、
177
lu、
186
re、
188
re，其中任一种都可明确排除)或γ发射体(
125
i、
123
i)。在某些方面，放射治疗剂是
188
re。此外，术语“放射治疗”可更广泛地包括任何放射性标记的部分(moiety)，并且可包括与放射性核素相关或包含放射性核素的任何脂质体或lam。脂质体或lam可通过螯合剂、直接化学键合或一些其他方式如连接蛋白与放射性核素结合。
19.在某些方面，化学治疗剂包括但不限于抑制或杀死正在生长的细胞并且可以用于或被批准用于治疗癌症的化合物。示例性化学治疗剂包括在核分裂或细胞浆分裂水平上阻止、干扰、破坏或延迟细胞分裂的细胞抑制剂。这种药剂可以稳定微管，例如紫杉烷类，特别
是多西他赛或紫杉醇，和埃坡霉素，特别是埃坡霉素a、埃坡霉素b、埃坡霉素c、埃坡霉素d、埃坡霉素e和埃坡霉素f，或可使微管不稳定，例如长春花生物碱，特别是长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁和长春瑞滨。脂质体可用于携带亲水剂，正如胶束可用于携带亲脂剂。
20.通常，热疗剂包括能量敏感材料的多个磁性纳米颗粒或“感受器”，其能够在能量源例如交变磁场(amf)存在下通过磁滞损耗产生热量。本文所述的方法通常包括向需要治疗的对象施用有效量的热疗化合物并且向对象施加能量的步骤。能量的施加可引起磁性纳米颗粒的感应加热，这进而加热施用热疗化合物的组织从而足以消融组织。在某些方面，热疗剂包括但不限于磁铁矿(fe3o4)、磁赤铁矿(γ-fe2o3)和feco/sio2，并且在一些实施方案中，可包括例如co
36c65
、bi3fe5o
12
、bafe
12o19
、nife、conife、co-fe3o4和fept-ag的超顺磁性颗粒的聚集体，其中聚集体的状态可诱导磁阻滞。在热疗中，mnp对ac磁场的反应导致热能消散到周围环境中，杀死肿瘤细胞。此外，体温过高可增强癌症的放射和化学疗法。如本文所用，术语“体温过高”是指将组织加热至温度为约40℃至约60℃之间。如本文所用，术语“交变磁场”或“amf”是指周期性地改变其场矢量的方向的磁场，通常以正弦、三角形、矩形或类似形状模式，频率为约80khz至约800khz。也可将amf增加到静态磁场中，使得仅所得磁场矢量的amf分量改变方向。应当理解，交变磁场可以伴随交变电场并且本质上可以是电磁的。在某些实施方案中，热疗剂可在不存在脂质下并入藻酸盐微球中，并且因此形成含有热疗剂的藻酸盐微球，其中热疗剂未并入脂质体中但并入藻酸盐微球中。
21.在某些方面，造影剂或显像剂包括但不限于过渡金属、碳纳米材料如碳纳米管、富勒烯和石墨烯、近红外(nir)染料如吲哚菁绿(icg)，和金纳米颗粒。过渡金属是指元素周期表第3族至12族的金属，如钛(ti)、钒(v)、铌(nb)、钽(ta)、铬(cr)、钼(mo)、钨(w)、锰(mn)、铁(fe)、钌(ru)、锇(os)、铱(ir)、镍(ni)、铜(cu)、锝(tc)、铼(re)、钴(co)、铑(rh)、铱(ir)、钯(pd)、铂(pt)、银(ag)、金(au)，镧系元素如铕(eu)、钆(gd)、镧(la)、镱(yb)和铒(er)，或后过渡金属如镓(ga)和铟(in)。在一方面，成像模态选自：正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射断层扫描(spect)、计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)、超声成像(us)和光学成像。在本发明的另一方面，成像模态是正电子发射断层扫描(pet)。显像剂包括但不限于放射性标记、荧光团、荧光染料、光学报道分子(reporter)、磁性报道分子、x射线报道分子、超声成像报道分子或纳米颗粒报道分子。在本发明的另一方面，显像剂选自放射性同位素元素的放射性标记，其中放射性同位素元素选自：砹、铋、碳、铜、氟、镓、铟、碘、镥、氮、氧、磷、铼、铷、钐、锝、铊、钇和锆。在另一方面，放射性标记选自：锆-89(
89
zr)、碘-124(
124
i)、碘-131(
131
i)、碘-125(
125
i)、碘-123(
123
i)、铋-212(
212
