一种头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法与流程

1.本发明涉及一种头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法，属于分析技术领域。


背景技术：

2.头孢硫脒，又名头孢菌素18，化学名为(6r,7r)-3-[(乙酰氧基)甲基]-7-[α-(n,n-二异丙基脒硫基)乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸内铵盐，分子式为c
19h28
n4o6s2，分子量为472.59，cas号为33075-00-2，白色或类白色结晶性粉末，几乎无臭，有引湿性,化学结构式为：
[0003][0004]
合成头孢硫脒的起始物料有n,n-二异丙基硫脲。n,n-二异丙基硫脲的合成合成路线为：
[0005][0006]
因此，头孢硫脒中会产生潜在的工艺杂质——异硫氰酸异丙酯，其分子式为c4h7ns，分子量为101.17，cas号为2253-73-8。
[0007]
在中国药典2020年版中，头孢硫脒的质量标准并没对异硫氰酸异丙酯进行控制，在相关文献中也未收载有关头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯的分析方法。目前，根据相关文献查询到异硫氰酸酯类化合物主要的检测方法有气相色谱法、液相色谱法和容量分析法，但均不适用于头孢硫脒中检测，具体如下：
[0008]
气相色谱法，由于头孢硫脒易溶于水，在有机溶剂中溶解性不好，而异硫氰酸异丙酯会与水发生水解反应而降解，两者溶解的溶剂不能兼顾。因此，气相色谱法不适用于头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测。
[0009]
正向液相色谱法，由于头孢硫脒有机溶剂中溶解性不好，从而无法检测。反向液相色谱法，因为流动相多为水溶液，无法直接检测异硫氰酸异丙酯，因此，常规液相色谱法也不适用于头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测。
[0010]
容量分析法，具有设备简单、操作方便等特点，但灵敏度较低，常用于常量分析。而头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯的限度为0.0012％，检测灵敏度要求高，因此容量滴定法也不适用于头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测。
[0011]
鉴于此，有必要开发一种省时、适用于监控头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法，以克服现有技术的不足。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法。
[0013]
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法，包括如下步骤：
[0014]
步骤1：制备对照品贮备液
[0015]
称取异硫氰酸异丙酯对照品，加丙酮，制成每1ml中含2.4μg异硫氰酸异丙酯的溶液，作为对照品贮备液；
[0016]
步骤2：制备衍生化反应液
[0017]
以二乙胺和丙酮按体积比为1:9的混合液，作为衍生化反应液；
[0018]
步骤3：制备稀释剂
[0019]
以磷酸盐缓冲液和乙腈按体积比为1:1的混合液，作为稀释剂；
[0020]
步骤4：制备对照品溶液
[0021]
精密移取1ml步骤1的对照品贮备液，置于10ml容量瓶，加入1ml步骤2的衍生化反应液，水浴后，用步骤3的稀释剂稀释定容至刻度，作为对照品溶液；
[0022]
步骤5：制备供试品溶液
[0023]
精密称取200mg
±
0.5mg待测定的头孢硫脒供试品，置于10ml容量瓶，加入1ml步骤2的衍生化反应液，水浴后，用步骤3的稀释剂定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0024]
步骤6：制备空白溶液
[0025]
精密移取1ml步骤2的衍生化反应液，置于10ml容量瓶，水浴后，用步骤3的稀释剂定容至刻度，作为空白溶液；
[0026]
步骤7：色谱条件
[0027]
色谱柱为c
18
柱，以磷酸盐缓冲液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，紫外检测器，检测波长为240nm；
[0028]
步骤8：测定
[0029]
