包含线粒体的雾化组合物及其使用方法与流程

包含线粒体的雾化组合物及其使用方法
1.要求优先权
2.本技术要求于2019年4月15日提交的美国临时申请no.62/834,020的权益。前述申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及含有线粒体的雾化组合物、制备和使用该组合物的方法，以及用于给药该组合物的装置。


背景技术：

4.线粒体是在有核真核细胞的细胞质中存在的双膜结合细胞器。除红细胞外，它们几乎存在于人体的每个细胞中。它们是细胞能量代谢的主要部位并且生成用于不同细胞功能的三磷酸腺苷(atp)。通常，超过90％的细胞对atp的需求由细胞自身的线粒体供应。
5.线粒体由两个具有特殊功能的同心膜构成。线粒体内膜含有用于atp合酶的蛋白质。含有大量整合膜蛋白的线粒体外膜包围着整个细胞器。
6.线粒体的结构与一些近代原核生物具有惊人的相似之处。事实上，认为线粒体起源于有核细胞吞噬需氧原核生物时的古老共生现象。在共生关系中，宿主细胞依靠被吞噬的原核生物产生能量，并且原核生物细胞开始依靠宿主细胞提供的保护环境。
7.由于线粒体在细胞代谢中的主要功能，线粒体的损伤和功能障碍可引起一系列人类疾病。线粒体的损伤可能由损伤、毒性、化疗和年龄相关的变化引起。特别地，缺血/再灌注损伤可引起线粒体损伤，其将对氧消耗和能量合成具有负面影响。涉及线粒体的治疗可特别用于线粒体相关障碍。一些早期治疗涉及通过肌内注射和动脉内注射给药线粒体。出于各种目的，需要通过不同的给药途径将线粒体给药于受试者的各种靶部位。


技术实现要素：

8.本公开提供了含有线粒体的组合物(例如雾化组合物)、制备和使用该组合物的方法，以及用于给药该组合物的装置。在一个方面，本公开提供了通过呼吸道给药含有线粒体或组合的线粒体试剂的组合物的方法。在一些实施方案中，组合物为雾化组合物。在一些实施方案中，组合物为液体溶液。
9.在一个方面，本公开涉及一种治疗患有呼吸障碍的受试者的方法，该方法包括通过呼吸道向受试者给药包含治疗有效量的线粒体的组合物。
10.在一些实施方案中，组合物为雾化组合物。在一些实施方案中，通过使用雾化器、气化器、鼻用喷雾器、压力定量吸入器、或呼吸激活压力定量吸入器，将组合物在给药于受试者之前转化成气雾剂形式。
11.在一些实施方案中，组合物的气雾剂形式包含具有0.01至1000微升(例如，0.1至1000微升、1至1000微升、0.1至100微升、0.1至500微升、或1至500微升)的中值尺寸的微滴。在一些实施方案中，微滴具有至少0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000微升的尺寸。在一些实施方案中，微滴具有小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000微升的尺寸。
12.在一些实施方案中，组合物包含有呼吸能力的(respiration
‑
competent)线粒体。
13.在一些实施方案中，受试者患有呼吸衰竭、呼吸功能降低、肺部炎症、肺癌、皮肤皱纹、秃发和/或癌症。在一些实施方案中，受试者患有急性肺损伤。
14.在一些实施方案中，组合物中线粒体的浓度为约1
×
104至5
×
109ml
‑1(例如，约1
×
105至5
×
108ml
‑1、1
×
106至5
×
108ml
‑1、1
×
107至5
×
108ml
‑1、1
×
105至1
×
108ml
‑1、1
×
106至1
×
108ml
‑1、1
×
107至1
×
108ml
‑1、1
×
106至5
×
107ml
‑1、1
×
106至1
×
107ml
‑1、1
×
106至5
×
107ml
‑1、5
×
106至1
×
108ml
‑1)。在一些实施方案中，浓度为至少或约1
×
104ml
‑1、5
×
104ml
‑1、1
×
105ml
‑1、5
×
105ml
‑1、1
×
106ml
‑1、5
×
106ml
‑1、1
×
107ml
‑1、5
×
107ml
‑1、1
×
108ml
‑1、5
×
108ml
‑1、或1
×
109ml
‑1、5
×
109ml
‑1、或1
×
10
10
ml
‑1。在一些实施方案中，浓度为小于1
×
104ml
‑1、5
×
104ml
‑1、1
×
105ml
‑1、5
×
105ml
‑1、1
×
106ml
‑1、5
×
106ml
‑1、1
×
107ml
‑1、5
×
107ml
‑1、1
×
108ml
‑1、5
×
108ml
‑1、或1
×
109ml
‑1、5
×
109ml
‑1、或1
×
10
10
ml
‑1。
15.在一些实施方案中，受试者被给药每剂1
×
105至1
×
109个线粒体(例如，每剂1
×
105至5
×
108、1
×
106至5
×
108、1
×
107至5
×
108、1
×
105至1
×
108、1
×
106至1
×
108、1
×
107至1
×
108、1
×
106至5
×
107、1
×
106至1
×
107、1
×
106至5
×
107、5
×
106至1
×
108个线粒体)。在一些实施方案中，剂量为每剂至少1
×
104、5
×
104、1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、或1
×
109、5
×
109、或1
×
10
10
个线粒体。在一些实施方案中，剂量为每剂小于1
×
104、5
×
104、1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、或1
×
109、5
×
109、或1
×
10
10
个线粒体。
16.在一些实施方案中，线粒体是自体的、同种异体的、或异种的。
17.在一些实施方案中，组合物还包含选自以下的溶液：ph为7至8的k

‑
hepes、盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、血清和血浆。
18.在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自以下的渗压剂(osmolyte)：海藻糖、蔗糖、甘露糖、甘氨酸、脯氨酸、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、甜菜碱和肌氨酸。
19.在一些实施方案中，组合物还包含药剂。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂、或载体。
20.在一些实施方案中，组合物还包含治疗剂或诊断剂，其中治疗剂或诊断剂通过共价键与线粒体连接，包埋在线粒体中，或者内化在线粒体内。在一些实施方案中，治疗剂或诊断剂为治疗性诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂或诊断剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗剂或诊断剂通过共价键与线粒体连接。
21.在一些实施方案中，治疗剂或诊断剂包埋在线粒体中或者内化在线粒体内。
22.在一些实施方案中，线粒体是经基因修饰的。
23.在一些实施方案中，线粒体包含外源多肽。
24.在一些实施方案中，线粒体包含外源多核苷酸、dna、rna、mrna、微小rna、核rna、或sirna。
25.在一个方面，本公开涉及一种雾化组合物，该雾化组合物包含：多个包含缓冲液的液滴，其中多个液滴中的至少一个液滴包含至少一个线粒体。
26.在一些实施方案中，缓冲液选自：ph为7至8的k
‑
hepes、盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、血清和血浆。
27.在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自以下的渗压剂：海藻糖、蔗糖、甘露糖、甘氨酸、脯氨酸、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、甜菜碱和肌氨酸。
28.在一些实施方案中，组合物还包含药剂。
29.在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂、或载体。
30.在一些实施方案中，组合物还包含治疗剂或诊断剂，其中治疗剂或诊断剂通过共价键与线粒体连接，包埋在线粒体中，或者内化在线粒体内。
31.在一些实施方案中，线粒体试剂选自治疗剂、化疗剂、或诊断剂。
32.在一些实施方案中，线粒体试剂包括抗体或抗原结合片段。
33.在一些实施方案中，线粒体试剂通过共价键与线粒体连接。在一些实施方案中，线粒体试剂包埋在线粒体中或者内化在线粒体内。
34.在一些实施方案中，多个微滴具有1至1000微升的中值尺寸。
35.在一些实施方案中，线粒体是经基因修饰的。
36.在一些实施方案中，线粒体包含外源多肽。
37.在一些实施方案中，线粒体包含外源多核苷酸。
38.在一些实施方案中，将线粒体在给药于受试者之前与包含酶的组合物一起孵育。
39.在一些实施方案中，组合物包含自体线粒体、同种异体线粒体、异种线粒体、或它们的混合物。
40.在一个方面，本公开涉及一种用于通过呼吸道向受试者递送线粒体的装置，该装置包括：壳体；用于包含线粒体的组合物的贮存器，其设置在壳体内；气雾剂发生器，以产生组合物的气雾剂形式；以及出口，组合物通过该出口递送至受试者的呼吸道。
41.在一些实施方案中，装置是雾化器、鼻用喷雾器、或吸入器。在一些实施方案中，气雾剂发生器是超声波雾化器。
42.在一些实施方案中，气雾剂发生器是振网筛装置。在一些实施方案中，气雾剂发生器包括空气压缩机，其中空气压缩机使得压缩空气流经组合物，并且使组合物转变为气雾剂形式。
43.在一个方面，本公开提供了用于通过呼吸道向受试者递送线粒体的装置；该装置包括：壳体；包含线粒体的组合物，其设置在壳体内；以及出口，其被构造成将组合物从壳体递送至受试者的呼吸道，并且在组合物通过该出口时使组合物雾化。
44.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是示例性的，而非旨在进行限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均全文以引用方式并入。如发生矛盾，以本说明书及其所包括的定义为准。
45.根据以下具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
