一种快速测定细菌菌液中总类胡萝卜素含量的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种快速测定细菌菌液中总类胡萝卜素含量的方法。


背景技术：

2.类胡萝卜素(carotenoids)是自然界中广泛存在的一类天然色素的总称，主要由植物、细菌和真菌合成。天然类胡萝卜素由于其具有多种生物活性的特征，不仅能够作为着色剂、食品添加剂，而且还可作为抗氧化剂，具有重要的生物学功能，如能够高效猝灭单线态氧；增强生物体的免疫功能；在细菌体内参与多种生命活动，可以提高细菌的对环境的适应能力。目前，类胡萝卜素已广泛应用于食品、化妆品和保健品等领域。随着人们对健康生活的追求，天然类胡萝卜素的市场需求巨大，2026年全球市场有望达到69亿美元。因此，开发富含天然类胡萝卜素的产品意义重大。
3.细菌是人类获得天然类胡萝卜素的重要来源，利用培养细菌获得天然类胡萝卜素是目前的主要途径之一。传统方法测定细菌菌液中总类胡萝卜素含量的方法包括以下步骤：1、样品制备：细菌菌液在5000g离心10分钟获得细菌菌体。2、破壁处理：采取研磨、超声破碎、高速珠磨、反复冻融等方式破壁。3、有机溶剂萃取：黑暗条件下，用甲醇、丙酮等有机溶剂在摇床内室温提取菌体中的类胡萝卜素，直至菌体变白。4、上清液获取：5000g离心10分钟，获得含有类胡萝卜素的上清液，菌体沉淀物烘干称重备用。5、总类胡萝卜素含量测定：紫外分光光度计480nm波长下检测上清液的吸光度。最后，根据以下公式计算细菌生产总类胡萝卜素含量：
4.总类胡萝卜素含量(tcc,μg/g)＝a
×d×
v/(e
×
w)
5.式中，a是总类胡萝卜素含量在480nm的吸光度，d是稀释比例，v是萃取液的体积(ml)，e是总类胡萝卜素的消光系数为0.16，w是菌体的干重(g)。
6.该方法的缺点在于：1、步骤繁琐、耗时长，整个过程需要12h。2、不环保，需用大量的甲醇、丙酮等有机溶剂。3、类胡萝卜素的生物活性被破坏，天然类胡萝卜素具有生物活性特征，对光、热等均有较强的敏感性。4、成本高，如测定1l菌液中类胡萝卜素含量所需有机溶剂，甲醇为3-5元人民币，丙酮为 10-15元人民币。
7.鉴于细菌在人类获得天然类胡萝卜素中的重要作用，因此，开发快速、简便、环保、低成本的测定细菌生产类胡萝卜素产量的方法具有广阔的应用前景。然而，迄今为止还没有利用细菌菌液浓度和总类胡萝卜素含量来构建线性回归方程来进行快速检测细菌总类胡萝卜素含量的报道。本发明利用菌液浓度和总类胡萝卜素含量构建的线性回归方程能快速地检测菌液中总类胡萝卜素含量，能够解决传统方法中存在的问题。因此，本发明具有快速、简便、环保、成本低、并能够保持类胡萝卜素的生物活性等优点。


技术实现要素：

8.本发明目的在于克服传统方法测定细菌菌液总类胡萝卜素含量中存在的步骤繁
琐、耗时长、不环保、成本高以及类胡萝卜素的生物活性被破坏等缺点，同时提供一种快速、简便、环保、成本低且能够保持类胡萝卜素生物活性的测定方法。
9.本发明的原理在于一定波长下细菌的菌液浓度与其光密度间有正的线性关系，利用分光光度计可以快速测定细菌菌液浓度。我们发现：细菌菌液浓度与其类胡萝卜素含量间有正的线性关系，因此通过构建菌液浓度与菌液中总类胡萝卜素含量的标准曲线，建立二者间的线性回归方程，然后利用该方程就可以计算出任意浓度下的菌液类胡萝卜素含量。其步骤包括：(1)得到类胡萝卜素生产菌菌液浓度；(2)建立测定细菌菌液的总类胡萝卜素含量与菌液浓度间的线性回归方程；(3)根据线性回归方程获得细菌菌液的总类胡萝卜素含量。与传统方法相比，本发明步骤少、不需要使用有机溶剂、不需要菌体干燥、不需要对细菌进行处理、能够保持类胡萝卜素的生物活性。因此，本发明具有快速、简便、环保、低成本以及保持类胡萝卜素生物活性等优点。
10.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
11.一种快速测定细菌菌液中总类胡萝卜素含量的方法，包括如下步骤：
12.a、配置不同浓度的标准细菌菌液，测定所述标准细菌菌液的光密度值作为 x，以所述标准细菌菌液的浓度作为y，绘制标准曲线，建立快速测定细菌菌液浓度的线性回归方程：y＝ax b。
13.b、采用传统方法测定所述标准细菌菌液的总类胡萝卜素含量作为y，以所述标准细菌菌液的浓度作为x，绘制标准曲线，建立快速测定细菌菌液的总类胡萝卜素含量的线性回归方程：y＝ax b。
14.c、获得未知细菌菌液的光密度值，代入步骤a建立的线性回归方程，获得所述未知细菌菌液的浓度，再代入步骤b建立的线性回归方程，获得所述未知细菌菌液的总类胡萝卜素含量。
15.优选的，所述细菌为能够生产类胡萝卜素的细菌。
16.优选的，采用紫外分光光度计获得光密度值。
17.优选的，步骤a中，采用平板菌落计数法获得细菌菌液的浓度，并配置成所述标准细菌菌液。
18.优选的，还包括如下步骤：
19.d、校验：采用传统方法获得所述未知细菌菌液的总类胡萝卜素含量，与步骤c获得的所述未知细菌菌液的总类胡萝卜素含量相比较，无显著性差异。
