一种显微成像装置的制作方法

1.本发明属于显微成像技术领域，尤其涉及一种显微成像装置。


背景技术：

2.大脑是由血管和不同细胞组成的复杂环境。为破译大脑功能信息，各种成像方式被开发出来。其中，多光子显微镜(mpm)因其无创性、亚细胞分辨率、功能和动态跟踪能力以及深层组织穿透而占据独特的生态位。这使得mpm成为具有高时空分辨率的脑深部成像不可或缺的技术。
3.提高深度是任何成像技术的目标，在mpm的开发过程中，为实现这一目标采取了两项措施：(1)使用3pm更好地抑制表面背景，使待解析的焦点处信息的信号背景比(sbr)大于单位1。(2)使用更长的激发窗口。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种显微成像装置，旨在解决现有技术无法达到更长激发窗口的问题。
5.为解决上述技术问题，本发明是这样实现的，一种显微成像装置，包括用于产生激光的激光发生器，以及沿所述激光的光路依次设置的频率调制设备、扫描振镜设备和显微设备；所述频率调制设备包括沿所述激光的光路依次设置的耦合透镜、光纤、解耦合透镜、第一滤光片、锗片以及中密度衰减片。
6.进一步地，所述光纤包括保偏大模场光纤、pc rods光纤，光子晶体光纤、空芯光子带隙光纤中的其中一种。
7.进一步地，所述激光发生器为飞秒光纤激光器、光参量振荡激光器中的其中一种。
8.进一步地，所述第一滤光片为长通滤光片。
9.进一步地，所述锗片以布儒斯特角入射角方向插入所述光路中。
10.进一步地，所述显微设备包括设置于所述激光经过所述扫描振镜设备反射后的光路上的二向色镜、设置于所述激光经过所述二向色镜反射后的光路上的物镜组件，以及设置于所述二向色镜的远离所述物镜组件的方向上的成像组件。
11.进一步地，所述物镜组件为水浸物镜，所述水浸物镜的浸泡介质为重水、硅油、矿物油中的其中一种。
12.进一步地，所述成像组件包括沿光路依次设置的短焦透镜、滤光片及光传感器，所述光传感器为gaas光电倍增管或gaasp光电倍增管。
13.进一步地，所述滤光片包括第二滤光片与第三滤光片形成的组合滤光片，所述第二滤光片为短通滤光片，所述第三滤光片为长通滤光片。
14.进一步地，所述显微成像装置还包括扩束准直镜组，所述扩束准直镜组设置于所述第一滤光片和所述显微设备之间的光路上，所述扩束准直镜组包括沿光路设置的扫描透镜和管透镜。
15.本发明中提供的显微成像装置与现有技术相比，有益效果在于：利用激光在光纤中的孤子自频移效应，使得激光在保偏大模场光纤内产生频移后，使用第一滤光片对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描显微成像。
附图说明
16.图1是本发明实施例中显微成像装置的结构示意图；
17.在附图中，各附图标记表示：1－激光发生器；2－频率调制设备；21－耦合透镜；22－光纤；23－解耦合透镜；24－第一滤光片；25－锗片；26－中密度衰减片；3－扫描振镜设备；4－显微设备；41－二向色镜；42－物镜组件；43－短焦透镜；44－第二滤光片；45－第三滤光片；46－光传感器；5－第一反射镜；6－半波片；7－第二反射镜；8－扩束准直镜组；81－扫描透镜；82－管透镜；9－样品。
具体实施方式
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.请参阅图1，本技术的一个实施例提供了一种显微成像装置，包括用于产生激光的激光发生器1，以及沿激光的光路依次设置的频率调制设备2、扫描振镜设备3和显微设备4；所述频率调制设备2包括沿所述激光的光路依次设置的耦合透镜41、光纤42、解耦合透镜43、第一滤光片44、锗片45以及中密度衰减片46。
20.具体而言，本实施例提供的显微成像装置是这样工作的：
21.激光发生器1产生的激光，依次经过频率调制设备2后，照射到扫描振镜设备3和显微设备4，并被显微设备4用作激光扫描显微成像的光源。激光在通过频率调制设备2时，首先被耦合透镜21耦合至光纤22内，激光在光纤22内发生孤子自频移(self－phase modulation，spm)；而后，激光经过解耦合透镜23时被解耦合并照射到第一滤光片24，第一滤光片24能够对孤子自频移后的激光的波段进行筛选，过滤多余波段光，并利用锗片25进行脉冲压缩后经过中密度衰减片26传输至扫描振镜设备3。在扫描振镜设备3的控制下，照射到显微设备4，进而对样本9进行激光扫描显微成像。