46.图1是显示分离线粒体的方法的示意图。
47.图2a是使用活检穿孔器获得的骨骼肌组织。
48.图2b是在相衬照明(明视野，bf)下(左图)、在用mitotracker red cmxros标记的荧光下(中图)，以及合并图像(右图)的分离线粒体的显微图像。
49.图2c是显示每克组织湿重的线粒体产量的结果的曲线图。
50.图2d是分离线粒体的透射电子显微镜图像。
51.图2e是显示线粒体复合物i
‑
v的活性测定结果的条形图。
52.图2f是显示状态3(活性)氧消耗(adp刺激的呼吸)的结果的条形图。
53.图2g是显示来自胸大肌的自体线粒体中的苹果酸盐诱导的(复合物i)和琥珀酸盐诱导的(复合物ii)氧消耗的呼吸控制指数(rci；状态3/状态4)的结果的条形图。
54.图3a是显示位于心肌细胞内的移植线粒体的覆盖显微镜图像。
55.图3b是显示位于心肌细胞内的移植线粒体的覆盖显微镜图像。
56.图3c是显示位于心肌细胞内的移植线粒体的覆盖显微镜图像。
57.图3d是显示位于心肌细胞内的移植线粒体的覆盖显微镜图像。
58.图4a是显示通过给药
18
f罗丹明6
‑
g线粒体(6
×
107个)的大鼠的正电子发射断层显像(pet)获得的代表性断层图像的图像，该线粒体通过肺动脉经血管输注递送至肺。
59.图4b是显示通过给药
18
f罗丹明6
‑
g线粒体(6
×
107个)的大鼠的pet获得的代表性冠状面图像的图像，该线粒体通过肺动脉经血管输注递送至肺。
60.图4c是显示通过给药
18
f罗丹明6
‑
g线粒体(6
×
107个)的大鼠的pet获得的代表性肺部图像的图像，该线粒体通过肺动脉经血管输注递送至肺。
61.图5a是通过雾化器给药外源线粒体后小鼠肺组织的免疫组织化学染色的图像。
62.图5b是通过肺动脉给药外源线粒体后小鼠肺组织的免疫组织化学染色的图像。
63.图6是在左肺的2小时急性肺损伤(ali)缺血和24小时恢复后的小鼠肺部的图像。红色圆圈指示经受ali程序的肺部。右肺以r指示，左肺以l指示。心脏(h)显示在中间。
64.图7a是显示在24小时恢复后经受过2小时左肺缺血的小鼠肺部中的肺阻力(n＝4)的条形图。媒介物或线粒体通过左肺动脉(v)经血管内或者通过雾化器(n)递送。
65.图7b是显示在24小时恢复后经受过2小时左肺缺血的小鼠肺部中的弹性的条形图。媒介物或线粒体通过左肺动脉(v)经血管内或者通过雾化器(n)递送。
66.图8a是显示通过实时pcr对仅接受呼吸缓冲液(假手术(sham))或线粒体(呼吸缓冲液中3
×
107个线粒体)的balb/cj小鼠中的全血样本测定的循环游离mtdna的量化的条形图。
67.图8b是苏木精和伊红染色的肺组织的图像。
68.图8c是masson的三色染色的肺组织的图像。
69.图8d是来自右下叶的肺组织的透射电子显微镜的图像。
70.图9a是显示线粒体摄取和生物分布的量化的图像。经由注射到肺动脉干而递送至wistar大鼠肺部的
18
f
‑
罗丹明6g标记的线粒体(1
×
109个)的pet
‑
microct成像。
71.图9b是显示线粒体摄取和生物分布的量化的图像。经由雾化作为气雾剂递送至wistar大鼠肺部的
18
f
‑
罗丹明6g标记的线粒体(1
×
109个)的pet
‑
microct成像。
72.图10a是免疫组织化学图像(100
×
)，其展示了来自人心脏成纤维细胞的外源线粒体，该外源线粒体经由血管递送被吸收在肺组织中进行递送。
73.图10b是免疫组织化学图像(100
×
)，其展示了来自人心脏成纤维细胞的外源线粒体，该外源线粒体经由雾化被吸收在肺组织中进行递送。
74.图11a是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的动态顺应性的肺功能分析结果的条形图。
75.图11b是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的阻力的肺功能分析结果的条形图。
76.图11c是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的组织阻尼的肺功能分析结果的条形图。
77.图11d是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的深吸气量的肺功能分析结果的条形图。
78.图11e是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的吸气峰压的肺功能分析结果的条形图。
79.图12a显示经由雾化接受线粒体的肺部的动态顺应性的肺功能分析结果。
80.图12b是显示经由雾化接受线粒体的肺部的阻力的肺功能分析结果的条形图。
81.图12c是显示经由雾化接受线粒体的肺部的组织阻尼的肺功能分析结果的条形图。
82.图12d是显示经由雾化接受线粒体的肺部的深吸气量的肺功能分析结果的条形图。
83.图12e是显示经由雾化接受线粒体的肺部的吸气峰压的肺功能分析结果的条形图。
84.图13显示肺功能分析的结果，特别是代表性压力
‑
容量环。
85.图14a是显示经由血管递送接受媒介物的肺部的肺组织切片的苏木精和伊红(h&e)、髓过氧化物酶染色(mpo)、tunel和透射电子显微镜(em)图像的图像；比例尺：500μm。
86.图14b是显示经由血管递送接受线粒体的肺部的肺组织切片的苏木精和伊红(h&e)、髓过氧化物酶染色(mpo)、tunel和透射电子显微镜(em)图像的图像；比例尺：500μm。
87.图14c是显示经由雾化接受媒介物的肺部的肺组织切片的苏木精和伊红(h&e)、髓过氧化物酶染色(mpo)、tunel和透射电子显微镜(em)图像的图像；比例尺：500μm。
88.图14d是显示经由雾化接受线粒体的肺部的肺组织切片的苏木精和伊红(h&e)、髓过氧化物酶染色(mpo)、tunel和透射电子显微镜(em)图像的图像；比例尺：500μm。
89.图14e是显示假手术组的肺组织切片的苏木精和伊红(h&e)、髓过氧化物酶染色(mpo)、tunel和透射电子显微镜(em)图像的图像；比例尺：500μm。
90.图15a是显示接受经由血管递送的媒介物(媒介物v)、经由血管递送的线粒体(mito v)和假手术组的肺部在再灌注24小时的肺组织损伤的严重程度的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
91.图15b是显示接受经由血管递送的媒介物(媒介物v)、经由血管递送的线粒体(mito v)和假手术组的肺部在再灌注24小时的嗜中性粒细胞计数的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
92.图15c是显示接受经由血管递送的媒介物(媒介物v)、经由血管递送的线粒体(mito v)和假手术组的肺部在再灌注24小时的tunel标记的细胞核/100个细胞核的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
93.图15d是显示接受经由雾化的媒介物(媒介物neb)、经由血管递送的线粒体(mito neb)和假手术组的肺部在再灌注24小时的肺组织损伤的严重程度的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
94.图15e是显示接受经由雾化的媒介物(媒介物neb)、经由血管递送的线粒体(mito neb)和假手术组的肺部在再灌注24小时的嗜中性粒细胞计数的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
95.图15f是显示接受经由雾化的媒介物(媒介物neb)、经由血管递送的线粒体(mito neb)和假手术组的肺部在再灌注24小时的tunel标记的细胞核/100个细胞核的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
96.图15g是显示接受经由血管递送的媒介物(媒介物v)、经由血管递送的线粒体(mito v)、经由雾化的媒介物(媒介物neb)、经由血管递送的线粒体(mito neb)和假手术组的肺部在再灌注24小时的湿重与干重比率的百分比的条形图。在缺血2小时和再灌注24小时后，使用前述评分系统评价h&e染色的切片(15
×
)的肺损伤严重程度；组织损伤越严重，评分越高(1
‑
5)。组织损伤的严重程度分析显示，与媒介物v和媒介物neb相比，炎性细胞浸润和间质充血在mito v和mito neb肺中显著减少，且无肺结构破坏的迹象。
97.图16显示来自bal细胞因子分析的定量结果；所有值表示为平均值
±
sem。对于所有组，n＝4。
具体实施方式
98.本公开涉及含有线粒体(例如，有活力和功能性的线粒体)的组合物、制备和使用该组合物的方法，以及用于将组合物给药于受试者的呼吸道的装置。本公开显示出线粒体
可通过呼吸道有效地给药于受试者，并且向呼吸道递送包含线粒体的组合物的雾化形式意料不到地与动脉内给药一样有效。
99.本公开也提供了可安全且可靠地生成包含有活力和功能性线粒体的药物组合物的方法。如本文所述的药物组合物可具有每治疗剂量增加的治疗价值、增加的商业价值以及较低的生产成本。
100.在一个方面，本公开提供了将线粒体或组合的线粒体试剂递送至呼吸道衬里层细胞和周围细胞的方法。此类药物组合物可被细胞吸收，并且一旦定位于细胞内，线粒体就能够赋予一种或多种生物效应。这些生物效应包括但不限于通过呼吸为细胞产生能量，产生atp(即，adp转化为atp)，调节细胞代谢，启动柠檬酸循环或克氏(krebs)循环，产生热，储存钙离子，通过线粒体活性氧物类的信号传导，调节膜电位，诱导细胞凋亡
‑
程序性细胞死亡，参与钙信号传导(例如，钙诱发的细胞凋亡)，合成血红素和/或类固醇，以及启动激素信号传导等。
101.雾化组合物
102.本公开提供了包含分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂的雾化组合物。本公开显示出雾化组合物中或气雾剂形式的细胞器(例如线粒体)可保持活力和功能性，并因此可有效地给药于受试者的呼吸道。