20.一种如上所述快速测定细菌菌液中总类胡萝卜素含量的方法的应用，其特征在于，快速获得任意细菌菌液的总类胡萝卜素含量。
21.建立二重线性回归方程并校验无误后，对于同种细菌菌液，只要直接获得其光密度值，就可代入二重线性回归方程快速获得其总类胡萝卜素含量，为细菌生产类胡萝卜素的相关实验与研究提供便利。
22.与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
23.(1)快速、简便。传统方法测定细菌中总类胡萝卜素含量需要离心、破壁、萃取、干燥等步骤，完成整个过程需要12h，繁琐、耗时；本发明只需要两个步骤即可获得结果：
①
获得细菌菌液浓度。
②
根据方程即可获得细菌菌液的总类胡萝卜素含量；整个过程几分钟即可完成。因此，本发明快速、简便。
24.(2)环保。传统方法需用大量的甲醇、丙酮等有机溶剂，不环保；本发明不需要使用有机溶剂。因此，本发明环保。
25.(3)成本低。传统方法需要用大量的甲醇、丙酮等有机溶剂，并采用电烘干或氮气吹干，都要花费一定的成本。本发明不需要使用有机溶剂，不需要干燥。因此，成本低。
26.(4)保持了细菌活性和类胡萝卜素的生物活性。传统方法需要对细菌进行破壁、萃取处理，细菌死亡并且容易使得类胡萝卜素降解失去活性。本发明不需要对细菌进行处理，能够保持细菌活性和类胡萝卜素的生物活性。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
28.显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.为避免申请文本冗长，本发明仅以赤杆菌科、赤杆菌属的erythrobacterpelagi菌为例，记载实施例。它是一株从华贵栉孔扇贝“南澳金贝”的肠道中分离出来的能够生产类胡萝卜素的细菌。该菌为橘红色、需氧、杆状的革兰氏阴性菌。基于16s rrna和系统发育分析表明，该菌与erythrobacter pelagiust081027-248的16s rrna基因序列相似性为99.2％。
30.本领域技术人员知晓，使用其他能够生产类胡萝卜素的细菌会获得相似的实验结果。
31.实施例1：25℃条件下，采用本发明测定e.pelagi菌液总类胡萝卜素含量
32.时间：2021年5月6日，地点：汕头大学。
33.其操作步骤为：
34.1.e.pelagi菌液浓度的快速测定：采用平板菌落计数法获得细菌菌液浓度 (个/ml)。将细菌菌液系列稀释成6个不同浓度的菌液。在紫外分光光度计λ＝ 600nm波长下测得的光密度值为0.037、0.057、0.102、0.262、0.399、0.619。其对应的平板菌落计数(
×
106个/ml)结果为21、40、45、170、290、550。以菌液的光密度值为x，平板菌落计数结果为y绘制标准曲线并建立线性回归方程：y＝889.25x-32.754(r2＝0.9808)。
35.标准曲线线性回归方程的检验：将测得的菌液光密度值为0.117、0.138、0.257 代入方程中得到的细菌浓度(
×
106个/ml)为71、90、196。与实际平板菌落计数所获得的细菌浓度(
×
106个/ml)40、50、140经过spss 19.0统计软件的t 检验(t test)分析，测定细菌菌液的线性回归方程与平板菌落计数间无显著性差异(p》0.05)。
36.2.建立菌液浓度与菌液总类胡萝卜素含量的线性回归方程：
37.将e.pelagi菌液按一定比例进行8个浓度梯度稀释，准确移取500μl的稀释菌液在λ＝600nm波长下，紫外分光光度计测定e.pelagi菌液的光密度值为 0.47、0.598、0.833、1.062、1.292、1.309、1.360、1.440。根据菌液光密度值与菌液浓度的线性回归方法得到菌液浓度(
×
106个/ml)为：385、499、708、912、 1116、1131、1177、1248。
38.按传统方法(如背景技术所述)测定步骤1中不同浓度梯度的菌液中的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.338、0.430、0.719、0.828、1.039、1.040、1.116、 1.163，将其作为y,将
步骤1中获得的菌液浓度作为x，绘制标准曲线，即可建立测定e.pelagi菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)的线性回归方程：y＝0.0009x
ꢀ‑
0.0063(r2＝0.9887)。
39.3.效果检验：随机取定量的不同浓度的菌液在λ＝600nm波长下，紫外分光光度计测定其光密度值0.469、0.983、1.185、1.316，并代入步骤1的方程中获得菌液浓度(
×
106个/ml)为：384、841、1021、1137。将所得浓度代入步骤2的方程中，即可获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.339、 0.751、0.913、1.017。而传统方法(如背景技术所述)测定的总类胡萝卜素含量 (μg/ml)为0.344、0.856、1.256、1.016。spss 19.0统计软件进行t检验(t test) 分析线性回归方程计算得到的总类胡萝卜素含量与传统方法测定的总类胡萝卜素含量间无显著性差异(p》0.05)。