22.1986年在光纤反常色散区的孤子自频移效应(soliton self－frequency shift ssfs)被mitschke和mollenauer发现。在光纤中一个孤子可以连续地将能量通过脉冲内受激拉曼散射(srs)从高频转移到低频。只需要提高泵浦光纤的激光功率，就可以向长波方向的波长连续调谐。gordon发现频率的移动量与脉冲宽度的四次方成反比，也就是说，入射激光的脉宽越短，则它的孤子自频移效应越强。利用孤子自频移效应，已经在实验上演示了跨越八个倍频程的光谱以及1μm的调谐范围。另外ssfs生成孤子脉冲有极好的脉冲质量和飞秒量级的脉冲宽度，这使得光纤孤子光源非常适合多光子显微成像的应用。
23.基于相关技术中，1300nm波段和1700nm波段窗口激发的三光子显微镜(3pm)已经是大脑深层成像的成熟技术。基本原理是这些窗口的光在大脑中衰减相较于较短波长的激发窗口比较小。在1700nm波段之外还有另一个衰减可能很小的激发窗口：2200nm波段窗口，这是最后能用3pm大脑深层探测的光学窗口，本技术主要对如何实现2200nm波段窗口进行
探讨。
24.对于三光子激光扫描显微镜，可以利用孤子自频移效应从1550nm的激光光源中获得并分离出2200nm波长窗口的激光，用于样本9的三光子激光扫描显微成像。
25.实施本实施例提供的显微成像装置，至少具有以下有益技术效果：
26.本实施例提供的显微成像装置，利用激光在光纤中的孤子自频移效应，使得激光在光纤22内产生频移后，使用第一滤光片24对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描显微成像。比如，光纤22与孤子自频移结合，能够将1550nm的激光转化为2200nm波段窗口的高能飞秒激光脉冲，从而在样本9表面实现2200nm波段深度的显微成像，其中，光纤可为保偏大模场光纤、pc rods光纤、光子晶体光纤、空芯光子带隙光纤、高阶模式(hom)光纤等其他光纤。
27.作为本实施例的一个具体方案，激光发生器1可以采用飞秒光纤激光器，光参量振荡(opo)激光器等其他激光器，经过激光在光纤22中的孤子自频移效应，能够经过进一步的滤光获得2200nm波长窗口的激光；激光发生器1输出的激光的脉冲频率为1mhz，脉宽为556fs，且为线偏振光，可以在激光发生器1和频率调制设备2之间设置半波片6，以使得激光的偏振是对准保偏大模场光纤22的主轴；第一滤光片24采用2050nm长通滤光片，以滤除多余波段。
28.考虑到显微设备会引入了反常色散，使2200nm飞秒脉冲展宽。由于3pm信号s与脉冲宽度τ(s～1/τ2)为平方反比关系，该脉冲展宽将降低3pm信号。为了预先补偿色散并压缩样品上的脉冲宽度，在光路中以布儒斯特角入射角或插入了厚度为2mm的锗(ge)片。2mm锗片可将样品上的脉冲压缩到最小98fs。
29.请参阅图1，在本技术的一个实施例中，显微设备4包括设置于激光经过扫描振镜设备3反射后的光路上的二向色镜41、设置于激光经过二向色镜41反射后的光路上的物镜组件42，以及设置于二向色镜41的远离物镜组件42的方向上的成像组件。扫描振镜设备3能够控制激光在样本9表面进行扫描，物镜组件42通过自身焦距的调整控制样本9表面成像的深度。
30.作为本实施例的一个具体方案，二向色镜41以45
°
角斜对经过扫描振镜设备3的反射后的激光，激光被二向色镜41反射至物镜组件42后，照射到样本9上并激发样本9；样本9在受激后产生，荧光经过物镜组件42后再次照射向二向色镜41，二向色镜41对光线的透过具有选择性，荧光能够穿过二向色镜41并被成像组件接收。
31.其中，物镜组件42为水浸物镜，作为其中一种实施方式，重水(d2o)作为水浸物镜的浸没介质，重水(2.79cm
－1
)的吸收系数仅为h2o(19.85cm
－1
