一种检测金银花药材中12种有效成分的方法与流程

1.本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种采用液相色谱质谱联用技术对金银花药材中12种有效成分进行定量分析的方法。


背景技术：

2.金银花(lonicera japonica)，又名忍冬。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。自2002年出现的“非典型肺炎”(sars)，到2020年的“新冠肺炎”，中西医结合治疗这种突如其来的致病菌的方案越来越成熟，抗病毒、抗菌的中药材也发挥了显著疗效，而代表药之一就是金银花。药理研究表明，有机酸类是金银花的主要药效物质，其主要包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及异绿原酸a、b、c。绿原酸经提纯后对呼吸道最常见到底合胞病毒、柯萨奇病毒，腺病毒等具有明显的体外抑制作用，对流感病毒3亚型及副流感病毒ⅳ型在一定浓度下也具有体外抑制作用。除此之外，金银花中含有挥发油成分、黄酮类化合物、三萜皂苷类化合物及多糖类成分也具有抗肿瘤、抗氧化等作用。
3.在中国药典2020年版一部金银花药材项下，收载了其主要活性成分的含量测定方法及最低含量要求，其中规定绿原酸含量不得少于1.5％(按干燥品计算，高效液相色谱法测定)，酚酸类总量不得少于3.8％(按干燥品计算，高效液相色谱法测定)，木犀草苷含量不得少于0.05％(按干燥品计算，高效液相色谱法测定)。此方法测定的成分数量有限，且无法对单一酚酸类物质(例如异绿原酸a、b、c)进行单独定量，且检测灵敏度低，检测过程繁琐，并不能适用于大规模的生产实践当中。因此，发展一种快速、准确、灵敏的方法能同时对金银花中药提取物中的多数功效成分进行测定及定量分析，对金银花的药效评价及生产实践均有十分重要的指导意义。