分别吸取步骤4的对照品溶液和步骤5的供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，读取数据；对照品溶液峰形对称，理论塔板数2000以上，供试品溶液色谱图中如有异硫氰酸异丙酯峰，与对照品溶液中异硫氰酸异丙酯峰保留时间一致；空白溶液色谱图，无与异硫氰酸异丙酯对照相同的峰出现，即空白溶液无干扰；
[0030]
根据对照品溶液浓度与相应的色谱峰面积，供试品溶液色谱峰面积，采用外标法，计算得到头孢硫脒供试品中异硫氰酸异丙酯含量。
[0031]
本发明的头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法的原理是：
[0032]
本发明采用丙酮作为异硫氰酸异丙酯对照的溶解稀释剂，二乙胺和丙酮按体积比为1:9的混合液作为衍生化反应液，取异硫氰酸异丙酯对照品溶液，加入1ml衍生化反应液，在水浴中衍生化反应，反应完全，生成硫脲。
[0033]
柱温对洗脱时的保留时间影响较大，随着柱温的升高，保留时间一般会前移。本发明设置色谱柱温度为20℃-30℃，在其它条件完全相同条件下进样，对样品的分离度、峰形、对称度等方面影响较小，组分能实现良好分离。若温度过高，色谱图中各峰分离度降低。设置检测波长为240nm，在此波长下，异硫氰酸异丙酯衍生物的吸收效果最佳。
[0034]
本发明采用磷酸盐缓冲液和乙腈作为流动相，可以实现头孢硫脒与杂质异硫氰酸异丙酯的完全分离，分离度在1.5以上，理论塔板数在2000以上，同时能减少分析时间，有效地避免了组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
[0035]
本发明采用外标法进行定量分析，不论样品中的所有组分是否全部出峰，均可对出峰组分做定量分析。就定量参比物而言，外标法是最为准确的方法，因为是同质组分进行比较。
[0036]
综上，本发明根据异硫氰酸异丙酯能与二乙胺反应生成硫脲的原理，通过高效液相色谱法检测硫脲含量，采用本发明限定的色谱条件，计算出头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯的含量。此外，本发明还从专属性、线性、检测限与定量限、准确度、精密度和稳定性等方面，进行方法学验证。结果证明，本发明的检测方法，分离度高，重现性好，专属性强，准确度高，灵敏度高，检出限能达到0.003581μg/ml，结果稳定可靠，分析时间短。
[0037]
本发明的头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测方法的有益效果是：
[0038]
1、本发明建立了头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的高效液相色谱测定法，可以有效地对头孢硫脒原料药中可能存在的异硫氰酸异丙酯杂质进行检测，控制每克头孢硫脒原料药中异硫氰酸异丙酯≤12μg，从而有效地控制头孢硫脒原料药的质量。
[0039]
2、本发明的检测方法，分离度高，重现性好，专属性强，准确度高，灵敏度高，检出限能达到0.003581μg/ml，结果稳定可靠，分析时间短。
[0040]
3、本发明的检测方法，操作简便，检测条件温和，检测设备和仪器应用广泛，流动相原料来源广，配制简单，成本低廉，适合规模化推广应用。
[0041]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0042]
进一步，步骤1中，所述异硫氰酸异丙酯对照品的纯度为97.0％。
[0043]
采用上述进一步的有益效果是：上述异硫氰酸异丙酯对照品可以市售购买，如可以购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，纯度为97.0％。
[0044]
进一步，步骤3中，所述磷酸盐缓冲液的配制方法是：称取6.95g十二水合磷酸氢二钠和1.29g一水合柠檬酸，加超纯水溶解并稀释至1000ml。
[0045]
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，采用上述配比的磷酸盐缓冲液作为稀释剂，与流动相的初始比例一致，能最大限度地降低空白干扰。
[0046]
进一步，步骤4、步骤5和步骤6中，所述水浴的温度均为25℃，时间均为30min-40min。
[0047]
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，采用上述水浴的温度和时间，可以进行衍生化反应，反应完全，生成硫脲。
[0048]
进一步，步骤5中，所述头孢硫脒供试品的剂型为注射剂。
[0049]
