通过细胞外囊泡来递送CRISPR/MCAS9以用于基因组编辑的制作方法

x-x-x-ser/thr(序列号：3)开始。起始met通过共翻译、通过蛋白水解去除，并且经由稳定的酰胺键将豆蔻酸添加至暴露的n-末端甘氨酸。如本文所用，“棕榈酰化”是指脂肪酸，如棕榈酸，与半胱氨酸的共价连接。因此，在一些实施例中，所公开的融合蛋白的豆蔻酰化结构域不包含半胱氨酸残基。因此，在一些实施例中，豆蔻酰化结构域包含氨基酸序列g-x-x-x-s/t(序列号：1)，其中x是除cys外的任何氨基酸。
10.本文还公开了一种重组多核苷酸，其包含编码与第一表达控制序列可操作地连接的向导rna的核酸序列，以及编码与第二表达控制序列可操作地连接的所公开的cas9融合蛋白的核酸序列。
11.本文还公开了用所公开的多核苷酸进行转导的任何类型的细胞。在一些实施例中，细胞是能够产生如外泌体的细胞外囊泡的任何类型的细胞。还公开了一种制备基因编辑组合物的方法，其包含在适于产生封装向导rna和融合蛋白的细胞外囊泡的条件下培养所公开的细胞。
12.还公开了一种基因编辑组合物，其包含封装所公开的cas9融合蛋白和向导rna的细胞外囊泡。最后，本文还公开了一种用于编辑细胞中的基因的方法，其涉及使细胞与本文公开的基因编辑组合物接触。
13.在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和附图以及从权利要求书中显而易见。
附图说明
14.图1a至1c示出了豆蔻酰化蛋白的出现频率在细胞外囊泡(ev)中升高。图1a示出了在哺乳动物基因组中鉴定出的182种潜在的豆蔻酰化蛋白，其等在位点2含有甘氨酸。假设哺乳动物细胞中总共有约20,000个蛋白质，豆蔻酰化蛋白质的频率占哺乳动物基因组的约0.9％。从四项研究分析通过蛋白质组学检测的ev中豆蔻酰化蛋白(红色，分子)和总蛋白(黑色，分母)的数量，包括一项针对60个癌细胞系的研究(表1-2)和另外三项针对正常组织(胸腺、母乳和尿液)的研究(表3-5)(35-40)。图1b示出了60个单独的癌细胞系中ev中豆蔻酰化蛋白的出现频率(35)。红线代表哺乳动物基因组中0.9％的豆蔻酰化蛋白质。图1c示出了包括du145、pc3、22rv1和lncap细胞的前列腺癌细胞在含有10％的无ev/外泌体的fbs的培养基中培养24小时。通过连续离心从条件培养基中分离ev。通过蛋白质印迹分析src激酶、ar、钙联接蛋白、gapdh和cd9(一种外泌体蛋白标记物)在细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中的表达水平。负载来自ev或tcl的相同量的蛋白质(10μg)。src激酶在所有测试的细胞系的ev中表达。计算ev中src蛋白水平相对于tcl中src蛋白水平的比率。du145细胞中的比率显著高于其它三种细胞系中的比率。数据表示为平均值
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sem，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
15.图2a至2c示出了豆蔻酰化的缺失抑制了src激酶封装到ev中。图2a是src(wt)(gsnksk，序列号：352)和src(g2a)(asnksk，序列号：353)突变体的示意图。图2b示出了通过慢病毒感染用src(wt)或src(g2a)转导的du145、nih3t3和syf1(src-/-yes-/-fyn-/-)细胞。转导的细胞在无外泌体的fbs培养基中生长，并且从条件培养基中分离出ev。通过蛋白质印迹分析转导细胞的细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。负载10μg来自ev或tcl的蛋白质。通过image j软件对src蛋白水平进行量化。示
出了ev中src水平相对于tcl中src水平的比率。数据表示为平均值
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sem，**p《0.01；***p《0.001。图2c示出了通过慢病毒感染用对照载体，src(wt)或src(g2a)转导的du145细胞。转导的细胞在含有(泳道4－6和10－12)或不含(泳道1－3和7－9)50μm豆蔻酸－叠氮化物(豆蔻酸的类似物)的无ev/外泌体的fbs培养基中生长。使用点击化学检测来自ev或tcl的豆蔻酰化蛋白。负载10μg来自ev或tcl的蛋白质。通过蛋白质印迹测量src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的水平。
16.图3a至3c示出了活化的src激酶促进其封装到ev中。图3a是src(y529f)(gsnksk，序列号：352)和src(y529f/g2a)(asnksk，序列号：353)构建体的示意图。图3b至3c示出了通过慢病毒感染用载体对照，src(wt)、src(g2a)、src(y529f)或src(y529f/g2a)转导的du145和syf1细胞。通过连续超速离心从条件培养基分离ev。通过蛋白质印迹法分析衍生自du145(图3b)和syf1(图3c)细胞的细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。负载10μg来自ev或tcl的蛋白质。高暴露时间显示来自表达src(y529f/g2a)的syf1细胞的ev中src激酶的低表达水平(图3c)。考马斯染色用于显示样品的等量负载。通过image j软件对src表达水平进行量化。数据表示为平均值
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sem，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
17.图4a至4c示出了豆蔻酰化和棕榈酰化调节src家族激酶蛋白封装到ev中。图4a是src(wt)(gsnksk，序列号：352)、src(g2a)(asnksk，序列号：353)、src(s3c/s6c)(gcnkck，序列号：354)、fyn(wt)(gcvqck，序列号：355)、fyn(g2a)(acvqck，序列号：356)和fyn(c3s/c6s)(gsvqsk，序列号：357)突变体的示意图。src(g2a)和fyn(g2a)突变体导致豆蔻酰化的缺失。src(s3c/s6c)导致棕榈酰化的增加，而fyn(c3s/c6s)导致棕榈酰化的缺失。图4b至4c示出了通过慢病毒感染用src(wt)、src(g2a)和src(s3c/s6c)转导du145细胞(图4b)，或用fyn(wt)、fyn(g2a)和fyn(c3s/c6s)转导du145细胞(图4c)。转导的细胞在无ev/外泌体的培养基中生长24小时，并从条件培养基中分离出ev。负载10μg来自细胞外囊泡(ev)或总细胞裂解物(tcl)的蛋白质。通过免疫印迹分析exo或tcl中src或fyn、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。通过image j对src蛋白水平进行量化。计算ev中src或fyn蛋白水平相对于tcl中src或fyn蛋白水平的比率。数据表示为平均值
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sem。*p《0.05；****p《0.0001；ns：不显著。
18.图5a至5d示出了豆蔻酰化促进src激酶封装到血浆ev中。通过慢病毒感染用对照载体、src(y529f)或src(y529f/g2a)转导du145细胞。将转导的du145细胞(1x104细胞/移植物)与胶原蛋白混合，并植入scid小鼠(3月龄，每组n＝3)的肾下。5周后，处死小鼠，收获异种移植物，使用exoquick试剂盒从血浆中提取ev。图5a示出了使用颗粒基质分析仪通过纳米颗粒跟踪分析测量的ev的大小、ζ电位和颗粒数。图5b至5c是异种移植物的图像(具有肾)和重量。图5d示出了通过免疫印迹检测出的血浆ev中src激酶、非psrc(y529)(用于检测活化的src)和tsg101(外泌体的标记物)的表达水平。考马斯染色用于显示样品的等量负载。示出了三次实验重复(1至3)。数据表示为平均值
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sem。ns：不显著。**:p《0.01
19.图6a至6d示出了血浆ev中src激酶的检测依赖于src诱导的异种移植肿瘤的豆蔻酰化状态。将表达对照载体(1.5x105个细胞/移植物)、src(y529f/g2a)(1.5x105个细胞/移植物)或src(y529f)(1.5x104个细胞/移植物)的du145细胞植入scid小鼠的肾下。4周后，处死小鼠，收获异种移植肿瘤和血浆。图5a示出了分析的血浆ev的大小、ζ电位和颗粒数。图5b
和5c示出了异种移植肿瘤的图像(具有肾)和重量。图5d示出了通过蛋白质印迹测定的血浆ev中src、非psrc(y529)、tsg101和flotillin－1(ev的蛋白质标记物)的水平。负载50μg的ev蛋白。考马斯蓝染色用于反映蛋白质总量的负载。示出了每个实验组的三次重复(1至3)。数据表示为平均值
±
sem。***:p《0.01；ns：不显著。
20.图7a至7c示出了tsg101水平，而不是胆固醇水平，调节src激酶封装到ev中。图7a示出了用菲律宾菌素iii(0，0.25，0.5和1μm)处理24小时的pc3或du145细胞。观察胆固醇的消耗。通过免疫印迹分析细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的水平。图7b至7c示出了通过慢病毒感染用shrna-对照、shrna-tsg101-1或shrna-tsg101-2转导的22rv1和pc3细胞。转导的22rv1和pc3细胞用10％的无ev/外泌体的fbs孵育48小时。从条件培养基中分离出ev。如通过dc蛋白质测定所测定，负载10μg的ev或tcl。通过蛋白质印迹分析tsg101、src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的水平。计算22rv1(图7b)和pc3细胞(图7c)中ev中的src水平与tcl中的src水平的比率。考马斯蓝染色用于反映蛋白质总量的负载。数据表示为平均值
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sem。*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001；ns：不显著。
21.图8示出了脂质酰化调节src家族激酶被封装到ev中。a区示出了src激酶的豆蔻酰化介导其与细胞膜的结合和激酶活性的活化。活化的src激酶大概促进了syntenin-syndecan的组装及其与蛋白质复合物的相互作用，以从细胞膜形成多泡体。通过escrt途径介导src封装到ev。例如，tsg101是escrt途径的基本要素，调节src的封装过程。b区示出了src(g2a)或fyn(g2a)突变体中豆蔻酰化的缺失抑制了其膜结合，从而抑制了syntenin-syndecan的形成和封装到ev中。c区示出了fyn激酶或src(s3c/s6c)突变体中棕榈酰化的获得将蛋白质定位在细胞膜的脂筏区域中，这可能类似地削弱了syntenin-syndecan相互作用的组装，随后将其封装到ev中。