103.如本文所用，术语“气雾剂”是指细微颗粒或微滴在载气中的悬浮体。如本文所用，术语“雾化”是指使组合物转化成气雾剂形式的过程或行为。雾化组合物包含多个颗粒(例如，微滴、固体颗粒、液滴、或水凝胶颗粒)。在一些实施方案中，颗粒具有约或小于500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、或1000μm的尺寸(例如直径)。在一些实施方案中，颗粒具有约或大于500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、或1000μm的尺寸(例如直径)。在一些实施方案中，颗粒具有500nm至10μm、500nm至100μm、1μm至10μm、1μm至100μm、5μm至100μm、10μm至100μm、或1μm至500μm的尺寸(例如直径)。如本文所用，术语“直径”是指两个端点均位于颗粒表面的最长直线段的长度。
104.在一些实施方案中，雾化组合物包含具有不同尺寸的颗粒(例如微滴)。在一些实施方案中，约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的颗粒为500nm至10μm、500nm至100μm、1μm至10μm、1μm至100μm、5μm至100μm、10μm至100μm、或1μm至500μm。
105.在一些实施方案中，雾化组合物中的颗粒可具有约或小于500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、或1000μm的中值尺寸(例如中值直径)。在一些实施方案中，颗粒可具有约或大于500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、或1000μm的中值尺寸(例如中值直径)。在一些实施方案中，颗粒可具有500nm至10μm、500nm至100μm、1μm至10μm、1μm至100μm、5μm至100μm、10μm至100μm、或1μm至500μm的中值尺寸(例
如中值直径)。如本文所用，术语“中值尺寸”是指如以体积为基础确定的中值尺寸(例如直径)。在使用术语中值尺寸的情况下，应理解描述了将群体分成两半的粒度，使得在体积基础上50％的群体大于或小于该尺寸。
106.雾化组合物可通过本领域已知的各种装置来制备。可在给药前使组合物转化成气雾剂形式的示例性装置包括例如雾化器、气化器、鼻用喷雾器、吸入器、软雾吸入器、喷射式喷雾器、超声波雾化器、压力定量吸入器、呼吸激活压力定量吸入器、或振网筛装置。这些装置可使用各种载气，包括例如氧气、空气、氮气、或压缩空气。
107.雾化前的组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以包括可用于有利于线粒体和/或组合的线粒体试剂的储存、稳定性、给药、细胞靶向和/或递送的化合物或组合物。药学上可接受的载体包括但不限于合适的媒介物、稀释剂、溶剂、赋形剂、ph调节剂、渗压剂、盐、着色剂、流变改性剂、润滑剂、包衣、填充剂、消泡剂、聚合物、水凝胶、表面活性剂、乳化剂、佐剂、防腐剂、磷脂、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯及它们的衍生物、蜡、油和水。在一些实施方案中，分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂悬浮于水、盐水、缓冲液、呼吸缓冲液、或无菌线粒体缓冲液中以用于体内递送。药学上可接受的盐、缓冲液或缓冲液体系(包括但不限于盐水、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或呼吸缓冲液)可包括在本文所述的组合物中。具有有利于体内递送至细胞的能力的媒介物，如脂质体，可用于有利于线粒体或组合的线粒体试剂向靶细胞的递送。
108.示例性缓冲液包括但不限于呼吸缓冲液(例如，250mmol/l蔗糖、20mmol/l k
‑
hepes缓冲液，ph 7.2、0.5mmol/l k
‑
egta，ph 8.0)。示例性渗压剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、甘露糖、甘氨酸、脯氨酸、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、甜菜碱和肌氨酸。
109.分离的线粒体和组合的线粒体试剂
110.用于本发明所述的方法的线粒体可从任何来源分离或提供，例如从培养的细胞或组织中分离。示例性的细胞包括但不限于肌肉组织细胞、心脏成纤维细胞、培养的细胞、hela细胞、前列腺癌细胞、酵母、血细胞、培养的细胞等等，以及它们的任何混合物。示例性组织包括但不限于肝组织、骨骼肌、心脏、脑部、血液和脂肪组织(例如褐色脂肪组织)。线粒体可从自体来源、同种异体来源和/或异种来源的细胞中分离。在一些情况下，线粒体从具有基因修饰的细胞，例如具有经修饰mtdna或经修饰核dna的细胞中分离。
111.线粒体可通过本领域的技术人员已知的方法从细胞或组织中分离。在一些实施方案中，收集组织样本或细胞样本，然后均质化。在均质化后，通过重复离心来分离线粒体。另选地，可通过尼龙网过滤器来过滤细胞匀浆。分离线粒体的典型方法描述于例如mccully等人,injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection,am j physiol 296,h94
‑
h105.pmc2637784(2009)；frezza等人,organelle isolation:functional mitochondria from mouse liver,muscle and cultured filroblasts.nature protocols,2(2),287
‑
295(2007)；us20180057610；和us20180057610a1；其各自以引用方式并入。
112.用于治疗的线粒体可以从自体来源、同种异体来源和异种来源的细胞或组织中分离。在一些情况下，从受试者的培养的细胞或组织中收集线粒体，并将这些线粒体给药回同一受试者。在一些其他情况下，从第二受试者的培养的细胞或组织中收集线粒体，并将这些线粒体给药于第一受试者。在一些情况下，从来自不同物种(例如小鼠、猪、酵母)的培养的
细胞或组织中收集线粒体。
113.本公开也提供了包含组合的线粒体试剂的组合物。组合的线粒体试剂包括例如与如治疗剂、诊断剂和/或显像剂的试剂物理联合(physically associated)的线粒体。
114.治疗剂可为具有治疗或预防用途的任何试剂。示例性治疗剂包括例如用于缺血相关障碍的治疗剂、用于治疗癌症的细胞毒素剂等等。在一些情况下，线粒体可将治疗剂递送至特定细胞，例如肿瘤细胞。治疗剂可为例如细胞内抑制剂、减活化剂、毒素、阻滞物质和/或细胞生长抑制/细胞毒性物质，一旦在细胞内，它们就抑制、破坏、阻滞、修饰和/或改变细胞，使得其不再正常发挥功能和/或存活。治疗剂可为恢复细胞的适当功能的试剂，例如用于基因疗法的dna载体。治疗剂可为例如无机或有机化合物；小分子(小于500道尔顿)或大分子；蛋白质分子，如肽、多肽、蛋白质、翻译后修饰蛋白质、或抗体；或核酸分子，如双链dna、单链dna、双链rna、单链rna、或三螺旋核酸分子。在一些实施方案中，治疗剂可为源自任何已知生物体(例如，动物、植物、细菌、真菌、原生生物、或病毒)或合成分子库的天然产物。在一些实施方案中，治疗剂可为单体或聚合化合物。一些示例性治疗剂包括细胞毒素剂、dna载体、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、反应性肽、纳米颗粒、微球和荧光分子。
115.诊断剂是具有诊断用途的试剂。在一些实施方案中，当线粒体携载诊断剂进入细胞时，诊断剂可被设计成确定细胞内的状况，例如细胞内的ph和氧化应激。
116.显像剂是用于在成像技术中使用的试剂。技术或形式包括但不限于x射线、计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)、闪烁扫描术、荧光、超声等。显像剂可为荧光的和/或放射性的。在一些实施方案中，显像剂也可为诊断剂。示例性显像剂包括但不限于mitotracker荧光团(thermo fisher scientific inc.)、rfp、bacmam 2.0(thermo fisher scientific inc.)、ph敏感性phrodo荧光染料(thermo fisher scientific inc.)、
18
f
‑
罗丹明6g、
18
f标记的罗丹明b、磁性氧化铁纳米颗粒以及基于金和铂的纳米颗粒。
117.如上所讨论，组合的线粒体试剂包含彼此直接和/或间接物理接触的线粒体和试剂。例如，试剂可以与线粒体连接，附着于线粒体，包埋在线粒体膜中，或者完全或部分包封在线粒体中。在一些情况下，药剂可以与线粒体共价连接。在一些情况下，试剂通过共价键(例如，羧酰胺键和二硫键)直接地，或者通过接头(例如，肽接头)或另一共价键合的试剂间接地与线粒体膜的成分连接。在其他情况下，例如，通过疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用和/或静电相互作用等，试剂可以与线粒体非共价地连接。
118.在一些实施方案中，组合的线粒体试剂可包含两种或更多种不同类型的试剂，例如，两种不同种类的治疗剂、三种不同种类的显像剂、一种治疗剂和一种显像剂、治疗剂和诊断剂等。熟练的从业者将理解，任何变化都是可能的。
119.一种特别可用的连接线粒体与试剂的接头提供了注射后试剂的持续释放。这可例如使用腙官能团来实现。例如，形成腙以使试剂与线粒体膜上的成分共价结合。一旦该组合的线粒体试剂被细胞吸收，ph的变化将导致腙水解，从而在细胞内释放结合的试剂。
120.在一些实施方案中，利用功能化表面化学，治疗剂、诊断剂和/或显像剂可以与线粒体外膜连接。在一些情况下，异双功能化学可以使治疗剂、诊断剂和/或显像剂连接至线粒体表面，并且一旦它们被内化，这些试剂就可通过与细胞间酯酶的相互作用(例如，经由与乙酰氧基甲基酯的相互作用)或通过uv
‑
光活化或近红外光活化策略释放。uv光活化和近红外光活化策略描述于例如zhou等人,"progress in the field of constructing near
‑
infrared light
‑
responsive drug delivery platforms,"journal of nanoscience and nanotechnology 16.3(2016):2111
‑
2125；bansal等人,"photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications,"accounts of chemical research 47.10(2014):3052