采用上述进一步的有益效果是：目前，头孢硫脒仅有注射剂，适用于作为本发明的头孢硫脒原料药。
[0050]
进一步，步骤7中，所述色谱柱为kromasil 100-5-c
18
柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为5μm。
[0051]
采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数的色谱柱，是因为可以使混合物在很短时间内达到很好的分离效果，拥有出色的峰型，具有很好的操作一致性，且保证在低压使用时，达到很好的柱效。
[0052]
进一步，步骤7中，所述梯度洗脱的具体方法是：按体积比，0min-7min，流动相a为50％，流动相b为50％；7min-12min,流动相a为50％至40％，流动相b为50％至60％；12min至22min,流动相a为40％，流动相b为60％；22min-23min,流动相a为40％至50％，流动相b为60％至50％；23min-30min,流动相a为50％，流动相b为50％。
[0053]
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，采用上述参数的梯度洗脱，目标峰对称因子和分离度均较好，可以使混合物达到很好的分离效果，拥有出色的峰型，达到准确定量的目的。
[0054]
进一步，步骤7中，所述柱温为25℃，所述流速为1.0ml/min。
[0055]
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，25℃柱温与20℃柱温、30℃柱温相比，20℃柱温目标峰的峰高降低，柱压变大，30℃柱温目标峰保留时间提前，分离度降低，25℃柱温能较好的兼顾峰响应和分离度。因此，虽然这3个柱温均能满足检测要求，但25℃作为柱温更为合适。
[0056]
本发明经过研究发现，当流速为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min，目标峰的峰形和分离度无明显差异，但0.8ml/min流速出峰较晚，1.2ml/min流速柱压较高。因此，选择1.0ml/min作为流速。
[0057]
进一步，步骤8中，所述头孢硫脒供试品中异硫氰酸异丙酯含量按式1计算：
[0058][0059]
式中，ws为对照品的称样量，mg；as为对照品溶液的峰面积；ds为对照品溶液的稀释体积，ml；p为对照品含量；a
t
为供试品溶液的峰面积；ds为供试品溶液的稀释体积，ml；w
t
为供试品的称样量，mg。
[0060]
采用上述进一步的有益效果是：采用外标法进行定量分析，无需样品中的所有组分全部出峰和分离，仅需目标物出峰，即可对目标峰组分做定量分析。就定量参比物而言，外标法是最为准确的方法，因为是同质组分进行比较。
[0061]
术语解释：
[0062]
术语“对称性”是指在hplc检测中，用于考察峰型对称性的参数，体现色谱柱效能；在液相色谱法中，当对称性在0.8-1.2认为峰型较好。
[0063]
术语“分离度”，等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，用于考察待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。通常两个峰型峰高相当的色谱峰，其分离度大于等于1.5，则认为两峰的分离达到99％以上。分离度值越大分离情况越好。
附图说明
[0064]
图1为本发明的实验例1的步骤1.1中，采用方法一，得到的高效液相色谱图。
[0065]
图2为本发明的实验例1的步骤1.1中，采用方法二，得到的高效液相色谱图。
[0066]
图3为本发明的实验例1的步骤1.2中，采用紫外检测器(dad)，进行全波长扫描的uv色谱图。
[0067]
图4为本发明的实验例1的步骤1.3中，柱温为20℃，得到的高效液相色谱图。
[0068]
图5为本发明的实验例1的步骤1.3中，柱温为25℃，得到的高效液相色谱图。
[0069]
图6为本发明的实验例1的步骤1.3中，柱温为30℃，得到的高效液相色谱图。
[0070]
图7为本发明的实验例1的步骤1.4中，流速为0.8ml/min，得到的高效液相色谱图。
[0071]
图8为本发明的实验例1的步骤1.4中，流速为1.0ml/min，得到的高效液相色谱图。
[0072]
图9为本发明的实验例1的步骤1.4中，流速为1.2ml/min，得到的高效液相色谱图。
[0073]
图10为本发明的实验例1的步骤1.5中，空白溶液的高效液相色谱图。
[0074]
图11为本发明的实验例1的步骤1.5中，供试品溶液的高效液相色谱图。
[0075]