22.图9a至9c示出了被测细胞中ev的大小、ζ电位和颗粒浓度。将包括du145、pc3、22rv1和lncap细胞的前列腺癌细胞在含有10％的无外泌体的fbs的atcc推荐培养基中培养24小时。通过连续超速离心法从条件培养基中分离出ev。通过使用颗粒基质分析仪的纳米颗粒跟踪分析来测量ev的平均大小和大小分布(图9a)、ζ电位(图9b)和颗粒浓度(图9c)。du145细胞产生的ev数显著高于其它三种前列腺癌细胞。数据表示为平均值
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sem。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。ns：不显著。
23.图10示出了豆蔻酰化的缺失降低了src激酶在22rv1细胞中封装到ev中的程度。通过慢病毒感染用src(wt)或src(g2a)转导22rv1细胞。转导的细胞在无外泌体的fbs培养基中生长。从条件细胞培养基收集ev。通过蛋白质印迹评价转导细胞的细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中src的表达水平。负载10μg来自exo或tcl的蛋白质。通过蛋白质印迹分析src激酶、ar、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。通过image j软件对src蛋白进行量化。示出了ev中src蛋白水平相对于tcl中src蛋白水平的比率。数据表示为平均值
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sem。**p《0.01。
24.图11示出了fyn激酶的过表达和fyn激酶棕榈酰化的缺失。通过慢病毒感染用对照载体，fyn(wt)或fyn(c3s/c6s)突变体转导syf1(src-/-yes-/-fyn-/-)细胞。转导的细胞与/不与50μm的17-十八碳炔酸-叠氮化物(棕榈酸酯的类似物)一起孵育。将细胞裂解物通过叠氮化物－炔烃反应进行点击化学反应，并用链霉亲和素－hrp通过免疫印迹检测。通过免疫印迹分析gapdh和fyn的水平。
25.图12示出了src转导的异种移植肿瘤的组织学。通过慢病毒感染用载体对照，src(y529f)或src(y529f/g2a)转导du145细胞。将转导的细胞(1x104细胞/移植物)植入scid小鼠的肾下。5周后，处死小鼠并收获异种移植肿瘤。分别通过苏木素和伊红(h&e)染色和免疫组织化学(ihc)分析src的组织学和表达水平。在表达src(y529f)和src(y529f/g2a)的异种移植肿瘤中检测到src水平升高。
26.图13示出了用菲律宾菌素(filipin)处理降低了pc3细胞中的胆固醇水平。pc3细胞用载体对照或1μm的菲律宾菌素处理24小时。在荧光显微镜下观察处理后的细胞。处理后的细胞用菲律宾菌素iii染色并拍摄代表性图像。1μm的菲律宾菌素的处理抑制了反映pc3细胞胆固醇水平的荧光强度。
27.图14a和14b示出了src激酶豆蔻酰化的缺失抑制了ev中syntenin的表达水平。图4a示出了通过慢病毒感染用对照载体，src(y529f)或src(y529f/g2a)细胞转导的du145细胞。通过免疫印迹分析细胞外囊泡(ev)和总细胞裂解物(tcl)中的syntenin、src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。根据dc蛋白质测定负载10μg的ev或tcl。使用image j软件对源自表达对照载体，src(y529f)或src(y529f/g2a)的du145的ev中syntenin和cd9的表达水平进行量化。对照中的syntenin水平与cd9水平的比率设定为1。图14b示出了通过慢病毒感染用shrna-对照或shrna-src转导的pc3细胞。转导的细胞用10％无外泌体的fbs生长48小时。从条件培养基中分离出ev。通过免疫印迹检测ev和总细胞裂解物中的syntenin、src、钙联接蛋白、gapdh和cd9的表达水平。使用image j软件对ev中的共线性素和cd9水平进行量化。shrna-对照组中的syntenin与cd9水平的比率设定为1。src激酶的下调降低了ev中的syntenin的表达水平。数据表示为平均值
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sem。*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001；****:p《0.0001。为了测定催化各种蛋白质衍生的各种八肽底物的nmt1的km和vmax，金斯瑞生物公司(genscript)合成了25种八肽。这些肽包括src8(g2a)，一种突变体八肽[ala-ser-asn-lys-ser-lys-pro-lys]，它不是nmt1酶的底物。每个数据点具有三次重复。
[0028]
图15a示出了nmt1催化豆蔻酰基掺入衍生自src激酶前导序列的八肽(如gly-ser-asn-lys-ser-lys-pro-lys)中的甘氨酸的n-末端并释放coa。将释放的coa量与7-二乙基氨基-3-(4'-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素反应。在96孔黑色微孔板中进行测定。用flex station 3测定产生的荧光强度，并用酶标仪(激发波长为390nm；发射波长为479nm)检测。图15b示出了衍生自src激酶的八肽与全长nmt1蛋白的肽结合位点的对接分析。nmt1与第一个氨基酸以及含有来自c-src的前2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的前导肽的对接分析表明，具有7至8个氨基酸的肽与nmt1酶具有有利的对接(评分较低)。图15c示出了src8(wt)，而不是src8(g2a)，突变体八肽[ala-ser-asn-lys-ser-lys-pro-lys]是nmt1酶的底物(每个数据点具有三次重复)。
[0029]
图16a至16f示出了cas9的豆蔻酰化促进其封装到ev中，并维持基因组编辑功能。图16a示出了表达cas9/sgrna-scramble、cas9/sgrna-gfp、mcas9/sgrna-gfp和mcas9(g2a)/sgrna-gfp的双顺反子慢病毒载体的图示。衍生自src激酶n-末端的八肽dna序列与命名为mcas9的cas9基因融合。还产生了在mcas9的位点2处gly至ala的突变，命名为mcas9(g2a)。mcas9(g2a)导致mcas9蛋白的豆蔻酰化的缺失。图16b示出了通过脂质体3000用cas9/sgrna-scrambled(阴性对照)、cas9/sgrna-gfp(阳性对照)、mcas9/sgrna-gfp和mcas9(g2a)/sgrna-gfp转导293t-gfp细胞。5天后，通过facs分析在绿色通道中分析转导的
细胞。分选出gfp阴性细胞，并在dmem培养基中再生长。拍摄上述处理组的图像。数据代表了三个实验。图16c示出了在含有60um豆蔻酸-叠氮化物(豆蔻酸的类似物)的培养基中培养分离的gfp阴性细胞。分析cas9(蛋白质印迹，抗flag)和豆蔻酰化cas9(点击化学反应，然后通过链霉亲和素-hdp检测)的表达。图16a示出了t7核酸内切酶分析。gfp基因的pam位点侧翼是从gfp阴性细胞进行pcr扩增的。pcr产物用t7核酸内切酶消化，得到预期的256bp和170bp片段。图16e示出了表达cas9/sgrna-scrambled(阴性对照)、cas9/sgrna-gfp(阳性对照)、mcas9/sgrna-gfp和mcas9(g2a)/sgrna-gfp的293t-gfp细胞。通过facs分选gfp阴性细胞。使用连续超速离心分离来自gfp阴性细胞的ev。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物(前4个泳道)和ev裂解物(后4个泳道)中cas9、钙联接蛋白、cd9、gapdh和gfp的表达水平。图16f示出了总rna也分离自ev。对sgrna进行pcr扩增和sanger测序。证实了靶向gfp基因的sgrna序列。
[0030]
图17a至17e示出了豆蔻酰化促进cas9蛋白封装到ev中。图17a示出了从表达mcas9/sgrna-荧光素酶的产生ev的细胞产生ev的实验方法的示意图。通过慢病毒感染转导荧光素酶基因，构建稳定表达荧光素酶(3t3-luc)的3t3细胞系。3t3-luc细胞通过慢病毒感染转导cas9、mcas9或mcas9(g2a)/grna-luc。根据cas9的表达水平和荧光素酶活性的降低选择并扩增单细胞克隆。从表达cas9、mcas9或mcas9(g2a)/grna-luc的产生ev的细胞的条件培养基分离出ev。图17b示出了在表达cas9、mcas9或mcas9(g2a)/grna-luc的分离的产生ev的细胞中测量荧光素酶活性。萤光素酶活性报告为相对于细胞裂解物的蛋白质浓度归一化的相对光单位。图17c示出了八肽的融合促进了表达mcas9/grna-luc的产生ev的细胞中的cas9豆蔻酰化，但不促进表达cas9或mcas9(g2a)/grna-luc的那些细胞中的cas9豆蔻酰化。将产生ev的细胞用60μm豆蔻酸-叠氮化物培养24小时。通过免疫印迹检测cas9、gapdh和豆蔻酰化cas9的表达水平。值得注意的是，使用靶向豆蔻酰化八肽的抗体检测豆蔻酰化cas9。图17d示出了cas9的豆蔻酰化维持其基因组编辑功能。从产生ev的细胞中分离处基因组dna。对基因组编辑位点侧翼区的dna进行pcr扩增。使用上述基因组dna和萤光素酶-t7引物获得357bp的pcr产物，并通过t7核酸内切酶i消化，得到了208bp和149bp的两条切割条带。图17d示出了cas9蛋白被封装在表达mcas9/sgrna-luc的产生ev的细胞中。从表达cas9、mcas9或mcas9(g2a)/grna-luc的产生ev的细胞中分离出ev。通过免疫印迹测量在产生ev的细胞和ev裂解物中cd9、荧光素酶、gapdh和cd81的表达水平。
[0031]
图18a示出了cas9/sgrna在表达cas9/sgrna的产生ev的细胞中整合的验证。通过慢病毒感染用cas9/sgrna-luc、mcas9/sgrna-luc和mcas9(g2a)/sgrna-luc转导表达荧光素酶的3t3细胞。为了检测cas9/sgrna在基因组水平上的整合，分离出基因组dna并用于pcr模板。另外，覆盖u6启动子和cas9基因的引物(u6-cas9)用于pcr扩增。在表达cas9/sgrna-luc、mcas9/sgrna-luc和mcas9(g2a)/sgrna-luc的产生ev的细胞中验证了cas9/sgrna的整合，但在对照细胞中未得到验证。图18b示出了检测豆蔻酰化表位的抗体的验证。使用豆蔻酰化的八肽，即豆蔻酰基-gsnkskpkc的抗原开发抗体。为了验证抗体的特异性，通过慢病毒感染用src(wt)或src(g2a)转导syf1(src-/-yes-/-fyn-/-)细胞。对来自syf1细胞或上述转导细胞的细胞裂解物进行免疫印迹。通过免疫印迹分析src、gapdh和豆蔻酰化src的表达水平。靶向衍生自src激酶前导序列的豆蔻酰基-八肽的抗体特异性检测到src(wt)，但未检测到src(g2a)，src(g2a)是具有豆蔻酰化位点缺失的突变体。
具体实施方式
[0032]
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。
[0033]