‑
3060；barhoumi等人,"ultraviolet light
‑
mediated drug delivery:principles,applications,and challenges,"journal of controlled release 219(2015):31
‑
42；和us20180057610a1。它们各自全文以引用方式并入。
121.熟练的从业者将理解，在一些情况下，本文所述的组合物可包含多于一种类型的组合的线粒体试剂。例如，包括这样的包含线粒体的组合物，其中基本上每个线粒体与多种类型的试剂联合。也包括这样的包含线粒体的组合物，其中每个线粒体仅与一种类型的试剂配对，但其中组合物包含线粒体/试剂配对的混合物。
122.用于制备组合的线粒体试剂的方法
123.熟练的从业者将理解，试剂能够以任何多种方式与线粒体连接，例如，通过附着于线粒体，部分或完全包埋在线粒体膜中，包封在线粒体中，或囊封在线粒体内。
124.虽然不旨在受任何理论或任何特定方法的束缚，据信线粒体的外膜是粘附性的，并因此特别适合与各种试剂组合。在一些实施方案中，药剂可简单地通过孵育而附着于线粒体的外膜。例如，可在有利于分离的线粒体的温度，例如0℃至26℃、0℃至4℃、或约0℃、4℃、26℃下，将有效量的药剂与分离的线粒体在缓冲液(例如呼吸缓冲液)中充分混合。该程序可用于使有效量的药剂(例如，纳米颗粒、dna载体、rna载体)附着于线粒体。
125.在一些实施方案中，因为线粒体膜上的电势，有机阳离子(例如罗丹明和tetramethylrosamine)容易被功能性线粒体螯合(sequestered)。健康状态的线粒体膜维持着细胞器内部与外部之间的电势差(称为膜电位)。该膜电位是线粒体功能过程的直接结果，并且如果线粒体不正常工作就可能丧失。因为它们的正电荷和它们在内膜脂质和基质水性空间中的溶解度，脂溶性阳离子被线粒体螯合。类似地，在一些其他实施方案中，阴离子可由于其负电荷而附着于线粒体的外膜。为了使线粒体与这些药剂连接，应当在有利于分离的线粒体的温度，例如约0℃或4℃下，将有效量的药剂与分离的线粒体在缓冲液(例如呼吸缓冲液)中充分混合。
126.治疗剂、诊断剂和/或显像剂可通过化学键与线粒体膜上的磷脂、肽、或蛋白质连接。例如，可利用琥珀酰亚胺酯缀合物将包括荧光团(phrodo red(thermo fisher scientific,inc.))和金属颗粒(例如，30nm磁性氧化铁纳米颗粒(sigma))的分子与完整线粒体外膜上暴露的蛋白质和肽上的暴露胺基团共价地连接。这些反应性试剂与非质子化脂族胺基团(包括蛋白质的胺末端和赖氨酸残基的
‑
氨基)反应，其形成稳定的羧酰胺键。又如，当药剂，例如orange cmtmros(invitrogen,carlsbad,ca,现为thermo
‑
fisher scientific,cambridge,ma)与功能性线粒体混合时，它们被氧化，然后与线粒体上的蛋白质和肽上的硫醇反应形成缀合物。
127.存在多种可用于使治疗剂、诊断剂和/或显像剂附着于线粒体表面的反应性化学部分(例如，羧酸、胺官能化的等)。
128.试剂可经由蛋白质结合、胺结合或其他附着方法附着于线粒体外膜或内膜。另选地或除此之外，可通过疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用和/或静电相互作用使试剂附着于线粒体膜。
129.在许多情况下，可使治疗剂、诊断剂和显像剂与分离的线粒体简单地混合，并在有利的条件(例如，0℃至26℃、0℃至4℃、或约0℃、4℃、26℃，ph 7.2～8.0)下在缓冲液(例如，呼吸缓冲液)中孵育足够的时间段(例如，几分钟、5分钟、10分钟、或1小时)。
130.制备组合的线粒体试剂的示例性方法描述于mccully等人,injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection,am j physiol 296,h94
‑
h105.pmc2637784(2009)；以及masuzawa等人,transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia
‑
reperfusion injury,am j physiol 304,h966
‑
982.pmc3625892(2013)；和us20180057610a1。前述专利各自全文以引用方式并入。
131.治疗方法
132.本文所述的方法包括用于治疗各种疾病(例如，肺障碍、呼吸障碍)、缺血再灌注损伤以及本文所述的各种其他疾病的方法。通常，方法包括将治疗有效量的包含如本文所述的分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物给药于需要或已经确定需要此类治疗的受试者。在一些实施方案中，组合物通过呼吸道给药。
133.如该语境中所用，“治疗”意指改善障碍的至少一种症状(例如，呼吸短促、呼吸急促、血氧水平低、肺衰竭、呼吸衰竭、心力衰竭(例如右心衰竭))。在一些实施方案中，治疗导致肺功能的改善(例如，增加血氧水平、减少阻力、减少弹性)。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗肺纤维化、肺部感染(例如，通过冠状病毒)、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺栓塞、肺癌、肺性高血压、或淋巴管平滑肌瘤病。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗肺炎。
134.术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法的治疗所要提供的动物、人类或非人类。本发明设想了兽医和非兽医应用。
135.人类患者可为成人或儿童，如新生婴儿。例如，人类受试者可为至少或约60岁，例如至少约65岁、70岁、75岁、或至少或约80岁。人类受试者可为低于或约18岁的年龄，例如15岁、10岁、9岁、8岁、7岁、6岁、5岁、4岁、3岁、2岁、或者低于或约1岁。
136.除了人类之外，受试者还可包括但不限于非人类，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛以及其他家养、农场和动物园动物。
137.如本文所述的组合物的给药可通过各种方式实现，例如静脉内、真皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜、直肠给药、鼻内给药、鼻内滴注、吹入(例如，鼻用喷雾)、吸入(通过鼻部或口部)、肺内给药、气管内给药、腹膜内注射、输注，或它们的任何组合。在一些实施方案中，组合物通过呼吸道给药。
138.在一个方面，可将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂递送至肺部或心脏以减少顿抑(stunning)并允许器官从手术程序(例如，肺部手术或心脏手术)剥离。在一些实施方案中，方法涉及通过呼吸道给药分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂。
139.在一个方面，可将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂递送至耳部、眼部、皮肤(例如，用于减少皱纹)或头部(例如，用于秃发)。
140.本文所述的组合物可以作为单次的一次性治疗，或另选地多重治疗(例如间歇地
或连续地持续约1、2、5、8、10、20、30、50、或60天、一年、无限期，或直到健康护理提供者确定不再需要给药线粒体或组合的线粒体试剂的疗程)给药于受试者。
141.分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂能够以每5分钟或在12
‑
24小时作为单剂量或多剂量递送给药于受试者。在一些实施方案中，分离的线粒体或组合的线粒体试剂可以每5
‑
10分钟(例如，每5分钟、每10分钟)给药于受试者。
142.需注意，在一些情况下，线粒体的效应取决于分离时间与使用时间之间的时间段的长度。因此，在一些情况下，线粒体是新鲜分离且有活力的。线粒体或组合的线粒体试剂可在分离线粒体后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟内给药于受试者。在一些情况下，线粒体或组合的线粒体试剂在开始线粒体分离过程后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟内给药于受试者。在一些情况下，线粒体和/或组合的线粒体试剂可在使用前储存较短时间段(例如，约或至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、或60分钟)。
143.还需注意，在一些情况下，冷冻
‑
解冻的线粒体对于本文所述的某些治疗(例如，缺血/再灌注损伤的治疗)是不可行和无效的。因此，在一些情况下，在从组织和/或细胞分离后不对线粒体进行冷冻和解冻。
144.在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗与肺部、耳部、眼部、皮肤、头皮相关联的障碍。例如，本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症、皱纹(例如，皮肤上的皱纹)、或秃发。在一些情况下，本文所述的组合物和方法增强了各种组织和器官(例如肺部、耳部、眼部、皮肤)的功能。
145.通过呼吸道给药
146.排列在肺上皮的黏液(1
–
10μm厚)和排列在肺泡的表面活性剂(0.1
–
0.2μm厚)构成了肺吸收外来颗粒的物理屏障。此外，膜相关联的(上皮和内皮)和细胞内的(巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)蛋白酶和肽酶易于降解所给药的肽和蛋白质(agu等人,"the lung as a route for systemic delivery of therapeutic proteins and peptides."respiratory research 2.4(2001):198)。肺巨噬细胞也显示出分泌或释放短寿的过氧化物酶、炎性和免疫调节介质(包括粒细胞集落
‑
刺激因子、白介素、白三烯和蛋白酶)，以及作为宿主防御机制一部分的其他分子。