40.4.应用：取3组e.pelagi菌细菌菌液，在紫外分光光度计λ＝600nm波长下测得的光密度值为0.586、0.087、1.103，代入步骤1的方程中得到的细菌浓度(
×
106个/ml)为488、45、948，代入步骤2的方程中，获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.433、0.034、0.847。之后将此3组e.pelagi 菌细菌菌液在25℃恒温条件过夜培养，再在紫外分光光度计λ＝600nm波长下测得的光密度值为0.608、0.102、1.125，代入步骤1的方程中得到的细菌浓度 (
×
106个/ml)为508、58、968，代入步骤2的方程中，获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.451、0.046、0.865。证明运用本方法保持了细菌活性，经过一夜的培养后细菌浓度和类胡萝卜素含量均得到了一定程度的增加。
41.实施例2：30℃条件下，采用本发明测定e.pelagi菌液总类胡萝卜素含量
42.时间：2021年5月10日，地点：汕头大学
43.其操作步骤为：
44.1.e.pelagi菌液浓度的快速测定：由于使用的是同种细菌，直接沿用实施例 1中的菌液光密度值与菌液浓度呈正相关的线性关系，获得了二者间的线性回归方程为：y＝889.25x-32.754(r2＝0.9808)。
45.2.建立菌液浓度与菌液总类胡萝卜素含量的线性回归方程：
46.将e.pelagi菌液按一定比例进行6个浓度梯度稀释，准确移取500μl的稀释菌液在λ＝600nm波长下，紫外分光光度计测定e.pelagi菌液的光密度值为 0.837、0.880、1.229、1.418、1.470、1.506。根据菌液光密度值与菌液浓度的线性回归方法得到菌液浓度(
×
106个/ml)为712、750、1060、1228、1274、1306。
47.按传统方法(如背景技术所述)测定步骤1中不同浓度梯度的菌液中的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.681、0.730、1.019、1.077、1.279、1.324，将其作为y,将步骤1中获得的菌液浓度作为x，绘制标准曲线，即可建立测定e. pelagi菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)的线性回归方程：y＝0.001x 0.007 (r2＝0.9712)。
48.3.效果检验：随机取定量的不同浓度的菌液在λ＝600nm波长下，紫外分光光度计测定其光密度值0.887、1.263、1.444，并代入步骤1的方程中获得菌液浓度(
×
106个/ml)为756、1090、1251。将所得浓度代入步骤2的方程中，即可获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.763、1.097、1.258。而传统方法(如背景技术所述)测定的总类胡萝卜素含量(μg/ml)0.825、0.928、 1.251。spss 19.0统计软件进行t检验(t test)分析线性回归方程计算得到的总类胡萝卜素含量与传统方法测定的总类胡萝卜素含量间无显著性差异 (p》0.05)。
49.4.应用：取3组e.pelagi菌细菌菌液，在紫外分光光度计λ＝600nm波长下测得的光密度值为0.632、1.398、1.123，代入步骤1的方程中得到的细菌浓度(
×
106个/ml)为529、1210、966，代入步骤2的方程中，获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.536、1.217、0.973。之后将此3组e.pelagi 菌细菌菌液在30℃恒温条件过夜培养，再在紫外分光光度计λ＝600nm波长下测得的光密度值为0.662、1.458、1.189，代入步骤1的方程中得到的细菌浓度 (
×
106个/ml)为556、1264、1025，代入步骤2的方程中，获得该浓度下菌液的总类胡萝卜素含量(μg/ml)为0.563、1.271、1.032。证明运用本方法保持了细菌活性，经过一夜的培养后细菌浓度和类胡萝卜素含量均得到了一定程度的增加。
50.上述2个实施例中，利用线性回归方程可直接计算获得同一温度下不同浓度细菌菌液的总类胡萝卜素含量。与传统方法相比，本发明具有快速、简便、环保、低成本以及能够保持类胡萝卜素生物活性等优点。
51.另外，凡通过线性回归方程计算其他细菌菌液总类胡萝卜素含量也为本发明所述创意思想之所及。
52.以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。