在提供数值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确指示，否则在该范围的上限与下限之间的每一中间值到下限单位的十分之一以及该所陈述范围中的任何其它所陈述或中间值涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本公开内，受限于所陈述范围内的任何明确排除的限制。当所陈述范围包括一个或两个界限时，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
[0034]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但现在描述优选的方法和材料。
[0035]
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利明确地和单独地指明通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开由于在先公开而无权先于此类出版物。此外，所提供的出版日期可以不同于可能需要独立确认的实际出版日期。
[0036]
本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见，本文描述和绘示的各个实施例中的每一个具有独立的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其它若干实施例中的任一个的特征分离或组合，而不脱离本公开内容的范围或精神。任何列举的方法可以以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来执行。
[0037]
除非另有说明，本公开的实施例将采用化学、生物学等技术，这些技术在本领域的技术范围内。
[0038]
提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何实施本文公开和要求保护的方法和使用探针的完整公开和描述。已经努力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，温度为℃，且压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
[0039]
在详细描述本公开的实施例之前，应当理解，除非另有说明，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造方法等，因为其可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施例的目的，而不旨在限制。在本公开中，步骤也可以以逻辑上可能的不同顺序来执行。
[0040]
必须注意的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
[0041]
cas9融合蛋白
[0042]
本文公开了一种用于基因编辑的融合蛋白，其包含cas9结构域，该cas9结构域被配置成封装在ev中并定位至受体细胞的细胞核。融合应具备以下标准：1)其应封装到ev中；以及2)其应被摄入至受体细胞中，并定位于细胞核进行基因组编辑。因此，融合蛋白可以含有豆蔻酰化结构域并具有正电荷，这允许将蛋白封装在ev中。如本文所公开的，肽的棕榈酰化可以显著抑制封装和/或细胞核定位。因此，在一些实施例中，所公开的融合蛋白含有豆
h.g.，najar f.z.，ren q.，zhu h.，song l.，white j.，yuan x.，clifton s.w.，roe b.a.，mclaughlin r.e.，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》98:4658-4663(2001)；《由反式编码的小rna和宿主因子rnase iii实现crispr rna成熟(crispr rna maturation by trans-encoded small rna and host factor rnase iii)》。deltcheva e.，chylinski k.，sharma c.m.，gonzales k.，chao y.，pirzada z.a.，eckert m.r.，vogel j.，charpentier e.，《自然杂志(nature)》471：602－607(2011)；以及《适应性细菌免疫中的可编程双rna引导的dna核酸内切酶(a programmable dual-rna-guided dna endonuclease in adaptive bacterial immunity)》。jinek m.，chylinski k.，fonfara i.，hauer m.，doudna j.a.，charpentier e.的《科学杂志(science)》337：816－821(2012)，其每一个的全部内容通过引用并入本文)。cas9直向同源物已经在各种物种中描述，包括但不限于酿脓链球菌(s.pyogenes)和嗜热链球菌(s.thermophilus)。基于本公开内容，其它合适的cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是显而易见的，并且此类cas9核酸酶和序列包括来自chylinski，rhun和charpentier的《ii型crispr-cas免疫系统的tracrrna和cas9家族(the tracrrna and cas9 families of type ii crispr-cas immunity systems)》(2013)《rna生物学(rna biology)》10：5，726－737(其全部内容通过引用并入本文)中公开的生物体和位点的cas9序列。在一些实施例中，cas9核酸酶具有灭活的(例如，失活的)dna切割结构域。
[0050]
在一些实施例中，cas9结构域包含来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的野生型cas9(ncbi参考序列：nc_017053.1)。因此，在一些实施例中，cas9结构域包含以下氨基酸序列：mdkkysigldigtnsvgwavitddykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfgsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkkladstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqiynqlfeenpinasrvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekrnglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnseitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgayhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedrgmieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqghslheqianlagspaikkgilqtvkivdelvkvmghkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsfikddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(序列号：4)。
[0051]
在一些实施例中，cas9结构域包含以下氨基酸序列：mdkkysiglaigtnsvgwavitde
ykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(序列号：5)。
[0052]
在一些实施例中，cas9结构域包含来自溃疡棒杆菌(corynebacterium ulcerans)的野生型cas9(ncbi参考文献：nc_015683.1，nc_017317.1)；白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheria)(ncbi参考文献：nc_016782.1，nc_016786.1)；食蚜螺菌(spiroplasma syrphidicola)(ncbi参考文献：nc_021284.1)；中间普雷沃氏菌(prevotella intermedia)(ncbi参考文献：nc_017861.1)；台湾螺原体(spiroplasma taiwanense)(ncbi参考文献：nc_021846.1)；海豚链球菌(streptococcus iniae)(ncbi参考文献：nc_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(belliella baltica)(ncbi参考文献：nc_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(psychroflexus torquisi)(ncbi参考文献：nc_018721.1)；嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)(ncbi参考文献：yp_820832.1)、无害利斯特菌(listeria innocua)(ncbi参考文献：np_472073.1)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)(ncbi参考文献：yp_002344900.1)或脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)(ncbi参考文献：yp_002342100.1)。
[0053]
在一些实施例中，cas9结构域是非核酸酶活性的。可以将点突变引入cas9以消除核酸酶活性，产生仍保留其以sgrna编程方式结合dna的能力的死cas9(dcas9)。原则上，当与另一种蛋白质或结构域融合时，dcas9可以简单地通过与合适的sgrna共表达而将该蛋白质靶向几乎任何dna序列。已知用于生成具有非活性dna切割结构域的cas9蛋白(或其片段)的方法(参见，例如，jinek等人，《科学杂志》337:816-821(2012)；qi等人，《重新利用crispr作为基因表达的序列特异性控制的rna引导平台(repurposing crispr as an rna-guided platform for sequence-specific control of gene expression)》(2013)《细胞(cell)》28；152(5):1173－83，其各自的全部内容通过引用并入本文)。例如，已知cas9的dna切割结构域包括两个亚结构域，hnh核酸酶亚结构域和ruvc1亚结构域。hnh亚结构域切割与grna互
补的链，而ruvc1亚结构域切割非互补链。这些亚结构域内的突变可以使cas9的核酸酶活性沉默。例如，突变d10a和h841a使酿脓链球菌cas9的核酸酶活性完全失活(jinek等人，《科学》337:816-821(2012)；qi等人，《细胞》28；152(5):1173-83(2013)。
[0054]