bi)、铋-213(
213
bi)、砹-221(
211
at)、铜-67(
67
cu)、铜-64(
64
cu)、铼-186(
186
re)、铼-186(
188
re)、磷-32(
32
p)、钐-153(
153
sm)、镥-177(
117
lu)、锝-99m(
99m
tc)、镓-67(
67
ga)、铟-111(
111
in)、铊-201(
201
tl)、碳-11、氮-13(
13
n)、氧-15(
15
o)、氟-18(
18
f)和铷-82(
82
ru)。
22.在本技术中通篇讨论本发明的其他实施方案。关于本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适用于本发明的其他方面，反之亦然。本文描述的每个实施方案均理解为适用于本发明所有方面的本发明的实施方案。预期本文讨论的任何实施方案可关于本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
23.在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，不使用数量词可以表示“一个/一种”，但其也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义相一致。
24.整个本技术中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的设备或方法的误差的标准偏差。
25.权利要求中使用的术语“或”用于指“和/或”，除非明确表示仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。
26.如在本说明书和权利要求中使用的，措辞“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包容性或开放式的，并且不排除另外、未述及的要素或方法步骤。
27.如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”、“特征在于”或其任何其他变体，意在包括所述组分的非排他性包含，但受另外明确指出的任何限制。例如，“包含”一系列要素(例如，组分或特征或步骤)的化学组合物和/或方法不一定仅限于那些要素(或组分或特征或步骤)，而是可包括未明确列出或化学组合物和/或方法固有的其他要素(或组分或特征或步骤)。
28.如本文所用，过渡短语“由
……
组成”和“组成为”排除未指定的任何要素、步骤或组分。例如，权利要求中使用的“由
……
组成”或“组成为”会将权利要求限制在权利要求中具体所述的组分、材料或步骤，但通常与之相关的杂质(即，给定组分中的杂质)除外。当短语“由
……
组成”或“组成为”出现在权利要求主体的一个分句中，而不是紧跟在前序部分之后时，短语“由
……
组成”或“组成为”仅限制此分句中所述的要素(或组分或步骤)；其他要素(或组分)并未作为整体排除在权利要求之外。
29.如本文所用，过渡短语“基本上由
……
组成”和“基本上组成为”用于定义化学成分和/或方法，其包括除了字面公开的之外的材料、步骤、特征、组分或要素，条件是这些另外的材料、步骤、特征、组分或要素不对要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响。术语“基本上由
……
组成”介于“包括”和“由
……
组成”之间。
30.本发明的其它目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应该理解，详细说明和具体实施例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说从该详细描述中将变得明显。
附图说明
31.下列附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并且结合本文呈现的说明书实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
32.图1.动脉内注射到肝动脉后的两只兔子的图像，表明在肝脏中的栓塞功效。
具体实施方式
