一种无创血糖检测电极贴片及其制造方法和反离子电渗体外实验装置与流程

1.本发明涉及血糖检测技术领域，尤其涉及一种无创血糖检测电极贴片及其制造方法和反离子电渗体外实验装置。


背景技术：

2.糖尿病是一种世界范围内的以高血糖为特征的代谢性疾病，由其引发的病症和并发症不仅威胁着患者的生命安全，而且给社会带来了很高的经济成本。糖尿病患者进行严格的自我血糖管理是糖尿病治疗的关键手段，目前这种自我管理主要采用指尖采血的方法，该方法不仅不够方便，而且患者具有微生物感染的风险，再者采血带来的痛苦也大大降低了患者的依从性。为解决该问题，许多公司(美敦力、雅培、德康等)提出了基于葡萄糖氧化酶的微针生物传感器来检测皮下组织液中的葡萄糖浓度，虽然解决了指尖采血带来的痛苦，但是依然具有微生物感染的风险，并且需要进行频繁的更换。因此，完全无创血糖检测是解决上述问题的理想选择。
3.近些年，基于光学、声学、电化学等技术的生物传感器被开发用于汗液、唾液、尿液、组织液等生物体液中葡萄糖的检测，进而实现血糖的无创检测。在这些生物体液中，组织液中葡萄糖的浓度与血糖的相关度更高，是最具吸引力的检测样本。在所有的组织液提取方法中，反离子电渗法是其中可操作性相对而言较强的。由于人体皮肤在正常生理ph条件下带负电，因此可作为阳离子的选择性膜，通过在皮肤表面施加微弱恒定电流，钠离子作为主要载流子，导致了流向阴极的组织液电渗流。与此同时，该电渗流将葡糖等中性分子也运输至皮肤表面，进而实现组织液葡萄糖的无创检测。然而，基于反离子电渗法的血糖检测设备大都存在尺寸大、检测结果不准确和对皮肤产生刺激等缺点，而且没有开发专门用于体外组织液提取和检测的实验装置用于验证设备的可行性。


技术实现要素：

4.本发明目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种利用反离子电渗法无创检测组织液中葡萄糖的电极贴片及其制造方法，以及使用该电极贴片的反离子电渗体外实验装置。
5.为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
6.一种无创血糖检测电极贴片，包括阳极贴片和阴极贴片，其特征在于：所述阳极贴片包括第一电极基底，以及设置在所述第一电极基底上的第一工作电极、第一参比电极和第一对电极，所述阴极贴片包括第二电极基底，以及设置在所述第二电极基底上的第二工作电极、第二参比电极和第二对电极，所述第一工作电极、第一参比电极、第一对电极、第二工作电极、第二参比电极和第二对电极分别连接有引线，所述引线上覆盖有绝缘层，引线的末端设有引脚，所述第二工作电极上覆盖有功能化涂层，所述功能化涂层包括石墨烯、普鲁士蓝和葡萄糖氧化酶，所述第二对电极、第二参比电极和覆盖有功能化涂层的第二工作电极上设置有水凝胶层。
7.进一步的，所述功能化涂层中石墨烯和普鲁士蓝的质量之比为2:1。
8.进一步的，所述水凝胶层为生物相容性优异的琼脂糖溶液。
9.进一步的，所述第一电极基底和第二电极基底为pet膜，所述阳极贴片和阴极贴片采用丝网印刷术制造。
10.一种无创血糖检测电极贴片的制造方法，其特征在于，包括如下步骤：
11.步骤10：利用丝网印刷技术，在第一电极基底上使用油墨依次印刷引线和引脚、第一对电极和第一工作电极、第一参比电极、绝缘层，并在一定温度下进行固化处理，制得阳极贴片；
12.步骤20：利用丝网印刷技术，在第二电极基底上使用油墨依次印刷引线和引脚、第二对电极和第二工作电极、第二参比电极、绝缘层，并在一定温度下进行固化处理，制得半成品阴极贴片；
13.步骤30：将所述半成品阴极贴片的第二工作电极上刷上一层银浆油墨后置于烘箱中固化至半凝固状态，然后向所述银浆油墨上均匀滴加10μl含有普鲁士蓝的石墨烯溶液，将其放入40℃水浴中加热12h；
14.步骤40：将步骤30中水浴加热后的半成品阴极贴片用纯水清洗后，空气吹干后进行冷冻干燥；
15.步骤50：向所述第二工作电极上均匀滴加5μl壳聚糖-戊二醛和葡萄糖氧化酶混合溶液，而后放置在冰箱中-4℃干燥；