图12为本发明的实验例1的步骤1.5中，对照品溶液的高效液相色谱图。
[0076]
图13为本发明的实验例3中，异硫氰酸异丙酯的标准曲线图。
具体实施方式
[0077]
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0078]
实施例1：色谱条件与系统适用性试验
[0079]
步骤1.1：洗脱梯度确定
[0080]
以十八烷基键合硅胶柱为填充剂；检测波长为240nm；以磷酸盐缓冲液为流动相a，乙腈为流动相b。按以下各色谱条件对同一供试品溶液进行检测。其中，磷酸盐缓冲液的配制方法是：称取6.95g十二水合磷酸氢二钠和1.29g一水合柠檬酸，加超纯水溶解并稀释至1000ml。
[0081]
方法一：流速为1.0ml/min，柱温为25℃，进样量为20μl，进行梯度洗脱，具体为：按体积比，0min-7min，流动相a为55％，流动相b为45％；7min-12min,流动相a为55％至40％，流动相b为45％至60％；12min至22min,流动相a为40％，流动相b为60％；22min-23min,流动相a为40％至55％，流动相b为60％至45％；23min-30min,流动相a为55％，流动相b为45％。
[0082]
方法二：流速为1.0ml/min，柱温为25℃，进样量为20μl，进行梯度洗脱，具体为：按体积比，0min-7min，流动相a为50％，流动相b为50％；7min-12min,流动相a为50％至40％，流动相b为50％至60％；12min至22min,流动相a为40％，流动相b为60％；22min-23min,流动相a为40％至50％，流动相b为60％至50％；23min-30min,流动相a为50％，流动相b为50％。
[0083]
加样供试品溶液的制备：精密称取200mg
±
0.5mg待测定的头孢硫脒供试品，置于10ml容量瓶，精密移取1ml步骤1的对照品贮备液，置于同一容量瓶中，加入1ml的衍生化反应液，在25℃水浴30min-40min后，用稀释剂定容至刻度，摇匀，作为加样供试品溶液。
[0084]
其中，对照品贮备液的制备方法是：称取异硫氰酸异丙酯对照品，加丙酮，制成每1ml中含2.4μg异硫氰酸异丙酯的溶液，作为对照品贮备液。衍生化反应液的制备方法是：以二乙胺和丙酮按体积比为1:9的混合液，作为衍生化反应液。衍生化反应液的制备方法是：以磷酸盐缓冲液和乙腈按体积比为1:1的混合液，作为稀释剂。
[0085]
测定法：精密吸取加样供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1-图2。
[0086]
由图1-图2可知，方法二供试品溶液中目标峰对称因子和分离度均较好，故选择方法二作为头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量测定的洗脱梯度。
[0087]
步骤1.2：波长确定
[0088]
按梯度考察最终确定的色谱条件，采用紫外检测器(dad)进行全波长扫描，检测供试品溶液，考察目标峰吸收波长，全波长扫描结果见图3。
[0089]
通过图3可知，目标峰在240nm下有最大吸收，通常选择最大吸收波长作为检测波长，故头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量测定方法的波长选择240nm。
[0090]
步骤1.3：柱温确定
[0091]
按上述考察最终确定的色谱条件，检测同一份供试品溶液，选择不同的柱温进行考察，结果见图4-图6。
[0092]
通过比较不同柱温20℃、25℃和30℃下供试品中目标峰的峰形和分离度大小等可知，在这3个柱温下，25℃柱温与20℃柱温、30℃柱温相比，20℃柱温目标峰的峰高降低，柱压变大，30℃柱温目标峰保留时间提前，分离度降低，25℃柱温能较好的兼顾峰响应和分离度。因此，虽然这3个柱温均能满足检测要求，但25℃作为柱温更为合适。
[0093]
步骤1.4：流速确定
[0094]
按上述考察最终确定的色谱条件，检测同一份供试品溶液，选择不同的流速进行考察，结果见图7-图9。
[0095]
通过比较不同流速0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min下供试品中目标峰的峰形和分离度大小等可知，在这3个不同流速下，目标峰的峰形和分离度无明显差异，但0.8ml/min流速出峰较晚，1.2ml/min流速柱压较高。因此，选择1.0ml/min作为流速。
[0096]
步骤1.5：专属性试验
[0097]
按洗脱梯度考察和波长考察结果最终确定的色谱条件，精密吸取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图10-图12。