例如，在一些实施例中，cas9结构域包含以下氨基酸序列：mdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdaivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(具有d10a和h840a的dcas9，序列号：6)。
[0055]
在一些实施例中，cas9结构域由以下核酸序列编码：
[0056]
atgggcagcaacaagagcaagcccaaggataagaaatactcaataggactggatattggcacaaatagcgtcggatgggctgtgatcactgatgaatataaggttccttctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttctgtttgacagtggagagacagccgaagctactagactcaaacggacagctaggagaaggtatacaagacggaagaataggatttgttatctccaggagattttttcaaatgagatggccaaagtggatgatagtttctttcatagacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaaagacatcctatttttggaaatatagtggatgaagttgcttatcacgagaaatatccaactatctatcatctgagaaaaaaattggtggattctactgataaagccgatttgcgcctgatctatttggccctggcccacatgattaagtttagaggtcattttttgattgagggcgatctgaatcctgataatagtgatgtggacaaactgtttatccagttggtgcaaacctacaatcaactgtttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtggatgctaaagccattctttctgcaagattgagtaaatcaagaagactggaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcctgtttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaactccagctttcaaaagatacttacgatgatgatctggataatctgttggctcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatctgtcagatgctattctgctttcagacatcctgagagtgaatactgaaataactaaggctcccctgtcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttctgaaagccctggttagacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatggcggcgcaagccaag
aagaattttataaatttatcaaaccaattctggaaaaaatggatggtactgaggaactgttggtgaaactgaatagagaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttctgaaagacaatagagagaagattgaaaaaatcttgacttttaggattccttattatgttggtccattggccagaggcaatagtaggtttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtgctgccaaaacatagtttgctttatgagtattttaccgtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgagaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatctgctcttcaaaacaaataggaaagtgaccgttaagcaactgaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcactgggtacataccatgatttgctgaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagacatcctggaggatattgttctgacattgaccctgtttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatacgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaaagacgcagatatactggttggggaaggttgtccagaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatactggattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctcatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacatccaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtctgcatgaacatattgcaaatctggctggtagccctgctattaaaaaaggtattctccagactgtgaaagttgttgatgaattggtcaaagtgatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcaagagaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattccagagagaggatgaaaagaatcgaagaaggtatcaaagaactgggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagatatgtatgtggaccaagaactggatattaataggctgagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcctgaccaggtctgataaaaatagaggtaaatccgataacgttccaagtgaagaagtggtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctgaacgccaagctgatcactcaaaggaagtttgataatctgaccaaagctgaaagaggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattagagaggttaaagtgattaccctgaaatctaaactggtttctgacttcagaaaagatttccaattctataaagtgagagagattaacaattaccatcatgcccatgatgcctatctgaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaaagcgagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttaggaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaagtatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctgatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggagagattttgccacagtgcgcaaagtgttgtccatgccccaagtcaatatcgtcaagaaaacagaagtgcagacaggcggattctctaaggagtcaattctgccaaaaagaaattccgacaagctgattgctaggaaaaaagactgggacccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaaccgtggcttattcagtcctggtggttgctaaggtggaaaaagggaaatccaagaagctgaaatccgttaaagagctgctggggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatcccattgactttctggaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacctgatcattaaactgcctaaatatagtctttttgagctggaaaacggtaggaaacggatgctggctagtgccggagaactgcaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttctgtatctggctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatctggatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagagagttattctggcagatgccaatctggataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaataagagaacaagcagaaaatatcattcatctgtttaccttgaccaatcttggagcacccgctgcttttaaatactttgatacaacaattgataggaaaagatatacctctacaaaagaagttctggatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaa
cacgcattgatttgagtcagctgggaggtgac(序列号：345)。
[0057]
在一些实施例中，cas9结构域为cas9变体。例如，cas9变体与野生型cas9至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约96％相同，至少约97％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施例中，cas9变体包含cas9的片段(例如，grna结合结构域或dna切割结构域)，使得片段与cas9的对应片段至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约96％相同，至少约97％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同或至少约99.9％。
[0058]
核定位信号(nls)
[0059]
在一些实施例中，nls序列部分或全部包含一个或双重sv40nls序列(pkkkrkv，序列号：342)的氨基酸序列。在一些实施例中，nls序列部分或全部包含氨基酸序列核质蛋白(avkrpaatkkagqakkkkld，序列号：343)、egl-13(msrrrkanptklsenakklakeven，序列号：344)、c-myc(paakrvkld，序列号：345)或tus-蛋白(klkikrpvk，序列号：346)。在一些实施例中，nls序列由核酸序列cccaagaaaaaacgcaaggtg(序列号：347)、cctaagaaaaagcggaaagtg(序列号：348)或其组合编码。