16.步骤60：将琼脂糖水凝胶均匀地滴涂覆盖在所述第二工作电极、第二参比电极和第二对电极上，制得阴极贴片。
17.进一步，所述步骤30中含有普鲁士蓝的石墨烯溶液的配制方法包括以下步骤：
18.步骤301：称取0.049g k3fe(cn)6溶于1ml纯水中，磁子搅拌10min，然后添加3ml浓度为10mg/ml的还原氧化石墨烯溶液并磁子搅拌1h使其混合均匀；
19.步骤302：称取0.3g抗坏血酸和0.0266g fecl3·
6h2o溶于3.5ml纯水中，超声振荡均匀；
20.步骤303：将步骤302中配制的溶液加入步骤301中配制的溶液中，磁子搅拌10min使其混合均匀，制得含有普鲁士蓝的石墨烯溶液。
21.进一步的，所述步骤40中冷冻干燥是指将半成品阴极贴片在-20℃冷冻48h，冷冻完后取出，放置在冷冻干燥机中在-100℃下冷冻干燥8h。
22.进一步的，所述步骤50中的壳聚糖-戊二醛和葡萄糖氧化酶混合溶液是先将含有10mg/ml牛血清蛋白的30mg/ml葡萄糖氧化酶溶液和壳聚糖溶液按照1:1的比例均匀混合，而后按照1:10的比例将浓度1％的戊二醛溶液添加至上述葡萄糖氧化酶和壳聚糖混合溶液中制成，所述壳聚糖溶液通过将0.5wt％壳聚糖溶于0.1m醋酸溶液制得。
23.进一步的，所述步骤60中的琼脂糖水凝胶是将4％w/v的琼脂糖溶液在ph＝7.4的10mm磷酸盐缓冲液中连续加热搅拌而成。
24.一种反离子电渗体外实验装置，其特征在于：包括扩散细胞、离体猪皮、导线、磁力搅拌器、搅拌子、电化学工作站以及上述任一项中的所述无创血糖检测电极贴片，所述扩散细胞包括样品池、进样口和放置平台，所述样品池设置在所述磁力搅拌器上，所述进样口与样品池相连通，样品池中盛有样品溶液，所述搅拌子设置在样品池中，所述放置平台设置在
样品池上，所述离体猪皮放置在放置平台上，所述无创血糖检测电极贴片中的阳极贴片和阴极贴片贴在离体猪皮上，所述电化学工作站通过导线与所述阳极贴片和阴极贴片上的引脚相连接，所述样品溶液为含有133mm nacl的磷酸盐缓冲液与葡萄糖混合配制而成。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明无创血糖检测电极贴片是一种电化学生物传感器，通过反离子电渗法提取人体组织液，进而利用计时电流法等电化学测量技术来实现葡萄糖的定量无创检测。2、生物传感电极贴片功能化涂层中的普鲁士蓝和葡萄糖氧化酶，使电极贴片具有更高的特异性、准确性和灵敏度；石墨烯通过冷冻干燥形成三维多孔结构，提高了工作电极区域的比表面积，有利于提高反应灵敏度和反应速率。3、电极贴片制造过程简单、尺寸小、柔性好，制造成本低，具有大规模生产的优势，而且有利于和可穿戴设备进行集成。4、反离子电渗体外实验装置提供了体外电极贴片可行性的验证，提高了实验的安全性和重复性。
附图说明
26.图1为本发明一种无创血糖检测电极贴片结构示意图；
27.图2为本发明阳极贴片内部结构示意图；
28.图3为本发明阴极贴片内部结构示意图；
29.图4为本发明一种反离子电渗体外实验装置结构示意图；
30.图5为扩散细胞的结构示意图；
31.图6为含普鲁士蓝的石墨烯溶液滴加量与电流响应差值关系图；
32.图7为含有不同配比的含普鲁士蓝的石墨烯溶液的无创血糖检测电极贴片在-0.7～0.7v电压范围内进行扫速为100v/s循环伏安测试的结果图。
33.其中：1-阳极贴片，2-阴极贴片，3-引线，4-绝缘层，5-引脚，6-水凝胶层，7-扩散细胞，8-离体猪皮，9-磁力搅拌器，10-导线，11-第一电极基底，12-第一工作电极，13-第一参比电极，14-第一对电极，15-搅拌子，16-电化学工作站，21-第二电极基底，22-第二工作电极，23-第二参比电极，24-第二对电极，71-样品池，72-进样口，73-放置平台。
具体实施方式
34.为了加深本发明的理解，下面我们将结合附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