[0098]
由检测结果可知，此色谱条件下空白溶液无干扰，对照品溶液和供试品溶液中各色谱峰对称因子和分离度均较好，理论塔板数不低于2000，说明此色谱条件良好，符合要求。
[0099]
最终确定色谱条件：色谱柱为kromasil 100-5-c
18
柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为5μm。以磷酸盐缓冲液为流动相a，乙腈为流动相b。紫外检测器，检测波长为240nm；柱温为25℃；流速为1.0ml/min；梯度洗脱，具体方法是：按体积比，0min-7min，流动相a为50％，流动相b为50％；7min-12min,流动相a为50％至40％，流动相b为50％至60％；12min至22min,流动相a为40％，流动相b为60％；22min-23min,流动相a为40％至50％，流动相b为60％至50％；23min-30min,流动相a为50％，流动相b为50％。
[0100]
实验例2：衍生化反应条件考察
[0101]
精密移取1ml对照品贮备液4份，分别置于10ml容量瓶，加入1ml的衍生化反应液，分别在25℃水浴10min、20min、30min和40min后，用稀释剂稀释定容至刻度，即得。
[0102]
按上述测定方法，检测异硫氰酸异丙酯衍生物的响应，结果见表1。
[0103]
表1不同反应时间对衍生化反应结果的影响比较
[0104]
反应时间10min20min30min40min目标响应峰面积45.9852250.0833552.2142451.04218
[0105]
结果表明，反应时间为10min时，明显未反应完全；反应时间大于20min，目标峰响应相差不大。因此，选择反应时间为30min-40min。
[0106]
实验例3：方法验证
[0107]
步骤3.1：线性与范围
[0108]
精密称取异硫氰酸异丙酯对照品适量，加丙酮稀释，加衍生化反应液反应，得一系列对照品溶液。精密吸取20μl，注入液相色谱仪，按上述确定的色谱条件进行测定，记录色谱图，以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归分析，计算回归线的相关系数(r)。结果详见表2。异硫氰酸异丙酯的标准曲线图，如图13所示。
[0109]
表2线性试验结果汇总
[0110][0111]
结论：根据上述的线性试验结果，定量限浓度为0.01194μg/ml，以供试品进样浓度20mg/ml(以头孢硫脒计)计算主成分及异硫氰酸异丙酯衍生化合物含量的最小定量(约为0.00006％)和最小检出量(约为0.00002％)，满足本品的检测要求，故将供试品进样浓度定为20mg/ml，回归方程的相关系数r大于0.990，线性关系良好。
[0112]
步骤3.2：检测限与定量限
[0113]
精密称取异硫氰酸异丙酯对照品适量，加丙酮逐步稀释，加衍生化反应液反应，当异硫氰酸异丙酯衍生物峰高约为基线噪音10倍时的溶液，作为定量限溶液；至各成分峰高约为基线噪音3倍时的溶液，作为检测限溶液。
[0114]
精密移取定量限、检测限溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，进样结果详见表3和表4。
[0115]
表3检测限与定量限结果
[0116][0117]
表4定量限重复性峰面积试验结果
[0118]
123456rsd(％)
1.617051.828941.913211.609991.799391.782326.88
[0119]
结论：定量限6份溶液峰面积的rsd均不大于10.0％，信噪比满足检测要求；检测限3份溶液的信噪比，满足检测要求。
[0120]
步骤3.3准确度(加样回收率)
[0121]
采用加样回收法，称取头孢硫脒200mg
±
0.5mg，精密称定9份，置于不同的10ml容量瓶中，分别精密加入异硫氰酸异丙酯对照品12μg、24μg和36μg各3份，各加入1ml衍生化反应液，在25℃水浴30min后，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，即得50％、100％和150％三个不同浓度的加样回收试验溶液。精密吸取20μl，注入高效液相色谱仪，测定。结果见表5。
[0122]
表5准确度结果汇总
[0123][0124]
结论：供试品加样回收率为99.16％-107.82％，回收率均值为103.92％，rsd不大于6％，符合要求，该方法准确度良好。
[0125]
步骤3.4精密度
[0126]
3.4.1重复性
[0127]