147.然而，本公开显示了通过呼吸道给药包含线粒体或组合的线粒体试剂的组合物可有效地促进肺功能，减少肺阻力，减少肺弹性，减少缺血区，和/或减少肺部中的水肿和细胞损伤。
148.可通过各种方式，例如鼻内给药、鼻内滴注、吹入(例如，鼻用喷雾)、吸入(通过鼻部或口部)、肺内给药、气管内给药，它们的任何组合，通过呼吸道给药如本文所述的组合物。如本文所用，术语“鼻内滴注”是指将治疗剂直接递送到鼻部中和鼻膜上的程序，其中一部分治疗剂可通过气管并递送到肺部中。
149.由于需要治疗的肺部的功能偶尔受限，治疗剂有时不能通过呼吸道给药有效地递送至肺部中的靶部位(例如，细支气管或肺泡)。在这些情况下，可以首先向受试者给药可清除气道的试剂。在一些实施方案中，这些试剂可诱导支气管通道的扩张和/或肌肉中的血管
舒张。此类试剂包括但不限于β2肾上腺素能受体激动剂、抗胆碱能剂、皮质类固醇。在一些实施方案中，可使用用于治疗哮喘的试剂。
150.适于通过呼吸道给药的药物组合物可包括例如液体溶液、水溶液(在水溶性情况下)或分散体等。在一些实施方案中，这些组合物可包含一种或多种表面活性剂。
151.如本文所用，术语“呼吸道”是指从鼻部到肺泡的空气通道，包括鼻部、咽喉、咽、喉、气管、支气管，以及肺部的任何部分。在一些实施方案中，将组合物给药于肺部或呼吸系统的任何部分。
152.在一些实施方案中，通过可使组合物转化成气雾剂形式的递送系统，例如雾化器、气化器、鼻用喷雾器、吸入器、软雾吸入器、喷射式喷雾器、超声波雾化器、压力定量吸入器、呼吸激活压力定量吸入器、或振网筛装置，可将组合物给药于受试者。如本文所用，术语“吸入器”是指用于给药呈喷雾或干粉形式的组合物的装置，该组合物通过鼻部或口部吸入(自然或机械强制吸入肺部中)。在一些实施方案中，吸入器包括例如被动或主动呼吸机(机械的，具有或不具有气管内导管)、雾化器、干粉吸入器、定量吸入器和压力定量吸入器。一旦线粒体沉积或定位于细胞附近，线粒体的子集就可被细胞吸收。
153.在一些实施方案中，装置可使用空气(例如，氧气、压缩空气)或超声功率来将溶液和悬浮液破碎成可从装置的接口管直接吸入的小气雾剂颗粒(例如微滴)。在一些实施方案中，装置使用在贮液器的顶部处振动的具有激光钻孔(例如，1000至7000个孔)的网孔/膜，并由此通过孔压出极细微滴的雾。
154.递送系统也可具有单位剂量递送系统。每剂递送的溶液或悬浮液的体积可为约5至约2000微升、约10至约1000微升、或约50至约500微升不等。用于这些各种剂型的递送系统可为滴瓶、塑料挤压单元、喷雾器、雾化器或者单位剂量或多剂量包装的药用气雾剂。
155.在一些实施方案中，装置是定量喷雾器所附接的小而硬的瓶子。可通过将组合物吸入限定体积的室中来递送计量的剂量，该室具有尺寸设计成当室中的液体被压缩时通过形成喷雾而雾化和气雾剂配制的孔。使该室压缩以给药组合物。在某些装置中，室为活塞布置。此类装置是可商购获得的。
156.另选地，可使用具有孔或开口的挤压瓶，该孔或开口的尺寸被设计成当挤压时通过形成喷雾而使气雾剂制剂雾化。开口通常存在于瓶的顶部，并且顶部大致为锥形以部分地适配在鼻道中，以用于气雾剂制剂的有效给药。优选地，鼻用吸入器可提供计量的量的气雾剂制剂，以用于给药测量剂量的治疗剂。
157.在一些实施方案中，用于吸入到肺部中的液体制剂的雾化涉及抛射剂。抛射剂可为本领域中通常使用的任何抛射剂。此类可用抛射剂的具体非限制性实例是氯氟烃、氢氟烃、氢氯氟烃、或烃，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2
‑
四氟乙烷，或它们的组合。
158.本公开也提供了用于治疗患有各种肺疾病的受试者的气雾剂制剂和剂型。通常，此类剂型在药学上可接受的稀释剂中含有治疗剂。此类气雾剂制剂中的药学上可接受的稀释剂包括但不限于无菌水、盐水、缓冲盐水、右旋糖溶液等等。在某些实施方案中，可用于本发明或药物制剂的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或通常介于ph 7.0
‑
8.0范围内(例如ph 7.4)的缓冲盐水溶液、或水。
159.气雾剂制剂也可任选地包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂、表面
活性剂和赋形剂。
160.制剂可包括载体。载体是可溶于循环系统并且在生理学上可接受的大分子，其中生理学上可接受意指本领域技术人员将接受将所述载体在患者中的注射作为治疗方案的一部分。载体优选在循环系统中相对稳定，具有可接受的血浆半衰期以进行清除。此类大分子包括但不限于大豆卵磷脂、油酸和脱水山梨糖醇三油酸酯。
161.制剂也可包括可用于ph维持、溶液稳定、或用于调节渗透压的其他试剂。试剂的实例包括但不限于盐，如氯化钠或氯化钾，以及碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖或甘露糖等等。
162.本公开还设想了包含如本文所述的组合物和另一种治疗有效试剂的气雾剂制剂。
163.在一些实施方案中，可将组合物给药到血管中。血液可将线粒体或组合的线粒体试剂携载至靶部位，例如器官、组织、或损伤部位。例如，肺血管(例如肺静脉)可将线粒体或组合的线粒体试剂携载至肺部。在一些情况下，本文所述的组合物可用于改善肺部、耳部、眼部和皮肤的功能。
164.在一些实施方案中，组合物通过口腔或鼻呼吸途径给药，以实现局部或全身效应。药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体来雾化。雾化溶液可从雾化装置直接吸入，或者雾化装置可附接到面罩或间歇正压呼吸机。溶液、悬浮液、或粉末组合物可从以适当方式递送制剂的装置经口或经鼻给药。对于吸入给药，组合物可从含有合适的抛射剂(例如气体，如二氧化碳)的加压容器或分配器或雾化器以气雾剂喷雾的形式递送。此类方法包括描述于美国专利no.6,468,798；美国专利no.6,695,227；美国专利no.7,431,222；us20050224608中的那些；其各自全文以引用方式并入本文。
165.因此，在一些实施方案中，气雾剂组合物可给药至呼吸道、肺部、耳部、眼部、鼻道、直肠、皮肤和头部。在一些实施方案中，将组合物递送至肺部、鼻道、直肠、肠、皮肤和眼部以治疗这些部位的癌症或肿瘤。
166.在一些实施方案中，组合物通过定量喷雾器、挤压瓶、压力定量吸入器、呼吸机、或面罩和塞条给药。气雾剂递送系统，如压力定量吸入器和干粉吸入器公开于newman,s.p.,aerosols and the lung,clarke,s.w.和davia,d.编辑,第197
‑
22页，其全文以引用方式并入本文。受试者也可通过呼吸机吸入组合物，该呼吸机将基于患者的舒适度和需求来设定流速。这由肺部图形(即呼吸率、潮气量等)确定。组合物也可制备成允许受试者使用面罩或塞条吸入。在某些情况下，可将组合物包装到便携式装置(例如，便携式吸入器装置)中并以计量的剂量给药，例如，以允许对不在医院环境中的接受者进行间歇治疗。可将不同浓度的组合物包装在容器中。
167.将组合物有效地递送至肺泡的方便方式是选择产生足够小颗粒(例如，产生平均粒径小于5.0微米(μm)，更优选地平均粒径为约0.2至约4.0μm，并且最优选地平均直径为约0.2至约2μm的颗粒)的雾化器。作为选择小平均粒径以实现显著肺泡沉积的替代方案，可以给药非常高剂量的具有较大平均粒径的组合物。在此类方法中，如果特定组合物在所需剂量下不太有刺激性，并且在总群体中存在足够数量的直径在0.5至约5μm范围内的颗粒以允许在肺泡中沉积，则其为有益的。对于近端气道递送，平均粒度可更大。例如，合适的平均粒径可通常小于约15μm，例如约4μm至约15μm，例如约5μm至约10μm。组合物可通过任何适当的方法雾化。为了与人类或其他灵长类一起使用，可使用医用雾化器系统生成气雾剂，该医用雾化器系统通过接口管、面罩等递送气雾剂，受试者可从该接口管、面罩等将气雾剂吸入肺
部中。各种雾化器在本领域中是已知的，并且可用于如本文所述的方法中。参见例如美国专利no.4,268,460；美国专利no.4,253,468；美国专利no.4,046,146；美国专利no.3,826,255；美国专利no.4,649,911；美国专利no.4,510,829；其各自全文以引用方式并入本文。雾化器系统的选择将取决于是否期望肺泡或气道递送(即，气管、初级、次级或三级支气管等)。
168.可用于肺泡递送的雾化器的实例包括acorn 1雾化器，以及respirgard ii
tm
雾化器系统，两者均商购自marquest medical products,inc.,inglewood,colo。用于与本发明一起使用的其他可商购获得的雾化器包括ultravent
tm
雾化器，购自mallinckrodt,inc.(maryland heights,mo.)；wright雾化器(wright,b.m.,lancet(1958)3:24
‑
25)；以及devilbiss雾化器(mercer等人,am.ind.hyr.assoc.j.(1968)29:66
‑
78；t.t.mercer,chest(1981)80:6(sup)813
‑
817)。可用于气道递送的雾化器包括通常用于治疗哮喘的那些。此类雾化器也是可商购获得的。本领域的技术人员可通过用例如7级mercer阶式撞击取样器(intox products,albuquerque,n.mex.)测量由此生成的平均粒度来确定特定雾化器的有用性。
169.递送至受试者的组合物的总量将取决于若干因素，包括雾化总量、雾化器的类型、粒度、受试者的呼吸模式、肺疾病的严重程度和雾化溶液中的浓度，以及吸入疗法的长度。在肺泡中测量的组合物的量可显著小于从气雾剂中存在的组合物的量所预期的，因为大部分的组合物可被受试者呼出或者捕获在雾化器设备的内表面上。
170.熟练的从业者将能够容易地设计有效的方案，特别是如果气雾剂的粒度是最优化的。在一些情况下，当治疗更严重的病症时，给药更高剂量是有用的。如果必要，可基于特定的基础来重复该治疗，这取决于所实现的结果。如果重复该治疗，可以监测哺乳动物宿主以确保对治疗没有不利的免疫反应。治疗频率取决于许多因素，如每剂给药的组合物的量，以及受试者的健康状态和病史。如本文所用，组合物的“雾化量”或“气雾化量”意指作为气雾剂实际上离开设备的量，即，置于设备中的量减去在治疗环节结束时保留在贮存器中和设备内表面上的量。
171.肺障碍