35.如图1-3所示，一种无创血糖检测电极贴片，包括成对的用于组织液提取的阳极贴片1和阴极贴片2，阳极贴片1包括第一电极基底11，以及设置在第一电极基底11上的第一工作电极12、第一参比电极13和第一对电极14，阴极贴片2包括第二电极基底21，以及设置在第二电极基底21上的第二工作电极22、第二参比电极23和第二对电极24，第一工作电极12、第一参比电极13、第一对电极14、第二工作电极22、第二参比电极23和第二对电极24分别连接有引线3，引线3上覆盖有绝缘层4，引线3的末端设有引脚5，第二工作电极22上覆盖有功能化涂层，功能化涂层包括石墨烯、普鲁士蓝和葡萄糖氧化酶，第二对电极24、第二参比电极25和覆盖有功能化涂层的第二工作电极22上设置有水凝胶层6。电极贴片上的参比电极用于精确地控制工作电极的电位，对电极用于和工作电极形成回路。
36.优选的，功能化涂层中石墨烯和普鲁士蓝的质量之比为2:1。水凝胶层6采用生物
相容性优异的琼脂糖溶液。第一电极基底11和第二电极基底21为pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯)膜，阳极贴片1和阴极贴片2采用丝网印刷术制造。pet膜为柔性膜，有利于电极贴片和皮肤形成紧密连接。
37.上述无创血糖检测电极贴片的制造方法，包括如下步骤：
38.步骤10：利用丝网印刷技术，在第一电极基底11上使用油墨依次印刷引线3和引脚5、第一对电极14和第一工作电极12、第一参比电极13、绝缘层4，并在一定温度下进行固化处理，制得阳极贴片1；
39.步骤20：利用丝网印刷技术，在第二电极基底21上使用油墨依次印刷引线3和引脚5、第二对电极24和第二工作电极22、第二参比电极23、绝缘层4，并在一定温度下进行固化处理，制得半成品阴极贴片，刷银浆油墨的目的是保证含有普鲁士蓝的石墨烯能够成功修饰在第二工作电极22上而不脱落，水浴则是将含有普鲁士蓝的石墨烯溶液干燥形成含有普鲁士蓝的石墨烯水凝胶；
40.步骤30：将半成品阴极贴片的第二工作电极22上刷上一层银浆油墨后置于烘箱中固化至半凝固状态，然后向银浆油墨上均匀滴加10μl含有普鲁士蓝的石墨烯溶液，将其放入40℃水浴中加热12h。经过实验比较，向第二工作电极22区域均匀滴加10μl含有普鲁士蓝的石墨烯溶液可使该电极的电化学性能达到最优。为确定最佳的普鲁士蓝的石墨烯溶液滴加量，分别向第二工作电极22区域均匀滴加4μl、6μl、8μl、10μl该溶液，通过比较第二工作电极22在有无过氧化氢溶液中电流响应的差值来确定该溶液的最佳滴加量，结果如图6所示，该结果表示10μl普鲁士蓝的石墨烯溶液为最佳滴加量；
41.步骤40：将步骤30中水浴加热后的半成品阴极贴片用纯水清洗后，空气吹干后进行冷冻干燥，在真空冷冻干燥过程中，由于气压的降低，水分直接升华，变为气体逸出，从而在冻结的气凝胶中形成多个孔洞，形成三维多孔结构，提高了工作电极区域的比表面积，有利于提高反应灵敏度和反应速率；
42.步骤50：向所述第二工作电极22上均匀滴加5μl壳聚糖-戊二醛和葡萄糖氧化酶混合溶液，而后放置在冰箱中-4℃干燥，此处壳聚糖的作用是固定葡萄糖氧化酶，戊二醛是作为壳聚糖的交联剂，用来形成更加致密的壳聚糖凝胶网络，进而更好的固定葡萄糖氧化酶；
43.步骤60：将琼脂糖水凝胶均匀地滴涂覆盖在所述第二工作电极22、第二参比电极23和第二对电极24上，制得阴极贴片2，此处琼脂糖水凝胶的作用是消除反离子电渗提取组织液的过程中对皮肤产生的刺激，同时作为组织液的储存容器和反应电解池。
44.优选的，其中步骤30中含有普鲁士蓝的石墨烯溶液中石墨烯和普鲁士蓝的比例为2:1，其配制方法包括以下步骤：
45.步骤301：称取0.049g k3fe(cn)6溶于1ml纯水中，磁子搅拌10min，然后添加3ml浓度为10mg/ml的还原氧化石墨烯溶液并磁子搅拌1h使其混合均匀；
46.步骤302：称取0.3g抗坏血酸和0.0266g fecl3·
6h2o溶于3.5ml纯水中，超声振荡均匀；