33.以下讨论针对本发明的各种实施方案。术语“发明”并非意在是指任何特定实施方案或以其他方式限制本公开的范围。尽管这些实施方案中的一个或多个可以是优选的，但公开的实施方案不应解释为或以其他方式使用为限制本公开的范围，包括权利要求。此外，
本领域技术人员将理解以下描述具有广泛的应用，并且对任何实施方案的讨论仅是指为此实施方案的示例，并不意在暗示本公开的范围、包括权利要求限于此实施方案。
34.实施方案涉及治疗性和/或诊断性藻酸盐微球。某些方面涉及用于动脉内栓塞治疗的治疗性藻酸盐微球。在另一方面，治疗性藻酸盐微球是放射治疗性藻酸盐微球。在某些实施方案中，超声喷雾雾化可用于制备藻酸盐微球。本文所述的方法可用于制造小(20微米至80微米)的均质的含有脂质体的藻酸盐微球(lam)。已经描述包封在250微米大小的微球中的较大铼脂质体；然而，动脉内递送需要较小的微球，例如用于肝细胞癌(hcc)和其他癌症。某些方面包括：
35.使用超声雾化将各种抗癌药物(例如药物阿霉素)加载到lam中的方法，这些药物稳定地保持在dox-lam内，在动脉内递送到肿瘤中后可能会缓慢释放。
36.将铼-188、tc-99m或多种抗癌药物稳定加载到预先形成的lam中的方法。出人意料的是，标记剂或药物能够渗透到藻酸盐微球中，然后进入脂质体，在脂质体中被稳定地捕获。
37.制备含有小的10纳米铁颗粒的磁性藻酸盐微球(mam)的方法。出人意料的发现是这些小的铁纳米颗粒稳定地保留在藻酸盐微球内。用于该发现的铁纳米颗粒目前正在圣安东尼奥开发，用于通过交流场中的热加热来治疗人类前列腺癌。
38.在某些方面，re-188β发射微球可用于治疗肝癌。这种栓塞的但最终可生物降解的微胶囊可携带廉价的β发射的放射性核素re-188。该治疗剂可在短短几个小时内制造和施用，并且允许高质量的成像。建议的模型涉及将re-188脂质体包封到藻酸盐微球中。
39.该微球系统是灵活的，因为它除放射性核素之外可携带药物。例如，在先前的研究中，放射性标记脂质体阿霉素与放射性核素铼一起使用。该脂质体阿霉素可以并入微球中，用于肝癌的动脉内治疗。这些双模态微球会具有改善的治疗效果。也可以将不透射线材料碘造影剂并入微球中，以在动脉内输注过程中辅助肿瘤治疗的可视化。
40.i.藻酸盐微球
41.藻酸盐是一种多糖，它在二价阳离子例如钙和钡的存在下形成硬化的凝胶基质。已经研究由藻酸盐构建的微球用于从藻酸盐基质中延迟释放治疗剂。具体地，低分子量分子(如阿霉素)可从球体中逸出并且到达靶组织。游离放射性核素也不例外，如果动脉内施用，则最可能会泄漏到体循环中。因此，本发明依赖于将re-188包封在藻酸盐微球中，而不允许放射性核素逸出多孔藻酸盐界面。本公开提出通过制造具有re标记的脂质体的藻酸盐微球来成功地将re-188包封在微球中。脂质体不允许re-188通过脂质双层，并且脂质体》100nm，防止它们能够逸出藻酸盐的多孔界面。这些球体旨在用于直接动脉内递送至肝脏肿瘤以进行放射性栓塞，因此需要可进入毛细血管床但不会通过(进入体循环)的尺寸范围。因此，提出的模型是制备含有铼脂质体的藻酸盐微球(20μm至80μm)的方法。如前所述，tc-99m可作为放射性核素代替re-188，因为这两种放射性核素具有相似的化学性质。放射性标记程序实际上是相同的。
42.脂质体形成。构建硫酸铵梯度脂质体。将适量的磷脂和胆固醇加入圆底烧瓶中。根据脂质组成加入氯仿或氯仿-甲醇以溶解脂质并且形成脂质溶液。对脂质溶液进行旋转蒸发以除去溶剂并且形成脂质膜。温度和蒸发时间会基于脂质制剂而变化。在真空下干燥脂质膜至少4小时。在某些方面，干燥可过夜。以预定的总脂质浓度(例如，60mm)再水化脂质膜
(例如，300mm的蔗糖无菌水溶液)用于注射。涡旋溶液并且加热至脂质相变温度以上，直到所有脂质都在溶液中。冷冻脂质溶液并且冻干形成干粉。干粉在适当缓冲液(例如，硫酸铵的无菌水中溶液)中再水化至适当的总脂质浓度(例如，60mm)，从而形成新的溶液。剧烈涡旋溶液并且加热至脂质相变温度以上，直到所有脂质都在溶液中。用液氮冷冻脂质溶液，然后在设定温度高于脂质相变温度的水浴中解冻。重复冻-融程序至少三个循环。挤出脂质体样品，直到达到所需粒度。挤出后，最终脂质体产品应储存在4℃下，直到需要。脂质体可通过激光散射粒度测定、产热原性、无菌性和脂质浓度来表征。