技术实现要素：

4.本发明针对现有方法的不足以及生产实践的需要，采用液相色谱质谱联用技术手段，开发出一种具备准确且能够同时检测金银花中药提取物内12种化合物的方法，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。
5.本发明采用的技术路线如下：
6.一种检测金银花药材中12种有效成分的方法，其先对金银花药材进行蒸煮提取，收集提取液，并对提取液进行液相色谱质谱联用检测，然后提取质谱数据信息与公共数据库中数据信息进行比对鉴定，并进行分析计算，从而准确定量地分析出金银花中药材中的12种有效成分。
7.根据以上方案，所述的对金银花药材进行蒸煮提取是指：称取金银花中药材于离心管中，加入超纯水，涡旋混匀，在沸水浴中蒸煮60min，取上清液，16000rpm离心20min，再次取上清液于进样瓶中，待测。
8.根据以上方案，所述的液相色谱质谱联用检测中，质谱条件如下：
9.esi离子源，正离子模式：喷雾电压(spray voltage)3800v；shealth gas：45psi；辅助气(aux gas)20psi；毛细管温度(capillary temperature)320℃；探头加热器温度(probe heater temp)370℃；采用dda模式检测，扫描范围90～1300m/z；全ms分辨率(full ms resolution)60000；dd-ms2分辨率(dd-ms2 resolution:15000)15000；topn＝10；
10.esi离子源，负离子模式：喷雾电压(spray voltage)-3000v；shealth gas：45psi；辅助气(aux gas)20psi；毛细管温度(capillary temperature)320℃；探头加热器温度(probe heater temp)370℃；采用dda模式检测，扫描范围90～1300m/z；全ms分辨率(full ms resolution)60000；dd-ms2分辨率(dd-ms2 resolution)15000；topn＝10。
11.根据以上方案，所述的液相色谱质谱联用检测中，液相色谱条件如下：
12.acquity uplc色谱仪；waters hss t3色谱柱，1.8μm，2.1mm
×
100mm；柱温40℃；流速为400μl/min；进样量2μl；
13.流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％乙腈溶液；
14.液相梯度：流动相a 流动相b＝100％；0～3min，流动相b从5％线性变化到20％；3～4.3min，流动相b维持在20％；4.3～9min，流动相b从20％线性变化到45％；9～11min，流动相b从45％线性变化到98％；11～15min，流动相b维持在98％；15～15.1min，流动相b从98％线性变化到5％；15.1～18min，流动相b维持在5％。
15.根据以上方案，所述的提取质谱数据信息是指采用thermo xcalibur 3.1.66.10软件提取ms2谱图信息。
16.根据以上方案，所述的进行分析计算是指用xcms软件来进行峰识别与定量积分计算。
17.根据以上方案，所述的12种有效成分是指：绿原酸；新绿原酸；隐绿原酸；獐芽菜苦苷；断氧化马钱子苷；木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷；芦丁；木犀草素-7-o-芸香糖苷；异绿原酸a；异绿原酸b；异绿原酸c；金圣草素-7-o-新橙皮糖苷。
附图说明
18.图1为本发明方法实施例中金银花中药提取物正离子模式下ms检测结果的bpc图谱。
19.图2为本发明方法实施例中金银花中药提取物负离子模式下ms检测结果的bpc图谱。
20.图3为本发明方法实施例中异绿原酸a(3,5-di-o-caffeoylquinic acid)检测结果的质谱图与在respect数据库中的二级谱图比对结果图。
21.图4为本发明方法实施例中异绿原酸b检测结果的质谱图与在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
22.图5为本发明方法实施例中异绿原酸c(4,5-di-o-caffeoylquinic acid)检测结果的质谱图与在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
23.图6为本发明方法实施例中木犀草苷(木犀草素-7-o-葡萄糖苷)检测结果的质谱图与在nist数据库中的二级谱图比对结果图。
24.图7为本发明方法实施例中新绿原酸(neochlorogenic acid)检测结果的质谱图与在respect数据库中的二级谱图比对结果图。
25.图8为本发明方法实施例中隐绿原酸(cryptochlorogenic acid)检测结果的质谱图与在nist数据库中的二级谱图比对结果图。
26.图9为本发明方法实施例中断氧化马钱子苷(secoxyloganin)检测结果的质谱图与在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
27.图10为本发明方法实施例中芦丁检测结果的质谱图与在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
28.图11为本发明方法实施例中獐芽菜苦苷(swertiamarin)检测结果的质谱图与在vf_npl数据库中的二级谱图比对结果图。
29.图12为本发明方法实施例中木犀草素-7-o-芸香糖苷检测结果的质谱图与在vf_npl数据库中的二级谱图比对结果图。
30.图13为本发明方法实施例中金圣草素-7-o-新橙皮糖苷检测结果的质谱图与在nist数据库中的二级谱图比对结果图。
31.图14为本发明方法实施例中绿原酸(chlorogenate)检测结果的质谱图与在nist数据库中的二级谱图比对结果图。
32.附图均为检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
34.主要实验仪器与试剂：
35.实验仪器：
36.色谱仪acquity uplc i-class(waters)；5500qtrap质谱仪(sciex)；色谱柱为waters hss t3，型号为2.1
×
100mm，1.8μm，货号186003539；vanquish flex uhplc超高效液相色谱仪(thermo scientific)；q-exactive hf-x系列质谱仪(thermo scientific)；色谱柱为waters hss t3，型号为2.1
×
100mm，1.8μm，货号186003539；低温高速离心机(eppendorf 5430r)：
37.实验所用试剂列表：
[0038][0039]
一种检测金银花药材中12种有效成分的方法，其先对金银花药材进行蒸煮提取，收集提取液，并对提取液进行液相色谱质谱联用检测，然后提取质谱数据信息与公共数据
库中数据信息进行比对鉴定，并进行分析计算，从而准确定量地分析出金银花中药材中的12种有效成分，具体包括以下步骤：
[0040]
步骤s1，样品制备：取待测样本(金银花中药材)1g于15ml离心管中，加入10ml超纯水，涡旋混匀，在沸水浴中蒸煮60min，取上清液1ml，16000rpm离心20min，再次取上清液于进样瓶中，待测。
[0041]
步骤s2，液相色谱分离：
[0042]
acquity uplc色谱仪；hss t3色谱柱(1.8μm,2.1mm
×
100mm，waters，usa)样本置于4℃自动进样器中，柱温40℃，流速为400μl/min，进样量2μl。
[0043]
流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％乙腈溶液；
[0044]
液相梯度如下：(流动相a 流动相b＝100％)
[0045]
0～3min，流动相b从5％线性变化到20％；
[0046]
3～4.3min，流动相b维持在20％；
[0047]
4.3～9min，流动相b从20％线性变化到45％；
[0048]
9～11min，流动相b从45％线性变化到98％；
[0049]
11～15min，流动相b维持在98％；
[0050]
15～15.1min，流动相b从98％线性变化到5％；
[0051]
15.1～18min，流动相b维持在5％。
[0052]
步骤s3，质谱检测：
[0053]
esi离子源，正离子模式：喷雾电压3800v；shealth gas：45psi；辅助气20psi；毛细管温度320℃；探头加热器温度370℃；采用dda模式检测，扫描范围90～1300m/z；全ms分辨率60000；dd-ms2分辨率15000；topn＝10；
[0054]
esi离子源，负离子模式：喷雾电压-3000v；shealth gas：45psi；辅助气20psi；毛细管温度320℃；探头加热器温度370℃；采用dda模式检测，扫描范围90～1300m/z；全ms分辨率60000；dd-ms2分辨率15000；topn＝10。
[0055]
步骤s4，将质谱数据采用thermo xcalibur 3.1.66.10软件提取ms2谱图信息用于在公共数据库中进行比对鉴定，并用xcms软件来进行峰识别与定量积分。
[0056]
步骤s5，在各个公共数据库中进行谱图比对的方式进行鉴定，一共准确鉴定到了12种金银花中药提取物中的重要活性物质。
[0057]
步骤s6，计算12种金银花中药提取物中的重要活性物质的相对含量。
[0058]
实验结果：
[0059]
金银花中药提取物正/负离子模式下的bpc图谱：
[0060]
如图1～2所示，是本实施例的检测结果的质谱bpc谱图，时间梯度为18min，色谱峰型分离度较好，基线正常，质谱响应较好。
[0061]
金银花中药提取物中12个化合物的谱图匹配结果：
[0062]
将本实施例检测结果的质谱图在otcml、respect、nist和vf_npl 4个公共数据库中进行检索，12个化合物均能正确匹配，且相似度得分(similarity score)均大于0.7，鉴定结果可靠，具体每种化合物的质谱图匹配结果见图3～14。
[0063]
金银花中药提取物中12种化合物的相对定量结果如下：
[0064][0065][0066]
检测结果表明，金银花中药提取物中的12种活性成分在质谱中的响应良好，峰面积积分值均大于5e6，表明该实验方法提取物质全面，色谱分离良好，灵敏度高，方法稳定可靠。
[0067]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。