按“步骤3.3准确度”项下100％加样回收试验溶液配制方法，平行配制6份，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表6。
[0128]
表6重复性结果汇总(分析员a)
[0129]
[0130]
结论：6份100％加样回收试验溶液回收率为101.17％-104.65％，回收率均值为103.20％，rsd不大于6％，符合要求，重复性良好。
[0131]
3.4.2中间精密度
[0132]
不同分析人员按照重复性项下同法平行配制100％加样回收试验溶液6份，分别于不同时间在不同仪器上使用不同色谱柱测定6份100％加样回收试验溶液中回收率，并计算rsd值，结果详见表7和表8。
[0133]
表7中间精密度-重复性结果汇总(分析员b)
[0134][0135]
结论：不同人员、不同日期，分别使用不同的仪器测试，测得6份100％加样回收试验溶液中的回收率为98.27％-102.29％，回收率均值为99.65％，rsd小于6％，符合要求，中间精密度中的重复性良好。
[0136]
表8中间精密度结果汇总
[0137][0138]
注：重复性：人员a；日期：2020.12.11；仪器：a1-lc807；色谱柱：c-201901。
[0139]
中间精密度：人员b；日期：2020.12.14；仪器：a1-lc806；色谱柱：c-116。
[0140]
结论：两个分析人员使用不同的仪器与系统进行测试，测得12份100％加样回收试验溶液的回收率rsd不大于10％，符合要求，中间精密度良好。
[0141]
综上，采用既定的检测方法检测异硫氰酸异丙酯时方法的重复性和中间精密度均符合验证要求，表明该方法精密度良好。
[0142]
步骤3.5稳定性
[0143]
制备一份供试品溶液和对照品溶液，将供试品溶液，在室温下分别放置6h、16h和30h；将对照品溶液，在室温下分别放置9h、19h和33h；精密移取各稳定性溶液20μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，进样结果详见表9和表10。
[0144]
表9供试品溶液稳定性结果汇总
[0145]
放置时间峰面积(mau)0h未检出6h未检出
16h未检出30h未检出rsd％/
[0146]
表10对照品溶液稳定性结果汇总
[0147]
放置时间峰面积(mau)0h34.094299h33.2793219h33.3998733h32.72381rsd％1.69
[0148]
结论：在室温条件下，供试品溶液在30h内均未检出，溶液稳定性良好，满足测定要求；对照品溶液在33h内，峰面积rsd≤5％，溶液稳定性良好，满足测定要求。
[0149]
实验例4：头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量检测方法确定
[0150]
经过本技术发明人大量的试验摸索，最终头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量检测方法确定如下：
[0151]
步骤1：制备对照品贮备液
[0152]
称取异硫氰酸异丙酯对照品品24mg
±
0.5mg，置于100ml容量瓶，加丙酮，制成每1ml中含2.4μg异硫氰酸异丙酯的溶液，作为对照品贮备液。
[0153]
步骤2：制备衍生化反应液
[0154]
以二乙胺和丙酮按体积比为1:9的混合液，作为衍生化反应液。
[0155]
步骤3：制备稀释剂
[0156]
以磷酸盐缓冲液和乙腈按体积比为1:1的混合液，作为稀释剂。
[0157]
步骤4：制备对照品溶液
[0158]
精密移取1ml步骤1的对照品贮备液，置于10ml容量瓶，加入1ml步骤2的衍生化反应液，在25℃水浴30min后，用步骤3的稀释剂稀释定容至刻度，作为对照品溶液。
[0159]
步骤5：制备供试品溶液
[0160]
精密称取200mg
±
0.5mg待测定的头孢硫脒供试品，置于10ml容量瓶，加入1ml步骤2的衍生化反应液，在25℃水浴30min后，用步骤3的稀释剂定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0161]
步骤6：制备空白溶液
[0162]
精密移取1ml步骤2的衍生化反应液，置于10ml容量瓶，在25℃水浴30min后，用步骤3的稀释剂定容至刻度，作为空白溶液。
[0163]
步骤7：色谱条件
[0164]
色谱柱为kromasil 100-5-c
18
柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为5μm。以磷酸盐缓冲液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，紫外检测器，检测波长为240nm。梯度洗脱的具体方法是：按体积比，0min-7min，流动相a为50％，流动相b为50％；7min-12min,流动相a为50％至40％，流动相b为50％至60％；12min至22min,流动相a为40％，流动相b为60％；22min-23min,流动相a为40％至50％，流动相b为60％至50％；23min-30min,流动相a为50％，流动相b为50％。
[0165]
步骤8：测定
[0166]
分别吸取步骤4的对照品溶液和步骤5的供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，读取数据；对照品溶液峰形对称，理论塔板数2000以上，供试品溶液色谱图中如有异硫氰酸异丙酯峰，与对照品溶液中异硫氰酸异丙酯峰保留时间一致；空白溶液色谱图，无与异硫氰酸异丙酯对照相同的峰出现，即空白溶液无干扰；
[0167]
根据对照品溶液浓度与相应的色谱峰面积，供试品溶液色谱峰面积，采用外标法，按式1计算得到头孢硫脒供试品中异硫氰酸异丙酯含量。
[0168][0169]
式中，ws为对照品的称样量，mg；as为对照品溶液的峰面积；ds为对照品溶液的稀释体积，ml；p为对照品含量；a
t
为供试品溶液的峰面积；ds为供试品溶液的稀释体积，ml；w
t
为供试品的称样量，mg。
[0170]
实验例5：头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量测定
[0171]
按实验例4最终确定的检测方法对10批头孢硫脒中的异硫氰酸异丙酯含量进行检测，实验结果见表11。
[0172]
表11实验例4中10批头孢硫脒中的异硫氰酸异丙酯含量测定结果
[0173]
样品编号含量(％)样品编号含量(％)sj170901未检出lma1911019未检出sj200601未检出lma1911003未检出sj200602未检出ssj210401未检出sj200603未检出ssj210402未检出lma1703002未检出ssj210403未检出
[0174]
由表11可知，10批头孢硫脒中均未检出异硫氰酸异丙酯，符合每克头孢硫脒原料药中异硫氰酸异丙酯≤12μg的要求，可以上市。
[0175]
对比例1
[0176]
以参考文献《gc法同时测定维药芜菁子中4种异硫氰酸酯类化合物的含量》
[1]
的检测方法作为对比例1。该文献中利用气相色谱法分析异硫氰酸酯类化合物的组成并测定其含量，具体方法：色谱柱：zb-ffap(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；载气：高纯氮气；流速：1ml/min；程序升温：初始温度为80℃，保持12min，以10℃/min升温至120℃，再以30℃/min升温至210℃，最后以5℃/min升温至230℃，保持2min；进样口温度：200℃；分流进样，分流比：90∶1；检测器温度：250℃；氢气流速：30ml/min；空气流速：40ml/min；尾吹气流速：25ml/min。采用甲醇作为稀释剂。
[0177]
对比例1的方法运用在头孢硫脒检测存在如下缺陷：由于头孢硫脒易溶于水，在有机溶剂中溶解性不好，而异硫氰酸异丙酯会与水发生水解反应而降解，两者溶解的溶剂不能兼顾，因此气相色谱法不适用于头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯含量的检测。
[0178]
对比例2
[0179]
以参考文献《二乙胺滴定法测定辣根及芥末制品中异硫氰酸醋含量的研究》的检
测方法作为对比例2。该文献的方法原理：异硫氰酸酯与二乙胺在丙酮溶液中发生均相反应,生成相应的硫脲,过量的二乙胺用标准盐酸滴定,从而计算出异硫氰酸酯的含量。
[0180]
通过其原理可知，对比例2的方法运用在头孢硫脒检测存在如下缺陷：(1)头孢硫脒在丙酮中不溶，该溶剂体系不适合头孢硫脒检测；(2)头孢硫脒属于内铵盐，会与盐酸反应，消耗盐酸滴定液，从而无法定量。(3)该方法为滴定法，常用于常量分析，头孢硫脒中异硫氰酸异丙酯属于微量分析，限度为0.0012％，因此，滴定法不适用于头孢硫脒检测。
[0181]
参考文献：
[0182]
[1].孙莲，田兰，阿布都许库尔
˙
吐尔逊.gc法同时测定维药芜菁子中4种异硫氰酸酯类化合物的含量[j].中国药房，2012(47)：4482-4483.
[0183]
[2].张清峰，姜子涛，董峰光等.二乙胺滴定法测定辣根及芥末制品中异硫氰酸醋含量的研究[j].中国调味品，2005(2)：48-51.
[0184]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。