43.藻酸盐制备。藻酸盐溶液(例如1重量/体积％、2重量/体积％、3重量/体积％、4重量/体积％、5重量/体积％、6重量/体积％)在水或其他合适缓冲液(例如hepes缓冲液)中制备。使藻酸盐溶液静置至少48小时以均质化和消除气泡。
44.交联剂制备。制备0.136m cacl2·
2h2o和0.05重量/体积％重量/体积吐温80的交联溶液。在某些情况下，bacl2也是可接受的交联剂。
45.放射性标记的脂质体制备。用ph 7.4的缓冲液准备sephadex g-25柱。通常，每2ml脂质体可使用1根色谱柱。从sephadex g25柱储液器中排出缓冲液，将脂质体加入柱顶，用ph 7.4缓冲液洗脱。为了最大限度地提高产量和最大限度地减少稀释，在放射性标记之前使用离心方法(而不是重力方法)对脂质体进行脱盐。为了最大限度地提高产量和提高效率，不使标记的脂质体通过sephadex柱。在后面步骤中清洗球体将除去任何游离的re-188/tc-99m。
46.脂质体/藻酸盐溶液制备。将脂质体溶液与藻酸盐溶液按体积1:1涡旋直至均匀。
47.喷嘴装置及其用途。在某些方面，采用喷嘴装置。喷嘴装置可具有以下规格中的一种或多种。(a)出于动脉内栓塞的目的，建议使用25khz喷嘴。(b)5.0w的发生器。(c)0.5ml/min的注射泵(对于如此低的流速可能需要微孔)。(d)将交联溶液放在搅拌器上和喷嘴下方(例如，下方约4cm)。在整个喷嘴使用过程中启动。(e)启动发生器，然后启动注射泵，形成含有脂质体的藻酸盐微球。使微球在室温下在cacl2溶液中孵育5分钟。以1000rpm至1200rpm旋转沉降微球并且提取上清液以洗涤球体的游离re-188/tc-99m。建议通过另外用无菌去离子水重新悬浮小球来清洗球体。离心此混合物并且提取上清液。在无菌盐水中重悬经洗涤的球体。使球体/盐水溶液通过100μm孔不锈钢网，以排除在交联或离心过程中可能发生的任何团聚。在注射器中制得含有脂质体的微球，用于动脉内施用。
48.与目前用于通过介入放射学治疗肝肿瘤的y-90微球相比，预计这些微球将具有以下显著优势：re-188可易于获得，并且比y-90微球便宜得多。这是因为现在可一次性购买一台铼-188发生器，因为500mci发生器(足以每天治疗几个患者持续4个月)或3000mci发生器(足以每天治疗5-10名患者持续4个月)成本相对低。这些发生器可使用长达6个月，每天从发生器中产出re-188，持续6个月。该发生器可快速制造re-188微球，以便在短时间内施用，考虑到肝脏肿瘤的生长速度，这可以为患者带来显著益处。与在反应器中制造并且需要提前2周预定的y-90微球相比，re-188微球的低成本和易得性可提供显著优势。铼发生器的低成本和便携性也可能意味着这项技术可容易地在肝脏肿瘤发病率高于美国的发展中国家使用。
49.与y-90一样，re-188具有高能β粒子，在组织中的平均组织路径长度是4mm。该组织路径长度对于动脉内治疗很重要，以在肝肿瘤内提供广阔的微辐射场。组织中的该β能量和
路径长度是目前用于治疗胶质母细胞瘤的re-186的两倍。与y-90不同，re-188在理想的光子能量范围内具有15％的γ光子，用于采集非常高质量的spect图像以监测分布和保留。相比之下，y-90不发射γ光子，仅产生轫致辐射，其光子通量比铼-188低至少100倍。铼可容易地从re-188发生器中获得，该发生器可位于铼-188微球的使用地点附近。该发生器可持续6个月，可以相对较低成本为数千名患者的治疗提供铼-188。
50.在某些实施方案中，微球可通过喷雾雾化制备。常规的雾化方法包括气压和电喷雾。在某些方面，方法使用超声波处理作为制备窄尺寸范围的微球的方法。位于纽约州波基普西的sono-tek公司制造带有超声波雾化表面的喷嘴，与传统方法相比，该喷嘴可在窄尺寸范围内快速雾化流体。平均微球尺寸主要取决于为球制备选择的喷嘴的频率。对喷嘴的研究发现，可使用25khz喷嘴以0.5ml/min的速度制备大小范围为20微米至80微米(平均44微米)的球体。
51.藻酸盐微球也可使用微流化技术制造。可制备的藻酸盐微球的大小范围为20至500，其取决于所利用的微流体系统。可使用微流化制备40微米