[0060]
可以存在其它特征，例如，nls与融合蛋白其余部分之间和/或核酸编辑酶或结构域与cas9之间的一个或多个接头序列。可能存在的其它示范性特征是定位序列，如胞质定位序列，输出序列，如核输出序列或其它定位序列，以及可用于溶解、纯化或检测融合蛋白的序列标签。本文提供了合适的定位信号序列和蛋白质标签序列，并且包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(bccp)标签、myc标签、钙调蛋白标签、flag标签、血细胞凝集素(ha)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或his标签)、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、nus标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签、绿色荧光蛋白(gfp)标签、硫氧还蛋白标签、s标签、sof标签(例如，softag 1、softag 3)、strep标签、生物素连接酶标签、flash标签、v5标签和sbp标签。其它合适的序列对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，在一些实施例中，myc标签由核酸序列gagcagaaactcatctcagaagaggatctg(序列号：349)编码。例如，在一些实施例中，flag标签由核酸序列gattacaaggatgacgacgataag(序列号：350)编码。
[0061]
在一些实施例中，编码所公开的融合蛋白的多核苷酸包含以下核酸序列：
[0062]
gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttga
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[0063]
细胞外囊泡
[0064]
本文公开了一种包含封装本文公开的cas9融合蛋白和向导rna的细胞外囊泡(ev)的基因编辑组合物。示范性的细胞外囊泡可以包括但不限于外泌体。然而，术语“细胞外囊泡”应解释为包括由细胞分泌的所有纳米级脂质囊泡，如由溶酶体形成的分泌囊泡。
[0065]
ev是具有闭合双层膜结构的细胞衍生的囊泡。根据它们的大小和密度，ev主要包括外泌体(30至150nm)、微囊泡(mv)(100至1000nm)和凋亡小体或癌症相关肿瘤小体(1至10μm)。ev能够在其表面上以及在其腔内携带各种分子，如蛋白质、脂质和rna。ev和外体表面蛋白可以介导循环ev的器官特异性归巢。
[0066]
ev由许多不同类型的细胞产生，包括免疫细胞，如b淋巴细胞、t淋巴细胞、树突细胞(dc)和大多数细胞。ev还例如由神经胶质瘤细胞、血小板、网织红细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞产生。用于所公开的组合物和方法中的ev可来源于任何合适的细胞，包括上文所鉴定的细胞。ev也已从生理性液体中分离出，如血浆、尿液、羊水和恶性渗出液。适合大量生产的产生ev的细胞的非限制性实例包括树突细胞(例如，未成熟的树突细胞)、人胚肾293(hek)细胞、293t细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞和人类esc衍生的间充质干细胞。
[0067]
ev也可以从任何自体的患者来源的、异源的单倍型匹配的或异源的干细胞获得，以减少或避免在被递送ev的患者中生成免疫应答。任何产生ev的细胞可用于此目的。
[0068]
由细胞产生的ev可通过任何合适的方法从培养基中收集。通常可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备ev的制剂。例如，ev可以通过差速离心制备，即低速(《20000g)离心以沉淀较大颗粒，然后高速(》100000g)离心以沉淀ev，用适当过滤器(例如，0.22μιη过滤器)、梯度超速离心(例如，用蔗糖梯度)或这些方法的组合进行粒度过滤。
[0069]
在一个实施例中，通过培养表达融合蛋白的细胞并随后从培养基中分离间接修饰的ev来获得包含所公开的融合蛋白的ev。
[0070]
所公开的ev可以通过任何合适的方式给药于受试者。对人或动物受试者的给药可以选自肠胃外、肌内、脑内、血管内、皮下或经皮给药。通常，递送方法是通过注射。优选地，注射是肌内或血管内(例如，静脉内)。医师将能够确定每个特定患者所需的给药途径。
[0071]
ev优选地作为组合物递送。组合物可以被配制用于肠胃外、肌内、脑内、血管内(包括静脉内)、皮下或经皮给药。用于肠胃外给药的组合物可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。ev可以配制成药物组合物，其除ev外还可以包括药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和其它药学上可接受的载体或赋形剂
等。
[0072]
ev可以在药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中以单位剂型给药。可以采用传统的药物实践来提供合适的制剂或组合物，以将化合物给药于患有疾病(例如，癌症)的患者。给药可以在患者出现症状之前开始。可以采用任何合适的给药途径，例如给药可以是肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、瘤内、肌内、颅内、眶内、眼内、心室内、肝内、囊内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、栓剂或口服给药。例如，治疗制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服给药，制剂可以是片剂或胶囊的形式；以及对于鼻内制剂，可以是粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式。
[0073]
所公开的细胞外囊泡还可以包含试剂，如治疗剂，其中细胞外囊泡将试剂递送至靶细胞。细胞外囊泡包含的试剂可以包括但不限于治疗性药物(例如，小分子药物)、治疗性蛋白质和治疗性核酸(例如，治疗性rna)。在一些实施例中，所公开的细胞外囊泡包含治疗性rna作为所谓的“货物rna”。例如，在一些实施例中，融合蛋白还可以包含rna结构域(例如，在融合蛋白的胞质c-末端)，其结合货物rna中存在的一个或多个rna基序，以便在细胞外囊泡从细胞分泌之前将货物rna封装到细胞外囊泡中。因此，融合蛋白可以同时作为“靶向蛋白”和“包装蛋白”。在一些实施例中，包装蛋白可称为细胞外囊泡负载蛋白或“ev负载蛋白”。(参见hang和leonard，《主动负载货物rna以阐明ev介导递送中的限制步骤的平台(a platform for actively loading cargo rna to elucidate limiting steps in ev-mediated delivery)》，《细胞外囊泡杂志(j.extracellular vesicles)》，2016，5：31027，2016年5月13日公开，其内容通过引用整体并入本文。)
[0074]
dna编辑方法
[0075]
本文公开了用本文公开的基因编辑组合物编辑细胞中的dna的方法。在一些实施例中，本文提供的任何方法可以在细胞(例如细菌、酵母细胞或哺乳动物细胞)中对dna进行。在一些实施例中，本文提供的任何cas9蛋白质接触的dna是在真核细胞中。在一些实施例中，方法可以在体外或离体在细胞或组织上进行。在一些实施例中，真核细胞在个体中，如患者或研究动物。在一些实施例中，个体是人体。
[0076]
多核苷酸、载体、细胞、试剂盒
[0077]
本文还公开了编码本文所述的一种或多种蛋白质和/或grna的多核苷酸。例如，提供了编码本文所述的任何蛋白质的多核苷酸，例如用于重组表达和纯化。在一些实施例中，分离的多核苷酸包含单独编码grna的一个或多个序列或与编码本文所述的任何蛋白质的序列组合。
[0078]
在一些实施例中，提供了编码本文所述的任何蛋白的载体，例如用于cas9蛋白和/或包含cas9融合蛋白的融合物的重组表达和纯化。在一些实施例中，载体包含或被改造以包括分离的多核苷酸，例如本文所述的那些。在一些实施例中，载体包含编码如本文所述的cas9融合蛋白(如本文所述)、grna或其组合的一个或多个序列。通常，载体包含与启动子可操作连接的编码融合蛋白的序列，使得融合蛋白在宿主细胞中表达。
[0079]
在一些实施例中，提供了例如用于重组表达和将所公开的cas9融合蛋白和grna封装到细胞外囊泡(ev)中的细胞。细胞包括适合于重组蛋白表达的任何细胞，例如，包含表达或能够表达本文公开的融合蛋白的遗传构建体的细胞(例如，已经用本文描述的一种或多种载体转化的细胞，或具有基因组修饰的细胞，例如，从已经掺入细胞基因组中的等位基因
表达本文提供的蛋白的那些细胞)。用于转化细胞、遗传修饰细胞和在此类细胞中表达基因和蛋白质的方法是本领域熟知的，并且包括由例如green和sambrook在《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》(第4版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，(2012))以及friedman和rossi在《基因转移：dna和rna的递送和表达，实验室手册(gene transfer:delivery and expression of dna and rna,a laboratory manual)》(第1版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社，(2006)中提供的那些。
[0080]
本公开的一些方面提供了包含编码本文提供的cas9融合蛋白的多核苷酸的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含用于重组蛋白表达的载体，其中载体包含编码本文提供的任何蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，试剂盒包含细胞(例如，适于表达cas9融合蛋白的任何细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞)，该细胞包含用于表达本文提供的任何蛋白质的遗传构建体。在一些实施例中，本文提供的任何试剂盒还包含一种或多种grna和/或用于表达一种或多种grna的载体。在一些实施例中，试剂盒包含赋形剂和用于使核酸酶和/或重组酶与赋形剂接触以生成组合物的说明书，该组合物适于使核酸与核酸酶和/或重组酶接触以发生与靶核酸的杂交和切割和/或重组。在一些实施例中，组合物适于将cas9蛋白递送至细胞。在一些实施例中，组合物适于向受试者递送cas9蛋白。在一些实施例中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
[0081]
已经描述了本发明的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范围内。
[0082]
实例
[0083]
实例1：脂肪酰化调节src家族激酶封装到细胞外囊泡中。
[0084]
