基于LC-MSMS技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法与流程

基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法
技术领域
1.本发明属于胆汁酸物质检测技术领域，具体涉及一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质同时定量分析的方法。


背景技术：

2.胆汁酸是胆汁的重要成分，按结构可分为两大类，一类是游离型胆汁酸，包括胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)和石胆酸(lca)；另一类是结合型胆汁酸，包括甘氨熊去氧胆酸(gudca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)。它们在胆固醇和脂质代谢中起关键作用，是临床上检测肝胆功能正常与否的重要标志物。
3.在传统的临床检测中，一般使用生化免疫技术对总胆汁酸进行测定。由于不同结构的胆汁酸有着不同的生理特性，因此对每一种胆汁酸准确定量变得十分有必要，同时，lc-ms/ms方法在检测灵敏度、方法特异性等方面有超过传统方法的优势。现有技术cn113009061a报道了一种高效液相串联质谱法检测15种胆汁酸的方法，该方法不能够使15种化合物实现完全分离。


技术实现要素：

4.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法，其前处理步骤简单快捷，检测准确且可以使15种胆汁酸完全分离，具有便捷、快速和准确的优点。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法，先对待测样本进行液相色谱串联质谱检测的前处理，前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析人血液成分中15种胆汁酸；所述的液相色谱串联质谱检测中，质谱采用多反应监测，化合物mrm参数如下：
7.[0008][0009]
所述的质谱是三重四级杆串联质谱。
[0010]
根据以上方案，所述的15种胆汁酸是胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)、石胆酸(lca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨石胆酸(glca)和牛磺石胆酸(tlca)。
[0011]
根据以上方案，所述的一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法包括以下详细步骤：
[0012]
步骤s1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0013]
步骤s2，向待测样本加入内标工作液，涡旋混合；
[0014]
步骤s3，取步骤s2中混合好的各样本进行离心，离心后取上清液加入纯水复溶，再进行lc-ms/ms分析。
[0015]
根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
[0016]
分析柱：phenomenex kinetex c18 100a 2.6μm,100x3mm；
[0017]
流动相：a相：含5mm乙酸铵的水溶液；b相：含5mm乙酸铵的95％乙腈水溶液；
[0018]
洗脱梯度：
[0019]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.3070303.806238
8.5062389.00010011.0010011.517030127030
[0020]
流速：0.4ml/min；柱温：40℃。
[0021]
根据以上方案，所述的质谱条件如下：
[0022]
电离方式：点喷雾电离负离子模式(esi-)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：500℃；雾化气(gs1)：50psi；辅助气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：25psi；电喷雾电压(is)：-4500v；碰撞气(cad)：8。
[0023]
本发明的有益效果是：本发明提供的定量分析方法具有操作简单，前处理耗时短，可以实现15种胆汁酸完全分离并准确定量的优点。
附图说明
[0024]
图1是实施例中石胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0025]
图2是实施例中鹅去氧胆酸、去氧胆酸和熊去氧胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0026]
图3是实施例中胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0027]
图4是实施例中甘氨石胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0028]
图5是实施例中甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸和甘氨熊去氧胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0029]
图6是实施例中甘氨胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0030]
图7是实施例中牛磺石胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0031]
图8是实施例中牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0032]
图9是实施例中牛磺胆酸的液相色谱-串联质谱分析结果图谱。
[0033]
以上附图均为lc-ms/ms检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
[0035]
一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法，先对待测样本进行液相色谱串联质谱检测的前处理，前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析人血液成分中15种胆汁酸，包括胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)、石胆酸(lca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨石胆酸(glca)和牛磺石胆酸(tlca)，
包括以下详细步骤：
[0036]