±
3微米的藻酸盐微球。由于该方法引入的时间因素，该方法有待用放射性核素进行测试。通过超声雾化交联需要几分钟，而用单个微流控芯片构建球体可能需要一整天。许多放射性在患者施用前会经历衰减。因此，可认为该方法是(a)同时利用许多芯片或(b)利用具有多个入口/出口的单个芯片。
52.预期使用包含脂质体纳米颗粒的可生物降解藻酸盐微球的显著益处是利用肿瘤内巨噬细胞摄取脂质体微球以改善治疗剂在肿瘤内的肿瘤内分布的潜力。进一步预期，这种改善的生物分布将是由于可在肿瘤内自由移动的巨噬细胞对降解的微球的吞噬作用。巨噬细胞也被认为是增强另一种类型的纳米颗粒的肿瘤覆盖的机制，有证据表明纳米颗粒从肿瘤小区域的注射部位移动到覆盖整个肿瘤。动脉内递送后巨噬细胞增强的肿瘤内覆盖增强可包括含有β发射的放射性核素纳米颗粒的可降解微球已栓塞进给肿瘤的动脉。巨噬细胞可部分降解微球并且摄取纳米颗粒，将治疗性辐射移动到部分肿瘤中。微球可完全降解，巨噬细胞已覆盖肿瘤，包括肿瘤的浸润边缘。
53.最近研究表明，当将250微米大小的藻酸盐微球注射到肝脏中时，这些藻酸盐微球的很大一部分降解并且在2周内在肿瘤内扩散。与尺寸大于200微米的微球相比，使用小于100μm的微球可以提高通过巨噬细胞的生物降解性。如果需要，另一种提高降解率的方法是在藻酸盐微球中包括其他成分，例如明胶和葡甘露聚糖。在作为盖茨基金会药物输送补助金的一部分进行的先前研究中，我们已经表明，含有大量明胶(胶原蛋白)(明胶与藻酸盐的比率为1:2)和/或葡甘露聚糖(葡甘露聚糖与藻酸盐的比率为1:2)藻酸盐微胶囊仍然也可形成稳定的基于藻酸盐的微球，并且可用tc-99m或re-186进行稳定的放射性标记。由于巨噬细胞中胶原酶的存在或通过葡甘露聚糖增加m2巨噬细胞对巨噬细胞上的甘露糖受体的刺激，改变微球的组成可能会导致更快速的巨噬细胞降解，从而导致混合藻酸盐/葡甘露聚糖微球的更快速吞噬和降解。先前研究表明，葡甘露聚糖可增强巨噬细胞对纳米颗粒的摄取。与使用不可生物降解的玻璃或树脂微球栓塞相比，能够产生可降解微球并且控制其在施用后的降解时间会为这种基于藻酸盐的微球制造提供显著优势。与永久性玻璃或树脂微球相比，可生物降解微球对正常肝组织的损害较小。
54.铼微球可用于通过动脉内递送治疗癌症，初始癌症候选治疗是肝癌。该策略可潜在地扩展到肺癌。低成本铼-188发生器和藻酸盐微球制备的可用性使该疗法成为治疗癌症
的廉价选择。
55.含有tc-99m脂质体的微球体(tec-lam)是铼-188具代表性的替代物，其被动脉内注射到兔子的肝动脉中，并且已证明在肝脏中具有栓塞功效，如2只兔子在施用后1小时的图像所示。24小时后，图像几乎没有变化，两只兔子的肝脏外观非常相似，保留效果非常好。注意的是，在肺部或肾脏中没有可观察到的活性。对于这些tec-lam，观察不到肺部活性是非常有前途的。目前临床上可用的含有y-90的微球通常在肺中具有5％活性，当分流到肺过高时，这可以是治疗的限制因素。无肺活性或肾脏活性可观察到的事实是非常令人鼓舞的，并且表明lam在它们被注射的位置在动脉内发生栓塞，并且随着时间推移它们在循环中不会有任何很大程度地分解。re-186微球的开发已经完成，但尚未进行体外测试。
56.ii.脂质体
57.为脂质体组合物选择合适的脂质受以下因素控制：(1)脂质体稳定性，(2)相变温度，(3)电荷，(4)对哺乳动物系统无毒，(5)包封效率，(6)脂质混合物特性等。形成囊泡的脂质优选具有两个烃链，通常是酰基链，和极性或非极性的头部基团。烃链可以是饱和的或具有不同程度的不饱和度。有多种合成的形成囊泡的脂质和天然存在的形成囊泡的脂质，包括鞘脂、醚脂质、甾醇、磷脂、磷酸甘油酯和糖脂(例如，脑苷脂和神经节苷脂)。
58.磷脂酰甘油包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油(心磷脂)，其中两条烃链通常具有约14至22个碳原子的长度。如本文所用，缩写“pc”代表磷脂酰胆碱，“ps”代表磷脂酰丝氨酸。含有饱和与不饱和脂肪酸的脂质对于本领域技术人员来说是广泛可用的。此外，脂质的两条烃链可以是对称或不对称的。其酰基链具有不同长度与饱和度的上述脂质和磷脂可以商业获得或根据公开的方法制备。