172.本文所述的治疗剂可用于治疗各种肺障碍。受试者可患有可受益于该治疗的任何肺疾病，例如，缺血、灌注损伤、肺发育不全、先天性膈疝(cdh)、poland综合征、胸壁疾病(例如，漏斗胸)、肺切除术、支气管肺发育不良、肺损伤和吸入损伤、哮喘、囊性纤维化等。例如，受试者可患有肺发育不全。在一些实施方案中，有效量的包含分离的线粒体的组合物可例如通过呼吸道给药于受试者。
173.在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(ali)、呼吸衰竭、呼吸功能降低和/或肺部炎症。
174.在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗肺纤维化、肺部感染(例如，通过病毒、冠状病毒、流感、细菌、或真菌)、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺栓塞、肺癌、肺性高血压、或淋巴管平滑肌瘤病。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗肺炎。
175.在一些实施方案中，受试者可被鉴定为患有不足的、不完全的、或缓慢的肺发育。另选地或除此之外，受试者可患有肺部中的一些损伤。例如，受试者可为习惯性吸烟者或经常暴露于烟尘吸入的工作者。
176.治疗缺血相关的损伤
177.本文所述的方法可用于治疗缺血性肺。例如，可通过呼吸道给药有效量的分离的线粒体。线粒体可被肺部中的细胞内化。
178.再灌注损伤是在缺血或缺氧一段时间后血液返回组织时由血液供应所致的组织损伤。缺血时段期间氧和营养物质的缺乏会在血流恢复时导致炎症和氧化损伤。炎症反应还导致组织中的再灌注损伤。因此，在一些情况下，治疗也涉及向患者给药免疫抑制剂。免疫抑制剂可例如单独给药，但作为与线粒体试剂的并行治疗。另选地或除此之外，免疫抑制剂可以与线粒体连接形成组合的线粒体试剂，其可用于治疗。特别可用的免疫抑制剂是双膦酸盐/酯(bisphosphonate)。
179.在一些实施方案中，受试者患有急性肺损伤(ali)。急性肺损伤通常与急性呼吸衰竭和顽固性低氧血症相关联。在一些实施方案中，受试者患有双肺浸润，这与不存在左心房高血压时的肺水肿是一致的。ali使各种各样的医学和外科病症复杂化，并且反映了针对肺损害或诱发因素的肺反应。ali的最常见原因是缺血/再灌注损伤(iri)。iri可通过体外气体交换、心肺转流术和肺通气而发生，并且已显示对肺功能和细胞活力具有明显效应，并且在儿科和成人患者中均显著地促成发病率和死亡率增加。据估计经历心脏手术的成人患者的ali发生率在53.8％至73.5％的范围内。在儿科患者中，在8
‑
10％的需要机械通气的患者中存在ali。在儿科和成人患者中，ali的估计死亡率为20
‑
75％。目前，不存在可行的方法来治疗通过iri发生的ali，该方法的目标是提高肺存活和肺功能。
180.本文所述的方法可用于治疗ali。例如，可向受试者的呼吸道给药有效量的包含线粒体或组合的线粒体试剂的雾化组合物。例如，可将约或至少1
×
107个线粒体给药到肺部中。注射的线粒体被内皮细胞内化，并且可提供增强的氧消耗，减少肺阻力和弹性，增加顺应性，和/或减少缺血区。
181.血管舒张和血流
182.本文所述的方法可显著增加血流而不改变平均血压或心率。在不增加心率的情况下增加血流的能力允许在心绞痛型损伤中和缺血/再灌注相关损伤中以及在需要增加血流和氧递送的组织损伤区中临床使用。因此，本文所述的方法可用于动脉介入以移除血管中的凝块或栓塞。
183.本文所述的方法也可用于增加各种器官或组织(例如心脏或肺部)的血流和/或氧递送，并且诱导器官中的血管扩张。在一些情况下，分离的线粒体或组合的线粒体试剂可用于减少器官(例如心脏或肺部)中的血管阻力。分离的线粒体或组合的线粒体试剂可用于增加血流。可将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂加入造影剂中，并且可用于鉴定和移除器官中的阻塞物。
184.需注意，组合物的效应取决于分离的时间到使用的时间。随着分离时间的延长，血管舒张效应降低。虽然不旨在受任何理论的束缚，猜测新鲜分离的线粒体具有可增加血流的某些化学物质。因此，在一些方法中，线粒体是新鲜分离且有活力的。例如，线粒体或组合的线粒体试剂在线粒体分离过程开始时的时间点之后或者在分离线粒体之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟内给药于受试者。在一些情况下，线粒体或组合的线粒体试剂在线粒体分离过程开始时的时间点之后或者在分离线粒体之后约20分钟至约60
分钟(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟)内给药于受试者。
185.在一些情况下，增加血流是不期望的(例如，治疗肺部中的缺血/再灌注，治疗癌症)。在这些情况下，线粒体或组合的线粒体试剂可在使用前储存较短时间段(例如，约30至约60分钟)。该方法可用于增加组织活力(例如，治疗缺血/再灌注损伤)而不引起血流增加。在这些情况下，线粒体或组合的线粒体试剂在线粒体分离过程开始时的时间点之后或者在分离线粒体之后至少约60分钟(例如，约65分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟)给药于受试者。
186.成像
187.通常通过线粒体与显像剂的共孵育，显像剂可附着于线粒体。此类显像剂包括但不限于mitotracker和phrodo荧光团(得自thermo fisher scientific inc.)、
18
f
‑
罗丹明6g和氧化铁纳米颗粒。
188.包括显像剂的组合的线粒体试剂可通过呼吸道给药于受试者。可以使用成像技术，如正电子发射断层显像(pet)、微型计算机断层扫描(μct)和磁共振成像(mri)、亮视野显微镜和3
‑
d超分辨率显微镜等来检查含有标记的线粒体的组织。熟练的从业者将理解可以使用其他成像技术或形式。它们包括但不限于x射线、闪烁扫描法、荧光和超声。
189.正电子发射断层显像是产生体内的三维图像的成像技术，并且可用于本文所述的方法中。该系统检测由正电子发射放射性同位素(示踪剂)间接发射的γ射线对。然后，通过计算机分析来构建体内示踪剂浓度的三维图像。可用的报告基团包括放射性同位素，如
11
c、
13
n、
15
o、
18
f、
64
cu、
68
ga、
81
mkr、
82
rb、
86
y、
89
zr、
111
in、
123
i、
124
i、
133
xe、
201
tl、
125
i、
35
s
14
c、3h。在一些方法中，可将线粒体用放射性同位素例如
18
f标记，或者用掺入放射性同位素的分子例如
18
f
‑
罗丹明6g、
18
f
‑
标记的罗丹明b标记。在线粒体被靶细胞内化后，可采用pet成像技术或类似技术来观察靶细胞。
190.磁共振成像是对身体的解剖结构和生理过程进行成像的医学成像技术，并且可用于本文所述的方法中。在一些情况下，其可以与一些其他成像技术(例如pet)结合使用。从两种装置采集的图像可以在同一环节中顺序地获取，并且组合成单一叠加的(互相配准的)图像。pet/mri扫描可用于诊断人类和动物的健康状况，例如用于研究、医疗和农业目的。
191.微型计算机断层扫描使用x射线来创建物理对象的横截面，其可用于重建虚拟模型而不破坏原始对象，并且可用于本文所述的方法中。在一些情况下，其与一些其他成像技术(例如pet)结合使用。从两种装置采集的图像可以在同一环节中顺序地获取，并且组合成单一叠加的(互相配准的)图像。因此，通过pet获得的描绘体内代谢或生物化学活性的空间分布的功能成像可以与通过ct扫描获得的解剖学成像更精确地一致或相关。二维和三维图像重构可作为通用软件和控制系统的功能来呈现。
192.3d结构照明显微镜、3d
‑
sim或3
‑
d超分辨率显微镜允许细胞内结构的完全3d可视化，并且可用于本文所述的方法中。结构照明显微镜是能够通过使用空间结构照明光而使常规宽视野荧光显微镜的空间分辨率加倍的成像方法。其通过从可观察区域之外的频率空间收集信息来增强空间分辨率。
193.所述方法(即包括给药线粒体和/或组合的线粒体试剂的方法)可用于诊断多种疾病，如癌症(例如，肺癌、脑癌、胰腺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌)、心血管疾病(例如，心肌梗塞、动脉粥样硬化)、自身免疫疾病(例如，多发性硬化症、糖尿病、肠易激综合征、乳糜泻、
克罗恩氏病)和炎性疾病。
194.使用用于成像目的的试剂的方法是本领域公知的，并且描述于例如等人,biological characterization of f18
‑
labeled rhodamine b,a potential positron emission tomography perfusion tracer,nucl med biol 40,1043
‑
1048,pmc3820364(2013)；等人,
18
f
‑
labeled rhodamines as potential myocardial perfusion agents:comparison of pharmacokinetic properties of several rhodamines,nucl med biol 42,796
‑
803,pmc4567415(2015)；以及pacak等人,superparamagnetic iron oxide nanoparticles function as a long
‑
term,multi
‑
modal imaging label for non
‑
invasive tracking of implanted progenitor cells,plos one 9,e108695,pmc4177390(2014)。前述文献中的每者可用于本文所述的方法中，并且全文以引用方式并入本文。
195.药物递送
196.本说明书提供了将药剂递送至例如患者的细胞和/或组织的方法。线粒体通过肌动蛋白依赖性内化过程被组织细胞吸收，由此提供了将药剂直接递送到细胞中的方式。在一些情况下，组合的线粒体试剂通过呼吸道进入肺组织或血管。
197.抗体或抗原结合片段可以连接或附着于线粒体。熟练的从业者将理解，将抗体或抗原结合片段与线粒体或组合的线粒体试剂连接可以允许线粒体或组合的线粒体试剂靶向至特定部位，例如靶细胞和/或组织。在一些情况下，抗体或抗原结合片段被设计成靶向特定细胞类型，例如肺部中的平滑肌细胞、免疫细胞、巨噬细胞等。