)的1/7，并且物镜的后孔径做未完全填充处理，以最大限度地提高透射率。
32.请参阅图1，在本技术的一个实施例中，成像组件包括设置于二向色镜41的远离物镜组件42的方向上的短焦透镜43、依次设置于激光穿过短焦透镜43后的光路上的组合滤光片和光传感器46，作为其中的一种实施方式，组合滤光片包括第二滤光片44和第三滤光片45，其中在，组合滤光片还包括带通滤波器等滤波器进行替代。
33.具体而言，物镜组件42具有光轴，样本8、二向色镜41、短焦透镜43、第二滤光片44、第三滤光片45、第一光传感器45均沿物镜组件42的光轴设置，其中，样本8设置于物镜组件42的一侧，二向色镜41、短焦透镜43、第二滤光片44、第三滤光片45和光传感器46依次设置
于物镜组件42的另一侧。
34.应当理解，本技术实施例中所述的光轴指的是物镜组件42所在的理想光具组的光轴，即物镜组件42所在的理想光具组中使光线不发生偏折的方向所在的一条直线。该解释适用于本技术各实施例中和光轴有关的描述，且光轴这一概念仅是为了简要清楚地说明本技术各实施例中的荧光显微设备的机械结构，不能理解为对本技术方案的限制。
35.请参阅图1，在本技术的一个实施例中，第一滤光片24和第三滤光片45采用长通滤光片，能够使得波长大于预设波长的光线通过，并阻止波长小于预设波长的光线；第二滤光片44短通滤光片，能够使得特定波段的光线通过，并阻止其他波段的光线，其中短焦透镜43的作用是将荧光的发射光聚焦(汇聚)到光传感器46上。
36.作为本实施例的一个具体方案，当激光发生器1采用1550nm激光发生器1，且需要获得2200nm波长窗口的激光以进行三光子荧光显微成像时，第一滤光片24采用2050nm的长通滤光片，第二滤光片43采用800nm的短通反射滤光片，第三滤光片45采用700nm长通滤光片；光传感器46采用砷化镓(gaas)光电倍增管，用于采集样本9的三次谐波信号，作为其中一种替换方式，光传感器46采用磷砷化镓(gaasp)光电倍增管(photo multiplier tube，pmt)，用于采集样本9的三光子荧光信号。
37.请参阅图1，在本技术的一个实施例中，显微成像装置还包括扩束准直镜组8，扩束准直镜组8设置于扫描振镜设备3和荧光显微设备4之间的光路上，且扩束准直镜组8包括在2200nm窗口具有高透射率的扫描透镜和管透镜，用于对激光进行扩束准直。
38.可选的，显微成像装置还可以包括若干反射镜，如图1所示的第一反射镜2和第二反射镜7以实现光路的折叠；应当注意，设置反射镜后，需要考虑反射镜处的半波损失和偏振问题。
39.以下提供一个具体的实施方式：
40.请参阅图1，在本实施例中，显微成像装置包括用于产生激光的激光发生器1，以及沿激光的光路依次设置的第一反射镜5，半波片6、频率调制设备2、第二反射镜7、扫描振镜设备3、扩束准直镜组8和显微设备4；频率调制设备2包括沿激光的光路依次设置的耦合透镜21、保偏大模场光纤22、解耦合透镜23、第一滤光片24、锗片25、中密度衰减片26；荧光显微设备4包括具有光轴的物镜组件42，以及沿物镜组件42的光轴设置的二向色镜41、短焦透镜43、第二滤光片44、第三滤光片45和光传感器46，样本9设置于物镜组件42的一侧，二向色镜41、短焦透镜43、第二滤光片44、第三滤光片45和光传感器46依次设置于物镜组件42的另一侧。
41.具体的，激光发生器1采用1550nm激光发生器1，激光发生器1输出的激光的脉冲频率为1mhz，脉宽为556fs，且为线偏振光，保偏大模场光纤22的有效模场面积为616平方微米，长度65cm，非线性折射率n2＝2.6x10－20m2/w，这样，经过保偏大模场光纤22后，由于自相位调制效应，激光会产生一个2200nm波长的窗口；进一步的，第一滤光片24采用2050nm的长通滤光片，第二滤光片44采用800nm的短通反射滤光片，第三滤光片45采用700nm长通滤光片，光传感器45采用磷砷化镓光电倍增管，用于采集样本9的三光子荧光信号，或采用砷化镓光电倍增管，用于采集样本9的三次谐波信号。
42.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。