59.磷脂酰胆碱包括但不限于二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二花生酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二芥子酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰-硬脂酰-磷脂酰胆碱、硬脂酰-棕榈酰磷脂酰胆碱、硬脂酰-油酰-磷脂酰胆碱、硬脂酰-亚油酰磷脂酰胆碱和棕榈酰-亚油酰-磷脂酰胆碱。不对称磷脂酰胆碱称为1-酰基,2-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，其中酰基彼此不同。对称磷脂酰胆碱被称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。如本文所用，缩写“pc”是指磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中缩写为“dmpc”。磷脂酰胆碱1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中缩写为“dopc”。磷脂酰胆碱1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中缩写为“dppc”。
60.一般而言，在各种脂质中发现的饱和酰基包括具有如下惯用名的基团：丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一酰基、月桂酰基、十三酰基、肉豆蔻酰基、十五酰基、棕榈酰基、植烷酰基、十七烷酰基、硬脂酰基、十九烷酰基、花生酰基、二十一烷酰基、山嵛酰基、二十三烷酰基和木蜡酰基。饱和酰基的相应iupac名称是丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、3,7,11,15-四甲基十六烷酸、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基、二十一烷酰基、二十二烷酰基、二十三烷酰基和二十四烷酰基。在对称和不对称磷脂酰胆碱两者中发现的不饱和酰基包括肉豆蔻油酰基、棕榈油
酰基、油酰基、反油酰基、亚油酰基、亚麻酰基、二十碳烯酰基和花生四烯酰基。不饱和酰基的相应iupac名称是9-顺-十四烷酰基、9-顺-十六烷酰基、9-顺-十八烷酰基、9-反-十八烷酰基、9-顺-12-顺-十八碳二烯酰基、9-顺-12-顺-15-顺-十八碳三烯酰基、11-顺-二十碳烯酰基和5-顺-8-顺-11-顺-14-顺-二十碳四烯酰基。
61.磷脂酰乙醇胺包括但不限于二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺、二油酰-磷脂酰乙醇胺和卵磷脂酰乙醇胺。磷脂酰乙醇胺在iupac命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，取决于它们是对称脂质还是不对称脂质。
62.磷脂酸包括但不限于二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸和二油酰基磷脂酸。磷脂酸在iupac命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸，其取决于它们是对称脂质还是不对称脂质。
63.磷脂酰丝氨酸包括但不限于二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、棕榈酰基-油酰磷脂酰丝氨酸和脑磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸在iupac命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-l-丝氨酸]或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-[磷酸-l-丝氨酸]，取决于它们是对称脂质还是不对称脂质。如本文所用，缩写“ps”是指磷脂酰丝氨酸。