蛋白质n-豆蔻酰化是一种共翻译/翻译后修饰，其导致豆蔻酰基(14－碳饱和脂肪酰基)共价连接到靶蛋白质的n-末端(wright mh,et al.j chem biol.20103:19-35)。在n-末端的met-gly-x-x-x-ser/thr(序列号：3)的共有序列对于n-豆蔻酰化过程是必需的。豆蔻酰化修饰发生在蛋白质翻译期间第一个甲硫氨酸被甲硫氨酸氨肽酶去除后，gly2是豆蔻酰基的附着位点(udenwobele di,et al.20178:751)。已经报道了一组蛋白质在哺乳动物细胞中被豆蔻酰化(resh md.biochimica et biophysica acta.19991451:1-16)。豆蔻酰化允许这些蛋白质参与多种分子功能，如细胞定位、细胞信号传导和细胞间通讯(kim s,et al.j biol chem.2017；casey pj.science.1995268:221)。这些活性随后可以调节癌细胞的增殖、肿瘤进展、免疫应答和其它生物学功能(udenwobele di,et al.20178:751；kim s,et al.cancer res.201777:6950-62)。靶向蛋白豆蔻酰化是治疗癌症进展的潜在治疗方法(kim s,et al.cancer res.201777:6950-62；li q,et al.j biol chem.2018293:6434-48；sulejmani e,et al.oncoscience.20185:3-5)。
[0085]
src家族激酶(sfk)是一组非受体酪氨酸激酶，属于已鉴定的豆蔻酰化蛋白质(martin gs.nat rev mol cell biol.20012:467-75)。所有sfk成员由n-末端src同源(sh)4结构域组成，通过豆蔻酰化控制膜结合并且，取决于sfk，通过棕榈酰化控制膜结合。例如，src和fyn激酶都是n-豆蔻酰化的，但fyn激酶在n-末端位点3和6的半胱氨酸残基处也是棕榈酰化的(resh md.biochimica et biophysica acta.1999 1451:1-16；cai h,et al.proc natl acad sci u s a.2011108:6579-84；resh md.cell.199476:411-3)。sfk含
有sh3、sh2，酪氨酸激酶sh1结构域和短的c-末端尾，c-末端尾含有自身抑制磷酸化位点，如人类src激酶中的tyr529(xu w,et al.nature.1997385:595；sicheri f,et al.curr opin cell biol.19977:777-85)。src激酶的表达和活性在包括侵袭性前列腺癌在内的各种癌症中高度上调(guo z,et al.cancer cell.200610:309-19；drake jm,et al.proc natl acad sci u s a.2013110:e4762-9)，这与预期寿命短和远处转移的高可能性相关(fizazi k.ann oncol.200718:1765-73；erpel t,et al.curr opin cell biol.19957:176-82；parsons jt,et al.curr opin cell biol.19979:187-92；tatarov o,et al.clin cancer res.200915:3540-9；irby rb,et al.oncogene.200019:5636)。sfk的豆蔻酰化和/或棕榈酰化的不同模式决定了它们的细胞定位(kim s,et al.j biol chem.2017；patwardhan p,et al.mol cell biol.201030:4094-107)、src激酶与雄激素受体的相互作用(kim s,et al.cancer res.201777:6950-62)、细胞内运输(sato i,et al.j cell sci.2009122:965-75)，以及随后它们的激酶活性和转化潜力(kim s,et al.j biol chem.2017；cai h,et al.proc natl acad sci u s a.2011108:6579-84；patwardhan p,et al.mol cell biol.201030:4094-107；oneyama c,et al.200830:426-36；oneyama c,et al.mol cell biol.200929:6462-72)。高脂肪饮食中的外源性豆蔻酸酯可以通过豆蔻酰化调节细胞膜上的src激酶水平，并加速src介导的致癌潜力和肿瘤发生(kim s,et al.j biol chem.2017；kim s,et al.cancer res.201777:6950-62)。
[0086]
细胞外囊泡(ev)是从几乎所有细胞类型分泌的直径为30至150nm的纳米囊泡(kowal j,et al.curr opin cell biol.201429:116-25)。ev通过脂质、蛋白质、mrna、microrna和其它外泌体内容物的转移介导细胞间通讯(villarroya-beltri c,et al.sem cell biol.201428:3-13；simons m,et al.curr opin cell biol.200921:575-81)。ev介导的细胞相互作用可以促进疾病的传播、促进肿瘤进展和转移，并逃避免疫系统(hoshino a,et al.nature.2015527:329-35；kahlert c,et al.j mol med.201391:431-7；skog j,et al.nat cell biol.200810:1470-6；abusamra aj,et al.blood cells mol dis.200535:169-73)。ev通过源自多泡体与质膜融合的细胞胞吐作用生成(thery c,et al.nat rev immunol.20022:569-79；colombo m,et al.annu rev cell dev biol.201430:255-89；keller s,et al.immunol lett.2006107:102-8)。在此，我们研究了脂肪酰化如何调节蛋白质封装到ev中。如本文所公开的，sfk成员封装到ev中受豆蔻酰化、棕榈酰化和src激酶活性调节，并且封装过程涉及syntenin-escrt介导的生物发生途径。
[0087]
材料和方法
[0088]
质粒
[0089]
如前所述，将表达src(wt)、src(g2a)、src(y529f)、src(y529f/g2a)、src(s3c/s6c)、fyn(wt)、fyn(g2a)或fyn(c3s/c6s)的慢病毒载体克隆到fucrw亲本慢病毒载体中(kim s,et al.j biol chem.2017；cai h,et al.proc natl acad sci u s a.2011108:6579-84)。在先前的研究中产生了通过shrna实现了src激酶的敲除(kim s,et al.cancer res.201777:6950-62)。两种表达shrna-tsg101的慢病毒载体获自西格玛奥德里奇(sigma aldrich)。shrna-tsg101-1的序列为5'-ccggactggacacatacccatataac tcgagttatatgggtatgtgtccagttttttg-3'(序列号：7)，并且shrna-tsg101-2的序列为5'-ccgggccttatagaggtaatacatac tcgagtatgtattacctctataaggcttttg-3'(序列号：8)。从这
些慢病毒载体生成慢病毒以产生稳定的细胞系。慢病毒生产遵循乔治亚大学(university of georgia)的指导方针。
[0090]
细胞系
[0091]
syf1(src-/-fyn-/-yes-/-)、3t3和包括du145、pc3、22rv1和lncap的人前列腺癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。细胞在atcc推荐的培养基中生长。定期检查支原体污染。细胞最多使用20代。
[0092]
ev的分离和表征
[0093]
为了从细胞培养基中分离ev，细胞系在atcc推荐的培养基中在150mm培养皿中生长。达到90％汇合后，将培养基替换为含有5％无外泌体的fbs(生命科技公司(life technology inc.))的新鲜培养基，并在5％的co2在37℃培养箱中再生长24小时。收集条件培养基进行ev分离。具体而言，将条件培养基在4℃以300
×
g重复离心10分钟，以2,000
×
g重复离心10分钟，以10,000
×
g重复离心30分钟，以分别去除活细胞、死细胞和细胞碎片。将上清液进一步在4℃下以100,000
×
g超速离心90分钟。将ev沉淀重悬于1x pbs中以洗出残余培养基，并在4℃下以100,000
×
g再离心90分钟。将沉淀的ev再悬浮于ripa缓冲液中进行蛋白质分析或1x pbs中进行动态光散射(dls)分析。用zetaview软件通过纳米粒子跟踪分析(nta，particle metrix，德国)测量ev的大小、ζ电位和浓度以用于数据记录和分析。
[0094]
蛋白质浓度测定
[0095]
ev和细胞裂解物的蛋白质浓度通过洗涤剂相容性(dc)蛋白质测定(美国伯乐实验室)进行测定。将总细胞裂解物(tcl)和ev溶解于ripa缓冲液[50mm tris-base(ph 7.4)，1％的np-40，0.50％脱氧胆酸钠，0.1％的sds，150mm的nacl，2mm的edta和蛋白酶抑制剂(1x)]中并且遵循制造商的方案。
[0096]
抗体结合和蛋白质印迹分析
[0097]
对溶解于ripa缓冲液中的总细胞裂解物和ev进行标准免疫印迹分析。使用以下抗体：兔抗src(目录号：2109)、兔抗钙联接蛋白(目录号：2679)、兔抗cd-9(目录号：13403适用于人类，目录号：2118适用于小鼠类)、兔抗gapdh(目录号：13403)、兔抗－fyn(目录号：4023)、兔抗fak(目录号：13009)、兔cd81(目录号：10037)购自cell signaling technology；兔抗rfp(目录号：600－401－379，rockland inc)、兔抗ar(目录号：sc－816，圣克鲁兹生物技术(santa cruz biotechnology))，和二级抗体抗兔igg hrp(目录号：7074，cell signaling technology)根据制造厂推荐的稀释度使用。通过image j软件对条带强度进行量化。
[0098]
点击化学法测定豆蔻酰化src激酶
[0099]
使表达src激酶的细胞在具有5％的fbs的emem培养基中生长直至90％汇合。将培养基替换为含有无外泌体的fbs和50μm豆蔻酸－叠氮化物(豆蔻酸的类似物)的emem培养基，并使细胞再生长24小时。收集条件培养基并用于如上所述的ev分离。细胞或ev在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的m-per缓冲液(赛默科技(thermo scientific))中裂解。将细胞裂解物或ev裂解物(10μg蛋白质)添加到含有生物素-炔(0.1mm)、cuso4(1mm)、tcep(1mm)和tbta(0.1mm)的工作溶液中，并在室温下孵育1小时。点击反应后，将样品与负载染料混合并在95℃下煮沸5分钟。将裂解物进行sds-page并转移到硝酸纤维素膜上。用5％牛奶封闭过夜后，将膜与高灵敏度链霉亲和素-hrp(目录号21130，赛默飞世尔科技公司