198.在一些实施方案中，本公开提供了将核酸(例如，dna、rna、mirna)、载体、肽、或蛋白质递送至靶部位(例如，肺组织)的方法。分离的线粒体可用作将核酸或肽递送到细胞中的载体。在一些情况下，可向受试者给药包括核酸聚合物的组合的线粒体试剂，以替换受试者中引起疾病的突变基因，使突变基因失活或“敲除”，或者将新基因引入受试者中。示例性核酸聚合物包括但不限于双链dna、单链dna、双链rna、单链rna、或三螺旋核酸分子。在某些情况下，核酸聚合物是dna、干扰rna(sirna)和微小rna。
199.最小化心脏毒性
200.化疗是用于各种癌症的常见治疗，然而，其也会引起若干严重的并发症。化疗诱导的心脏毒性是一种限制化疗剂的临床使用的并发症。某些化疗剂如蒽环类抗生素针对急性成淋巴细胞性和成髓细胞性白血病是高度有效的，但由于其对线粒体的效应而对心脏特别有害。线粒体的损伤进一步导致化疗诱导的心脏毒性。angsutararux等人,chemotherapy
‑
induced cardiotoxicity:overview of the roles of oxidative stress.oxid med cell longev.2015；2015:795602.doi:1.0.1155/2015/795602(2015)；guo等人,cardiovascular toxicities from systemic breast cancer therapy,front oncol.4:346.doi:10.3389/fonc.2014.00346.ecollection(2014)。
201.本公开提供了使化疗诱导的心脏毒性最小化的方法。该方法涉及通过呼吸道向患者给药有效量的分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂。如果患者需要用化学疗法治疗(例如，因为由医师或兽医开具处方)，可在给药化学疗法之前、期间和/或之后用线粒体和/或组合的线粒体试剂治疗患者。例如，可在给药后立即开始用线粒体和/或组合的线粒体试剂治疗患者，作为单次治疗或者间歇地或连续地持续约1、2、5、8、10、20、30、50、或60天、一年、
无限期，或直到医师确定不再需要给药线粒体和/或组合的线粒体试剂。
202.器官/组织移植
203.本公开的特征还在于移植一个或多个器官、组织、细胞团和/或分离的细胞的方法。该方法可包括在移植前使一个或多个器官、组织、细胞团和/或分离的细胞暴露于线粒体或组合的线粒体试剂的步骤。此类暴露可原位和/或离体发生。可使一个或多个器官、组织和/或分离的细胞暴露于包含线粒体或组合的线粒体试剂的组合物(例如，雾化组合物)。
204.使器官或组织暴露于包含线粒体或组合的线粒体试剂的组合物可以通过本领域已知的任何方法离体和/或原位执行。例如，暴露可以在具有足够体积的任何室或空间中离体执行，以使器官或组织完全或部分地浸没在组合物中。又如，可通过如下方式使器官暴露于包含线粒体或组合的线粒体试剂的组合物：将器官置于任何合适的容器中，并使包含线粒体或组合的线粒体试剂的组合物“洗过(wash over)”器官，使得器官暴露于组合物的连续流。
205.线粒体或组合的线粒体试剂的有效量是在体内和/或体外有效地增强器官或细胞的存活和/或改善其功能的量。在移植单个细胞或细胞团块(例如，移植供体和/或受体)的语境内，线粒体或组合的线粒体试剂的有效量是足以增强细胞或细胞团块的存活，例如减少细胞或细胞团块的损失，和/或改善移植的细胞或细胞团块的功能性能的给药于移植供体和/或受体的量。在移植器官和组织(例如，移植供体和/或受体)的语境内，线粒体或组合的线粒体试剂的有效量是足以增强所关注的器官、组织或细胞的存活，例如减少构成器官或组织的细胞的损失，和/或改善器官的功能性能的给药于移植供体和/或受体的量。
206.在一些情况下，通过呼吸道给药组合物是在从供体取出器官之前执行。在一些情况下，通过呼吸道给药组合物是在器官移植到受体中之后执行。在一些情况下，组合物(例如，雾化组合物)的给药是在器官取出之前，在收获器官之后，并然后再次在植入到受体中之后执行。在一些情况下，组合物的给药是在移植手术(例如，肺移植、心脏移植)期间执行。
207.癌症的治疗
208.本文所述的方法也提供了癌症(例如肺癌)的治疗。在如本文所述的组合物通过呼吸道给药于受试者之后，线粒体或组合的线粒体试剂可被肿瘤细胞吸收。在一些实施方案中，可将细胞生长抑制剂或细胞毒素剂递送至肿瘤以杀伤癌细胞。在一些实施方案中，治疗剂是化疗剂，例如蒽环类抗生素。
209.可使用本公开的方法和组合物治疗的癌症包括例如口腔癌/咽癌、食道癌、喉癌、肺癌、或呼吸道中的任何癌症。
210.另外，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可连接或附着于线粒体。熟练的从业者将理解，将抗体或抗原结合片段与线粒体或组合的线粒体试剂连接可以允许线粒体或组合的线粒体试剂靶向至特定部位，例如靶细胞和/或组织。在一些情况下，抗体或抗原结合片段被设计成靶向特定细胞类型，例如癌细胞。
211.剂量
[0212]“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。例如，治疗量是实现期望治疗效应的量。该量可以与预防有效量相同或不同，该预防有效量为预防疾病或疾病症状发作所需的量。可将有效量以一次或多次给药、应用或剂量来给药。治疗剂的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的治疗剂。组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次给药；包括每隔一
天一次。本领域技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗剂治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。
[0213]
治疗剂的剂量、毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序确定，例如用于确定ld50(使群体的50％致死的剂量)和ed50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，并且其可表示为比率ld50/ed50。表现出高治疗指数的试剂是优选的。虽然可使用表现出毒副作用的试剂，但是应当小心地设计将此类试剂靶向受影响组织部位的递送系统，从而使对未感染细胞的潜在损伤最小化，并由此减少副作用。如何估计人类患者的安全范围描述于例如食品和药物管理局(food and drug administration),"guidance for industry:estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers."center for drug evaluation and research(cder)(2005)，其全文以引用方式并入本文。
[0214]
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的剂量范围。此类试剂的剂量优选地处于包括ed50的循环浓度范围内，而几乎没有或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型以及所利用的给药途径。对于本发明的方法中使用的任何试剂，治疗有效剂量可初始由细胞培养测定来估计。此类信息可用于更精确地确定人体内的可用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法进行测量。
[0215]
熟练的从业者将理解，应当给药于患者的线粒体和/或组合的线粒体试剂(例如，包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物)的量将取决于例如所治疗的障碍的类型、给药途径、治疗的持续时间、所治疗区域的尺寸和/或患者中治疗部位的位置等而变化。熟练的从业者将能够取决于这些和其他变量来确定待给药的剂量。例如，可向受试者给药总共约1
×
10
10
至1
×
10
14
个线粒体(例如，以治疗肺部中的局部缺血)。在小局灶性病变的情况下，可向患者给药1
×
103至1
×
106个线粒体。因此，线粒体或组合的线粒体试剂(或包含其的组合物)的有效量是足以产生期望的治疗效应的线粒体或组合的线粒体试剂的总量。有效量可为例如至少或约1
×
102个线粒体或组合的线粒体试剂，例如约1
×
103至约1
×
10
14
、约1
×
104至约1
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10
13
、约1
×
105至约1
×
10
12
、约1
×
106至约1
×
10
11
、约1
×
107至约1
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10
10
、约1
×
103至约1
×
107、约1
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104至约1
×
106、约1
×
107至约1
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10
14
、或约1
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108至约1
×
10
13
、约1
×
109至约1
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10
12
、约1
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105至约1
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108；或至少或约1
×
103、1
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104、1
×
105、1
×
106、1
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107、1
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、1