步骤s1，配制系列浓度的校准品(标准品)溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0037]
步骤s11,标准品储备液的配制：
[0038]
分别准确称量胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)、石胆酸(lca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)使用纯甲醇溶解，得到各自浓度为10mm/l得标准品储备液。
[0039]
步骤s12,标准品混合储备液的配制：
[0040]
使用移液器准确移取步骤s11配制的各化合物的标准品储备液，加入纯甲醇溶液，将各胆汁酸标准品混合均匀，配制得到15种胆汁酸标准品混合储备液，其中鹅去氧胆酸(cdca)、胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、熊去氧胆酸(udca)浓度为500μm/l；
[0041]
甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)浓度为100μm/l。
[0042]
步骤s13，内标储备液的配制：
[0043]
分别准确称量甘氨熊去氧胆酸-d5(gudca-d5)、甘氨鹅去氧胆酸-d7(gcdca-d7)、甘氨去氧胆酸-d5(gdca-d5)、牛磺熊去氧胆酸-d4(tudca-d4)、牛磺鹅去氧胆酸-d5(tcdca-d5)、牛磺去氧胆酸-d4(tdca-d4)、熊去氧胆酸-d4(udca-d4)、鹅去氧胆酸-d4(cdca-d4)、去氧胆酸-d5(dca-d5)、甘氨胆酸-d5(gca-d5)、牛磺胆酸-d8(tca-d8)、胆酸-d5(ca-d5)、甘氨石胆酸-d4(glca-d4)、石胆酸-d4(lca-d4)和牛磺石胆酸-d5(tlca-d5)，并使用纯甲醇溶解，得到各自浓度为5mm/l的内标储备液。
[0044]
步骤s14，标准曲线工作液及质控工作液的配制：
[0045]
标准曲线工作液：使用纯甲醇稀释步骤s12中的标准品混合储备液得到混合标准品工作液，其中鹅去氧胆酸(cdca)、胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、熊去氧胆酸(udca)标准曲线工作液各点浓度为1μm/l，2μm/l，4μm/l，10μm/l，30μm/l，60μm/l，100μm/l，200μm/l；甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)各点浓度为0.2μm/l，0.4μm/l，0.8μm/l，2μm/l，6μm/l，12μm/l，20μm/l，40μm/l；
[0046]
质控工作液：使用纯甲醇稀释步骤s12中的标准品混合储备液得到质控工作液，其中，鹅去氧胆酸(cdca)、胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、熊去氧胆酸(udca)质控工作液各点浓度为3μm/l，50μm/l，75μm/l；
[0047]
甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)各点浓度为0.6μm/l，10μm/l，15μm/l。
[0048]
步骤s15，内标工作液的配制：
[0049]
使用纯乙腈稀释步骤s13中的内标储备液，得到内标工作液，浓度如下：
[0050][0051][0052]
步骤s16,标准曲线样本及质控品的配制：
[0053]
对于标准曲线样本，使用1％bsa作为替代基质，按照20倍稀释步骤s14中获得的标准品工作液得到标准曲线样本，鹅去氧胆酸(cdca)、胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、熊去氧胆酸(udca)标准曲线各点浓度为0.05μm/l，0.1μm/l，0.2μm/l，0.5μm/l，1.5μm/l，3μm/l，5μm/l，10μm/l；
[0054]
甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)标准曲线各点浓度为0.01μm/l，0.02μm/l，0.04μm/l，0.1μm/l，0.3μm/l，0.6μm/l，1μm/l，2μm/l。
[0055]
对于质控品，将20人份的人血清制混合血浆，分成三份作为基质，按照20倍稀释步骤s14中获得的质控工作液得到质控品，鹅去氧胆酸(cdca)、胆酸(ca)、去氧胆酸(dca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、熊去氧胆酸(udca)质控品各点0.15μm/l，2.5μm/l，3.75μm/l。
[0056]
甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)各质控点浓度0.03μm/l，0.5μm/l，0.75μm/l。
[0057]
步骤s21收集待测血清样本,取待测血液至少1ml，血液凝结后，在3000rpm下离心15min，分离得到上清液血清，即待测血清样本；
[0058]
步骤s22,用移液器移取80μl待测血清样本于96孔板中，加入200μl内标工作液，混合震荡5min。
[0059]
步骤s3，取步骤s22中混合好的各样本及各标准曲线样本、质控品在4000rpm的条件下离心10min，取上清液50μl移至新得96孔板，然后加入100μl纯水复溶，再进行lc-ms/ms分析。
[0060]
所述的液相色谱的条件如下：
[0061]
分析柱：phenomenex kinetex c18 100a 2.6μm,100x3 mm；
[0062]
流动相：a相：含5mm乙酸铵的水溶液；b相：含5mm乙酸铵的95％乙腈水溶液；
[0063]
洗脱梯度：
[0064]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.3070303.8062388.5062389.00010011.0010011.517030127030
[0065]
流速：0.4ml/min；柱温：40℃。
[0066]
所述的质谱条件如下：
[0067]
电离方式：点喷雾电离负离子模式(esi-)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：500℃；雾化气(gs1)：50psi；辅助气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：25psi；电喷雾电压(is)：-4500v；碰撞气(cad)：8，化合物mrm参数如下：
[0068]
[0069][0070]
使用高效液相色谱三重四极杆质谱对上述溶液进行检测，如附图1-9所示通过标准品与内标峰面积比值拟合得到标准曲线方程，并计算出待测标准品的浓度。
[0071]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。