scientific))上。石蜡包埋切片如下处理：100％二甲苯脱石蜡5分钟(3x)，100％乙醇再水合2分钟(2x)，95％乙醇2分钟(2x)，75％乙醇2分钟(2x)，然后用蒸馏水彻底冲洗(3x)。将切片在ehrlich苏木精中染色5分钟并用蒸馏水(3x)洗涤，然后在酸性醇(0.3％)中快速浸渍5至6次以进行区分并用蒸馏水(3x)充分洗涤。将组织切片浸入scott's tap solution中2分钟，用蒸馏水(3x)充分冲洗，然后在伊红溶液中复染2分钟，用蒸馏水(3x)洗涤，然后在95％乙醇中脱水5次(2x)，在100％乙醇中脱水5次(2x)。在二甲苯清洗1分钟(3x)后，用盖玻片将组织切片封固在载体介质中。
[0112]
免疫组织化学(ihc)染色
[0113]
将显微镜载玻片上的4μm厚的组织切片在65℃下烘烤60分钟，并在100％二甲苯中脱石蜡5分钟(2x)，在100％乙醇中脱水5分钟(2x)，95％乙醇中脱水5分钟(2x)，70％乙醇中脱水5分钟。在用pbs洗涤10分钟(3x)后，组织载玻片在蒸锅中在0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)中以60％功率和10％功率微波煮15分钟。冷却后，用pbs洗涤组织载玻片10分钟(2x)。用pap pen液体封闭剂(部件编号6505，newcomer supply)环绕组织。将300μl的0.3％h2o2的蒸馏水溶液添加到每个组织点5至10分钟，然后用pbs洗涤10分钟(3x)。将组织在pbs中的2.5％山羊血清中在室温下封闭1小时，然后在pbst中与初级src抗体(1：250)在4℃下孵育过夜。用pbst洗涤组织载玻片10分钟(3x)，然后与第二抗体(目录号：m7401)在pbst中在室温下孵育1小时。在用pbs洗涤10分钟(x3)后，将组织载玻片与dab溶液(目录号sk-4100)一起孵育用于显影。一旦在显微镜下出现棕色，通过将载玻片浸入蒸馏水中终止反应。对照和处理的显影时间保持相同。将组织载玻片在苏木精中染色1分钟并用蒸馏水洗涤(x3)，然后浸入nahco3溶液中3分钟并用蒸馏水洗涤(x3)。通过在一系列醇溶液(75％，95％，100％乙醇，5分钟
×
2)中处理样品再次使组织载玻片脱水，然后风干10分钟。用二甲苯处理5分钟(x2)后，将组织切片风干10分钟，并用载体介质和盖玻片封固。
[0114]
通过点击化学法检测棕榈酰化
[0115]
使表达src激酶的细胞在含有5％的pbs的emem培养基中生长直至90％汇合。将培养基替换为含有无外泌体的fbs和50μm豆蔻酸－叠氮化物(豆蔻酸的类似物)的emem培养基，并使细胞再生长24小时。收集条件培养基并用于通过超速离心法分离细胞外囊泡(ev)。细胞或ev在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的m-per缓冲液(赛默科技)中裂解。将细胞裂解物或ev裂解物(10μg蛋白质)添加到含有生物素-炔(0.1mm)、cuso4(1mm)、tcep(1mm)和tbta(0.1mm)的工作溶液中，并在室温下孵育1小时。点击反应后，将样品与负载染料混合并在95℃下煮沸5分钟。将裂解物进行sds-page并转移到硝酸纤维素膜上。用5％牛奶封闭过夜后，将膜与高灵敏度链霉亲和素-hrp(目录号21130，赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))在室温下孵育1小时。通过ecl检测豆蔻酰化蛋白(例如，豆蔻酰化src激酶)。
[0116]
结果
[0117]
豆蔻酰化蛋白质在细胞外囊泡中的出现频率升高。
[0118]
在甲硫氨酸氨肽酶去除甲硫氨酸后，蛋白质豆蔻酰化需要n-末端甘氨酸(gly2)。通过搜索哺乳动物基因组中符合必需的豆蔻酰化要求的蛋白质，鉴定了182种潜在的豆蔻酰化蛋白质(hun/vitz sn,et al.oncotarget.20167:86999；khoury ga,et al.sci rep.2011 1:90；consortium u.nucleic acids res.201645:d158-d69)。假设哺乳动物细胞中总共有约20,000种蛋白质，豆蔻酰化蛋白质的百分比占哺乳动物基因组的约0.9％(图
1a)。基于蛋白质组学研究(hun/vitz sn,et al.oncotarget.20167:86999)，细胞外囊泡(ev)中豆蔻酰化蛋白质的数量占60种癌细胞系的ev中总鉴定蛋白质的2.2％(图1a和表1-2)。在ev中检测到的豆蔻酰化蛋白质的出现频率为每个单独癌细胞系的ev中总蛋白的1.6至2.8％，其显著高于细胞中0.9％的豆蔻酰化蛋白质(图1b)。豆蔻酰化蛋白质在ev中的出现频率在三个正常组织中也升高。具体地，分别从胸腺中的ev的1853种蛋白、母乳中的1963种蛋白和尿液中的3280种蛋白中鉴定出48、41和59个豆蔻酰化蛋白，占ev中总鉴定蛋白的2.6％、2.1％和1.8％(图1a，表3-5)(wang z,et al.proteomics.201212:329-38；van hen/vijnen mj,et al.mol cell proteomics.2016 15:3412-23；skogberg g,et al.pios one.20138:e67554)。总之，数据表明豆蔻酰化蛋白质在体外和体内的ev中出现得更频繁。
[0119]
[0120]
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[0123]
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[0136][0137]
[0138]
[0139][0140]
在前列腺癌细胞的ev中检测和/或富集src激酶。
[0141]
已知src激酶是豆蔻酰化的(kim s,et al.cancer res.201777:6950-62；patwardhan p,et al.moi cell biol.201030:4094-107)。为了检查豆蔻酰化如何有助于将蛋白质封装到ev中，我们重点研究了四种前列腺癌细胞系(包括pc3、du145、lncap和22rv1细胞)的ev中的src激酶。来源于这些细胞系的ev的平均大小为约140nm，且大小分布显示无显著差异(图9a)。ev的ζ电位的范围为－30mv至－60mv(图9b)。与cd9相似并且不同于雄激素受体或钙联接蛋白，在来自所有测试的癌细胞系的ev中检测到src激酶表达(图
1c)。尽管基于相同量的负载蛋白质，在ev中src激酶的表达水平等同于在22rv1和lncap细胞中的总细胞裂解物中的表达水平，但与du145和pc3细胞中的总细胞裂解物相比，在ev中src激酶分别高3倍和1.7倍(图1c)。相应地，来自du145细胞的ev的数量显著高于来自其它细胞的ev的数量(图9c)。来自pc3和du145细胞的ev中src激酶富集的增加可能是由于更高的ev生物发生，这反映在这些癌细胞中ev的数量增加。总之，数据表明src激酶是一种豆蔻酰化蛋白质，封装在ev中，或富集在癌细胞的ev中。
[0142]
豆蔻酰化介导src激酶封装到ev中。
[0143]
为了检查豆蔻酰化在src激酶的封装中的作用，用野生型src[src(wt)]或src(g2a)(一种通过慢病毒感染导致豆蔻酰化缺失的突变体)转导四种细胞系，包括du145、nih 3t3、syf1和22rv1(图2a)。与表达src(wt)的那些细胞相比，在衍生自表达src(g2a)的所有测试细胞的ev中src激酶的水平显著降低(图2b和10)，表明豆蔻酰化在介导src激酶封装到ev中起着重要作用。
[0144]
为了进一步分析ev中的src蛋白是否被豆蔻酰化，将表达载体对照，src(wt)或src(g2a)细胞的du145细胞在含有豆蔻酸－叠氮化物(ma-叠氮化物，豆蔻酸的类似物)的培养基中培养。如所预期的，ev中的内源性src水平与总细胞裂解物中的水平相比有所增加(图2c，泳道1和4分别与泳道7和10相比)。在表达异位src激酶水平的du145细胞中，ev中的src激酶水平与总细胞裂解物中的src激酶水平相比明显升高(图2c，泳道3与泳道9相比；泳道6与泳道12相比)，但在表达src(g2a)突变体的细胞中没有(泳道2和5分别与泳道8和11相比)。如所预期的，src(g2a)突变体抑制了蛋白质的豆蔻酰化(图2c，泳道5对6，通过链霉亲和素-hrp检测)。相反，豆蔻酰化src的水平在表达异位src激酶水平的du145细胞的ev中显著富集(图2c，泳道12与泳道11或泳道10相比)。还检测到分子量低于60kd的蛋白质条带，这些蛋白质可能是通过抗-src抗体检测到的src家族激酶的其它成员或非豆蔻酰化src，因为在豆蔻酰化蛋白质中没有观察到条带(图2c)。数据表明优先封装在ev中的src激酶是豆蔻酰化的。
[0145]
src激酶活性的增加增强了其封装到ev中。
[0146]
src(y529f)是组成型活性src激酶突变体(图3a)。与ev中src激酶的富集[src(wt)对src(g2a)]相似，与表达src(y529f/g2a)的那些相比，表达src(y529f)的du145或syf1细胞的ev中src蛋白水平显著升高(图3b至3c)。另外，与表达src(wt)的细胞相比，表达src(y529f)的du145或syf1细胞中ev中src激酶水平与总细胞裂解物的比率升高(图3b至3c)。数据表明，src激酶活性的增加增强了其封装到ev中，然而豆蔻酰化的丧失减少了由组成性活性刺激的src优先封装到ev中。
[0147]
棕榈酰化抑制蛋白质封装到ev中。
[0148]
一些sfk成员，如fyn激酶，在n-末端同时发生豆蔻酰化和棕榈酰化(resh md.cell.199476:411-3；aicart-ramos c,et al.20111808:2981-94)。设定目标以研究棕榈酰化在调节蛋白质封装到ev中的作用。在src(s3c/s6c)突变体中获得棕榈酰化位点，或在fyn(c3s/c6s)突变体中丧失棕榈酰化位点是预先创建的(图4a)(cai h,et al.proc natl acad sci u s a.2011108:6579-84)。在表达对照载体、野生型fyn[fyn(wt)]或fyn(c3s/c6s)的syf1细胞中证实了fyn激酶的过表达和棕榈酰化的丧失(图11)。如所预期的，与表达异位src(wt)的du145细胞中的总细胞裂解物相比，ev中src激酶的水平升高。然而，
a.2011108:6579-84)。因此，一方面，抑制src封装到ev中的棕榈酰化可能是由于src激酶活性的降低，从而抑制如上文所述的syndecan-syntenin-escrt途径的活化。另一方面，有/无棕榈酰化的豆蔻酰化中的差异脂质化可能会显著改变sfk成员在细胞膜和细胞内运输途径中的定位(sato i,et al.j cell sci.2009122:965-75；sandilands e,et al.j cell sci.2007120:2555-64)。例如，棕榈酰化促进sfk成员定位于细胞膜的脂筏和细胞膜穴样内陷区(shenoy-scaria am,et al.j cell biol.1994126:353-64)。棕榈酰化的sfk成员(如fyn激酶)向细胞膜中的细胞膜穴样内陷浓缩结构域的偏离可能调节其封装到ev中。
[0160]