[0064]
磷脂酰甘油包括但不限于二月桂酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基-磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰甘油和卵磷脂酰甘油。磷脂酰甘油在iupac命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]，取决于它们是对称脂质还是不对称脂质。磷脂酰甘油1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]在本文中缩写为“dmpg”。磷脂酰甘油1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-(磷酸-rac-1-甘油)(钠盐)在本文中缩写为“dppg”。
[0065]
合适的鞘磷脂包括但不限于脑鞘磷脂、卵鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂和二硬脂酰基鞘磷脂。
[0066]
其他合适的脂质包括糖脂、鞘脂、醚脂质、糖脂如脑苷脂和神经节苷脂，以及甾醇如胆固醇或麦角甾醇。如本文所用，术语胆固醇有时缩写为“chol”。适合用于脂质体的另外脂质是本领域技术人员已知的。
[0067]
在某些方面，脂质体的总表面电荷可变化。在某些实施方案中，使用阴离子磷脂，例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸和心磷脂。可使用中性脂质，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。阳离子脂质可用于改变脂质体电荷，作为脂质组合物的次要组分或作为主要或唯一组分。合适的阳离子脂质通常具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且其中脂质具有整体净正电荷。优选地，脂质的头部基团带有正电荷。
[0068]
本领域技术人员将选择达到特定流动性或刚性程度的形成囊泡的脂质。脂质体的流动性或刚性可用于控制诸如脂质体的稳定性或包埋剂的释放速率等因素。具有更刚性脂质双层或液晶双层的脂质体通过并入相对刚性的脂质来实现。脂质双层的刚性与双层中存在的脂质的相变温度相关联。相变温度是脂质改变物理状态并且从有序凝胶相转变为无序液晶相的温度。若干因素影响脂质的相变温度，包括烃链长度和不饱和度、脂质的电荷和头部基团种类。具有相对高的相变温度的脂质将产生更刚性的双层。其他脂质组分，如胆固
醇，也已知有助于脂质双层结构中的膜的刚性。本领域技术人员广泛使用胆固醇来控制脂质双层的流动性、弹性和渗透性。它被认为是通过填充脂质双层中的间隙来发挥作用。相比之下，脂质流动性通过并入相对流质的脂质，通常是具有较低相变温度的脂质来实现。许多脂质的相变温度在各种来源中列出。
[0069]
在某些方面，脂质体由内源性磷脂制成，内源性磷脂例如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)和二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(dmpg)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱[dopc]、胆固醇(chol)和心磷脂。
[0070]
iii.施用和治疗方法
[0071]
栓塞治疗。肿瘤动脉栓塞的方法包括将栓子注射到微动脉中，引起机械阻塞和抑制肿瘤生长。在某些方面，栓子是如本文所述的脂质体藻酸盐微球(lam)。在某些方面，治疗的肿瘤是不适合外科手术的恶性肿瘤。肿瘤可以是肝细胞癌(hcc)、肾癌、骨盆肿瘤和头颈癌。
[0072]
用于栓塞目的的微球的有效性取决于微球直径、微球降解速率和治疗剂释放速率中的一种或多于一种。微球制剂可阻断供给癌症或肿瘤的微血管。栓塞可提供靶向肿瘤的治疗剂，使治疗剂成为可靶向和可控的。这种药物施用能够改善药物在体内的分布，增强药代动力学特征，提高药物的生物利用度，改善治疗效果，并且减轻毒性或副作用。