47.步骤303：将步骤302中配制的溶液加入步骤301中配制的溶液中，磁子搅拌10min使其混合均匀，制得含有普鲁士蓝的石墨烯溶液。
48.优选的，其中步骤40中的冷冻干燥是指将半成品阴极贴片在-20℃冷冻48h，冷冻完后取出，放置在冷冻干燥机中在-100℃下冷冻干燥8h。步骤50中的壳聚糖-戊二醛和葡萄
糖氧化酶混合溶液是先将含有10mg/ml牛血清蛋白的30mg/ml葡萄糖氧化酶溶液和壳聚糖溶液按照1:1的比例均匀混合，而后按照1:10的比例将浓度1％的戊二醛溶液添加至上述葡萄糖氧化酶和壳聚糖混合溶液中制成，其中的壳聚糖溶液是通过将0.5wt％壳聚糖溶于0.1m醋酸溶液制得。步骤60中的琼脂糖水凝胶是将4％w/v的琼脂糖溶液在ph＝7.4的10mm磷酸盐缓冲液中连续加热搅拌而成。
49.本实例中，为了构建针对葡萄糖的电化学生物传感器，在第二工作电极22上修饰了含有普鲁士蓝的石墨烯气凝胶结构，并利用壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定在修饰了含有普鲁士蓝的石墨烯气凝胶结构上。当有葡萄糖加入后，葡萄糖会在葡萄糖氧化酶的作用下氧化分解产生过氧化氢，并利用普鲁士蓝对过氧化氢选择性催化还原特性，随着葡萄糖的浓度增加，产生的过氧化氢便会越来越多，恒定电压下，产生的还原电流值越大。因此，不同浓度的葡萄糖便会产生不同的电流信号，进而实现葡萄糖的定量检测。
50.为了确定步骤30中含有普鲁士蓝的石墨烯溶液中石墨烯和普鲁士蓝的最佳配比，通过实验分别配制了石墨烯和普鲁士蓝之比分别为1:1、2:1、4:1的含有普鲁士蓝的石墨烯溶液，将它们分别修饰在第二工作电极上，在-0.7～0.7v电压范围内进行扫速为100v/s循环伏安测试。其结果如图7所示，其中石墨烯和普鲁士蓝之比为2:1的溶液具有最佳的电化学性能。
51.为对上述实施例中生物传感无创血糖检测电极贴片系统的可行性进行验证，如图5、6所示，本发明还设计了一种反离子电渗体外实验装置，包括扩散细胞7、离体猪皮8、导线10、磁力搅拌器9、搅拌子15、电化学工作站16以及无创血糖检测电极贴片，扩散细胞7包括样品池71、进样口72和放置平台73，样品池71设置在磁力搅拌器9上，进样口72与样品池71相连通，样品池71中盛有样品溶液，搅拌子15设置在样品池71中，放置平台73设置在样品池71上，离体猪皮8放置在放置平台73上，阳极贴片1和阴极贴片2贴在离体猪皮8上，电化学工作站16通过导线10与阳极贴片1和阴极贴片2上的引脚5相连接，样品溶液为含有133mm nacl的磷酸盐缓冲液与葡萄糖混合配制而成，添加nacl是为了仿真组织液，使其贴近真实样本。
52.优选的，扩散细胞7用有机玻璃材料制作，具有优异的透明特性，有利于对样品池71中的样品溶液进行观察，保证样品溶液充满整个样品池71，并且有利于对实验过程中样品池71中可能出现的情况进行观察。样品池71和进样口72的连接采用连通器原理，便于在离体猪皮8放置在放置平台73后，添加样品溶液至样品池71中，同时也可保证样品溶液充满整个样品池71。
53.上述反离子电渗体外实验装置的具体工作过程及原理如下：将无创血糖检测电极贴片利用双面胶粘在离体猪皮4上，并将离体猪皮4放置在放置平台33上，将样品溶液5通过进样口32注入样品池31中，并用导线将引脚和电化学工作站9相连，通过电化学工作站9在第一工作电极12和第二工作电极22之间施加恒定电流提取样品溶液5，提取结束后用导线分别将电极引脚和电化学工作站9相连，通过电化学工作站9在第二工作电极22和第二对电极23之间施加恒定电压，并记录收集第二工作电极22和第二对电极23之间产生的电流，确定不同葡萄糖浓度产生的电流值，用于后续检测中葡萄糖浓度的计算。
54.上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发
明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。