鉴于src激酶的表达水平或活性在许多癌症中通常失调的事实，包括前列腺癌(irby rb,et al.oncogene.200019:5636)和转移性去势抵抗性前列腺癌(drake jm,et al.proc natl acad sci u s a.2013110:e4762-9)，血浆ev中豆蔻酰化src的检测可能潜在地用作侵袭性肿瘤的早期生物标志物。尿液或血浆中ev的数量在癌症患者中通常较高，并且与高格里森评分和转移性前列腺癌患者相关(viaeminck-guillem v.front oncol.20188:222)。除ev的数量外，ev的成分(包括脂质、蛋白质、mrna、microrna、长非编码rna等)也被认为是潜在的生物标记物(skog j,et al.nat cell biol.200810:1470-6)。该研究证明，通过检测血浆ev中的src水平，豆蔻酰化蛋白质，特别是豆蔻酰化src激酶可能潜在地反映src驱动的异种移植肿瘤。这得到tramp小鼠的血浆ev中检测到src的证据的支持，tramp小鼠是src驱动的前列腺肿瘤进展模型(derita rm,et al.j cell biochem.2017118:66-73)。另外，有报道称在多发性骨髓瘤和免疫球蛋白轻链(al)淀粉样变性的ev中观察到c-src水平的增加(di noto g,et al.plos one.20138:e70811)。未来的研究应探讨前列腺癌患者血浆ev中的src或豆蔻酰化src水平是否反映肿瘤进展，这可能提供非侵入性监测侵袭性前列腺癌的生物标志物。
[0161]
实例2：通过蛋白质豆蔻酰化将crispr系统封装到细胞外囊泡中的基因工程cas9
[0162]
材料和方法
[0163]
质粒构建体：为了创建表达豆蔻酰化cas9(mcas9)的非慢病毒载体，将cas9-向导或cas9-scramble crispr载体(美国马里兰州罗克维尔市的傲锐基因公司(origene,rockville,md,usa))用作pcr模板。src(wt；8a.a)(正向引物)和mcas9引物(反向引物)(表6)用于获得pcr产物，其将src激酶n-末端前八个氨基酸序列的dna序列与cas9基因n-末端融合。获得的pcr产物和cas9/sgrna-向导或cas9/sgrna-scramble载体，并用bglii和bstz171进行消化。pcr产物与消化的亲本载体连接后，创建非病毒载体、mcas9/sgrna-向导和mcas9/sgrna-scramble。为了生成mcas9(g2a)载体，使用创建的mcas9载体作为dna模板和src(g2a；8a.a)(正向引物)和mcas9引物(反向引物)生成pcr产物。将获得的pcr产物克隆到bglii和bstz171位点。为了在双顺反子载体中生成靶向gfp基因的cas9/sgrna，设计并商业合成了三组sgrna引物(表6)。将退火的产物克隆到上述载体的bamhi和bsmbi位点之间。结果，创建了cas9/sgrna-gfp、mcas9/sgrna-gfp和mcas9(g2a)/sgrna-gfp。
[0164]
通过测序验证所有dna构建体。
[0165][0166][0167]
为了生成基于慢病毒的cas9/sgrna载体，使用flinkw慢病毒载体作为亲本载体。首先，用ecori和hpai酶消化flinkw。用ecori和pmei位点消化上述非慢病毒mcas9或cas9/sgrna载体，生成两个dna片段，一个片段为1kb(两端为ecor1)，另一个片段为4kb(5'端为ecor1，3'端为pme1)。然后将4kb的片段dna插入到消化的flinkw慢病毒载体中。测序证实后，将1kb的片段进一步插入上述载体。因此，将来自非病毒载体的含有mcas9/sgrna的5kb的dna片段克隆到flinkw慢病毒载体中。
[0168]
另外，将表达src(wt)、src(g2a)、src(y529f)和src(y529f/g2a)的慢病毒载体克隆到fucrw亲本慢病毒载体中。从这些慢病毒载体生成慢病毒以产生稳定的细胞系。
[0169]
细胞系：syf1(src-/-fyn-/-yes-/-)、3t3和包括du145、pc3、22rv1和lncap的人类前列腺癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。细胞在atcc推荐的培养基中生长。定期检查支原体污染。细胞最多使用20代。
[0170]
ev的分离和表征：为了从细胞培养基中分离ev，细胞系在atcc推荐的培养基中在150mm培养皿中生长。达到90％汇合后，将培养基替换为含有5％无外泌体的fbs(生命科技公司(life technology inc.))的新鲜培养基，并在5％的co2在37℃培养箱中再生长24小时。收集条件培养基进行ev分离。具体而言，将条件培养基在4℃以300
×
g重复离心10分钟，以2,000
×
g重复离心10分钟，以10,000
×
g重复离心30分钟，以分别去除活细胞、死细胞和细胞碎片。将上清液进一步在4℃下以100,000
×
g超速离心90分钟。将ev沉淀重悬于1x pbs
lys-pro-lys(序列号：367)的蛋白质，如src激酶或八肽融合的cas9，金斯瑞生物公司合成了豆蔻酰基-gly-ser-asn-lys-ser-lys-pro-lys(序列号：367)作为抗原，并注射到两只兔子(4857和4858)中以生成抗体。第三次免疫后，使用豆蔻酰化的八肽抗原纯化抗体。使用豆蔻酰化的八肽和非豆蔻酰化的八肽通过elisa测定测量反应性。
[0177]
统计分析：数据表示为平均值
±
sem(平均值的标准误差)。用graphpad prism软件中的事后图基检验通过单向anova分析两组以上的所有数据，并通过非配对学生t-检验比较两个值。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；ns：不显著。
[0178]
结果
[0179]
衍生自src激酶的八肽是n-豆蔻酰基转移酶1的有利底物。
[0180]
蛋白质豆蔻酰化由n-豆蔻酰基转移酶(nmt)催化(41)。nmt的两种哺乳动物同工酶nmt1和nmt2(77％同一性)催化这种豆蔻酰化过程。nmt1/2结合豆蔻酰基-coa并将豆蔻酰基基团转移至n-末端甘氨酸，同时释放coa(43)(图15a)。我们已经预先纯化并结晶了截短的nmt1蛋白(没有n-末端抑制结构域)并且已经鉴定了nmt1的豆蔻酰基-coa结合位点和肽结合位点。为了更好地表征nmt1功能，构建全长nmt1蛋白并鉴定豆蔻酰基-coa和肽结合位点；测定将氨基酸与不同长度的肽(从2至10个氨基酸肽)对接所需的最小能量。基于计算对接分析，7至8个氨基酸的肽具有较低的对接得分(图15b)。八肽表现出与nmt1的许多有利的相互作用。进一步检查衍生自豆蔻酰化蛋白质n-末端的25种代表性八肽(基于对接得分)以确定作为nmt1底物的可行性(表7)。命名为src8(wt)而不是src8(g2a)的衍生自src激酶的八肽是nmt1的最佳底物之一(图15c和表7)。总之，衍生自在n-末端中含有gly的src激酶的八肽是用作蛋白质豆蔻酰化的表位标签的候选物之一。
[0181]
26种八肽用作n-豆蔻酰基转移酶1的底物的可行性(表7)。使用nmt1活性测定(在材料和方法中描述)，对衍生自在n-末端具有甘氨酸的25种豆蔻酰化蛋白质的前导序列的八肽以及来自src激酶的八肽的突变(称为src(g2a))进行了检查，以确定它们作为nmt1底物的可行性。计算全长nmt1蛋白质催化的km和vmax。基于重新构建的全长nmt1蛋白质结构分析对接得分。计数是指通过质谱法在来自60种细胞系的癌细胞的ev中检测到特定蛋白质。
[0182][0183][0184]
八肽与cas9的n-末端融合维持了其基因组编辑功能，并促进了cas9蛋白封装到ev中。
[0185]
为此，将衍生自src激酶前导序列的有利的八肽鉴定为nmt1底物。为了将八肽融合到cas9的n-末端，分别生成表达cas9和sgrna(无靶)，或豆蔻酰化cas9或非豆蔻酰化cas9的双顺反子慢病毒载体，命名为mcas9或mcas9(g2a)，和靶向gfp基因的sgrna(图16a)。293t-gfp细胞通过慢病毒感染用cas9/sgrna-scramble、cas9/sgrna-gfp、mcas9/sgrna-gfp或mcas9(g2a)/sgrna-gfp转导。在用cas9/sgrna-scramble组处理的293t-gfp细胞中，其含有6.5％的非gfp细胞(可能是死细胞)。在表达cas9/sgrna-gfp、mcas9/sgrna-gfp、mcas9(g2a)/sgrna-gfp的293t-gfp细胞中分别检测到23.5％、15.8％和25.6％的非gfp细胞(图16b)。通过facs分选分离出非gfp稳定细胞系。尽管在表达cas9/sgrna-scramble、cas9/sgrna-gfp、mcas9/sgrna-gfp或mcas9(g2a)/sgrna-gfp的细胞系中检测到cas9表达，但仅在表达mcas9/sgrna-gfp的细胞中检测到豆蔻酰化的cas9(图16c)。在非gfp稳定细胞系(产生ev的细胞)中通过t7分析进一步证实gfp基因的基因组编辑(图16d)。进一步扩增产生ev
的细胞，并从这些细胞收集ev。仅ev衍生自表达mcas9的产生ev的细胞，而不是未修饰的cas9或表达cas9的mcas9(g2a)(图16e)。还提取了来自ev的总rna，并且在衍生自表达mcas9但不是未修饰的cas9或mcas9(g2a)的产生ev的细胞的ev中检测到sgrna。通过sanger测序分析证实靶向gfp的sgrna和支架sgrna的序列(图16f)。总之，将豆蔻酰化的cas9和sgrna-gfp封装到ev中，并且由八肽与cas9融合产生的蛋白质豆蔻酰化对于封装过程很重要。
[0186]
分离表达mcas9/sgrna-荧光素酶的产生ev的细胞，并将mcas9/sgrna-荧光素酶封装到ev中。
[0187]
使用类似的方法，生成表达cas9/sgrna-荧光素酶(luc)、mcas9/sgrna-luc或mcas9(g2a)/sgrna-luc的慢病毒载体。为了创建产生ev的3t3细胞，通过慢病毒感染用cas9、mcas9或mcas9(g2a)/sgrna-luc转导表达荧光素酶基因的3t3细胞。通过在96孔板中稀释分离出用cas9、mcas9或mcas9(g2a)/sgrna-luc转导的单细胞克隆(图17a)。分离的细胞克隆在表达cas9、mcas9或mcas9(g2a)/sgrna-荧光素酶的产生ev的细胞中表现出cas9表达和荧光素酶活性的下调(图17b)。验证了cas9、mcas9或mcas9(g2a)/sgrna-荧光素酶整合到分离的产生ev细胞的基因组dna中(图18a)。通过t7核酸内切酶活性证实了靶向荧光素酶基因的基因组编辑(图17c)。分离表达mcas9/sgrna-luc的细胞克隆，与表达cas9和mcas9(g2a)的那些分离物相比，其表达更高水平的cas9(图17d)。开发了靶向豆蔻酰化八肽的抗体，其特异性地检测豆蔻酰化八肽(或豆蔻酰化src激酶或豆蔻酰化cas9)(图18b)。仅在表达mcas9，而非cas9或mcas9(g2a)，的产生ev的细胞中检测到豆蔻酰化的cas9，(图17d)。更重要的是，仅在衍生自表达mcas9，而非cas9或mcas9(g2a)，的产生ev的细胞的ev中检测到cas9(图17e)。结果表明，豆蔻酰化促进mcas9封装到ev中。
[0188]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物及其引用的材料通过引用明确并入本文。
[0189]
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在涵盖在权利要求中。