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10
11
、1
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12
、1
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、或者至少或约1
×
10
14
，或者例如超过1
×
10
14
的量。如本文所用，在向患者给药的语境中，术语“总量”可指在单次给药或多次给药中线粒体或组合的线粒体试剂的总量，这取决于所执行的给药方案。
[0216]
药物组合物
[0217]
本公开提供了包含分离的线粒体的组合物、包含组合的线粒体试剂的组合物、包含分离的线粒体和组合的线粒体试剂两者的组合物，以及使用此类组合物的方法。
[0218]
本文所述的药物组合物可包括线粒体和/或组合的线粒体试剂和药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”包括与药物给药相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些实施方案中，药学上可接受
的载体是磷酸盐缓冲盐水、盐水、krebs缓冲液、tyrode的溶液、造影剂、或欧乃派克(omnipaque)、或它们的混合物。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是无菌线粒体缓冲液(300mm蔗糖；10mm k
‑
hepes(钾缓冲的(4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸，ph 7.2)；1mm k
‑
egta(钾缓冲的乙二醇四乙酸，ph 8.0))。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是呼吸缓冲液(250mm蔗糖，2mm kh2po4，10mm mgcl2，20mm k
‑
hepes缓冲液(ph 7.2)和0.5mm k
‑
egta(ph 8.0))。
[0219]
药物组合物通常被配制为与其预期的给药途径相容。
[0220]
药物组合物可被配制成用于各种临床用途，例如成像、治疗伤口、治疗损伤、保存器官、改善器官或组织中的线粒体功能以及皮肤护理。在一些情况下，药学上可接受的载体是用于成像目的的造影剂。在一些实施方案中，药物组合物可包括防腐剂、抗菌剂(例如抗生素)、抗真菌剂、消毒剂、止痛剂、麻醉剂、类固醇、营养补充剂、香精油等。麻醉剂是可在手术或治疗期间预防疼痛的药物。示例性止痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚、非甾体类抗炎药、水杨酸盐、布洛芬和利多卡因。示例性抗菌剂包括但不限于二氯苄醇、戊间甲酚和抗生素。示例性抗生素包括青霉素类、碳青霉烯类、头孢菌素类、氨基糖甙类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、林可霉素、克林霉素、大环内酯类、新生霉素、多粘菌素类、利福霉素、大观霉素、四环素类、万古霉素、替考拉宁、链阳菌素类、抗叶酸剂、磺酰胺类、甲氧苄啶、乙胺嘧啶、硝基呋喃类、扁桃酸乌洛托品、马尿酸乌洛托品、硝基咪唑类、喹诺酮类、氟喹诺酮类、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氨硫脲和紫霉素。防腐剂是可施用于活组织/皮肤以降低感染、败血症、或腐败的可能性的抗微生物物质。示例性防腐剂包括但不限于氯己定及其盐、苯甲烃铵及其盐、三氯生和氯化十六烷基吡啶。示例性抗真菌剂包括但不限于托萘酯、咪康唑、氟康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑、伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素、制霉菌素和纳他霉素。示例性类固醇包括但不限于醋酸泼尼松、戊酸泼尼松、泼尼松龙、二丙酸阿氯米松、醋酸氟轻松、地塞米松、甲基泼尼松龙、匹伐地索奈德(desonide,pivolate)、匹伐氯可托龙(clocortolone pivolate)、醋酸曲安奈德、泼尼卡酯、丙酸氟替卡松、氟氢缩松、糠酸莫米松、去羟米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸倍他米松、苯甲酸倍他米松、醋酸双氟拉松、醋酸氟轻松、哈西奈德、安西奈德、丙酸卤倍他索和丙酸氯倍他索。示例性营养补充剂包括但不限于维生素、矿物质、草药产品和氨基酸。维生素包括但不限于维生素a、维生素b族中的那些、维生素c、维生素d族中的那些、维生素e和维生素k。香精油包括但不限于衍生自薄荷、鼠尾草、冷杉、薰衣草、罗勒、柠檬、杜松、迷迭香、桉树、万寿菊、春黄菊、橙等等的那些。许多这些试剂描述于例如wo 2008152626中，其全文以引用方式并入。
[0221]
包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物可被配制为任何形式，例如液体、半固体、或固体。示例性组合物包括液体、霜膏、软膏剂、药膏、油、乳剂、脂质体制剂等等。
[0222]
分离的线粒体或组合的线粒体试剂可包括在设计用于器官、组织、或细胞移植的组合物中。组合物可包括分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂以及适于原位或离体给于患者和/或器官的液体，例如用于离体维持器官、组织或细胞。通常，液体是水溶液。溶液的实例包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)、celsior
tm
溶液、perfadex
tm
溶液、collins溶液、柠檬酸盐溶液、组织培养基(例如，dulbecco的改良eagle的培养基(dmem))、组氨酸
‑
色氨酸
‑
酮戊二酸(htk)溶液，以及university of wisconsin(uw)溶液(oxford textbook of surgery,
morris和malt编辑,oxford university press,1994)。
[0223]
university of wisconsin冷存储溶液被认为是用于器官移植的标准溶液。其包括以下：100mm乳糖酸钾、25mm kh2po4、5mm mgso4、30mm棉子糖、5mm腺苷、3mm谷胱甘肽、1mm别嘌呤醇和50g/l羟乙基淀粉。可将分离的线粒体或组合的线粒体试剂加入到这些液体中用于器官、组织和细胞的保存。
[0224]
当通过某些途径给药时，如呼吸道(例如，鼻部、气管造口术，或通过气管内导管(ett))，表面活性剂可允许组合物达到远端气道。因此，在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，液体溶液、水溶液(在水溶性的情况下)、气雾剂制剂、分散体、无菌粉末等)可包含一种或多种表面活性剂。
[0225]
表面活性剂可选自非离子、阳离子、阴离子和两性离子表面活性剂。也可使用表面活性剂的混合物。表面活性剂的示例性类别包括醇醚硫酸盐、醇硫酸盐、链烷醇酰胺、烷基磺酸盐、氧化胺、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂、甜菜碱衍生物、阳离子表面活性剂、二磺酸盐、十二烷基苯、磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸盐、甘油单酯和甘油二酯、非离子表面活性剂、磷酸酯、季铵盐表面活性剂和脱水山梨糖醇衍生物。
[0226]
为了适于通过呼吸道递送，也可使用一些其他适当的药物载体。这些载体包括例如脂质体、纳米颗粒和微米颗粒、环糊精、微乳剂、胶束、悬浮液或溶液。在一些实施方案中，这些载体由脂质(例如，脂质体、类脂质体、微乳剂、脂质胶束、固体脂质纳米颗粒)制成或者由聚合物(例如，聚合物胶束、树枝状体、聚合物纳米颗粒、非凝胶、纳米胶囊)构成。这些载体能够以受控方式将治疗剂携载至肺部。也可使用纳米载体。靶器官的局部疗法通常需要较小的总剂量以实现临床上有效的结果。为了达到该目标，纳米载体可被工程化成缓慢降解，对刺激作出反应，并且是位点特异性的。
[0227]
本文所述的药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。本文所述的药物组合物也可制备成适于转化成雾化形式的形式(例如，通过适当的雾化器)。
[0228]
实施例
[0229]
本发明在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
[0230]
实施例1：从受试者的自体骨骼肌分离线粒体
[0231]
将线粒体从自体骨骼肌组织中分离。组织来源取决于手术进入点和入路。高度有效的线粒体移植通常需要新鲜分离的、有活力和功能性的线粒体。无活性线粒体(例如，先前冷冻的线粒体)、线粒体级分(蛋白质，复合物i
‑
v)、线粒体dna和rna，以及外源atp或adp通常不具有足够的功能性。
[0232]
方法
[0233]
为了允许分离有活力的有呼吸能力的线粒体，开发出分离和纯化线粒体的快速方法，该方法可以在20
‑
30分钟内执行(图1)。该方法的主要优点是：(1)其仅需要可使用#6活检穿孔器分离的少量组织(<0.01g组织)；(2)其使用标准化组织解离过程，允许组织均匀和一致的均质化，这是人工均质化方法不易实现的；以及(3)使用差别过滤而非离心来消除耗时且重复的离心步骤并缩短制备时间。简言之，使用#6活检穿孔器获得两小块骨骼肌组织(<.0.1克)。使组织在5ml体积的分离缓冲液(300mmol/l蔗糖，10mmol/l hepes
‑
koh，1mmol/
l egta
‑
koh，ph 7.4)中均质化，然后在冰上与枯草杆菌蛋白酶a酶促孵育10分钟。然后，使消化的组织过滤通过用分离缓冲液预润湿的一系列过滤器，随后通过在4℃下以9x g离心5分钟使线粒体沉淀。
[0234]
结果
[0235]
图2a
‑
2g显示从骨骼肌分离的线粒体的代表性结果。图2a显示使用活检穿孔器获得的骨骼肌组织。图2b显示在相衬照明(明视野，bf)下(左图)以及在用mitotracker red cmxros标记的荧光下(中图)的分离线粒体的代表性显微图像。合并图像显示于右图。通过该方法获得的线粒体平均具有大于99％的活力。图2c显示每克组织湿重的线粒体产量的代表性结果。图2d显示分离线粒体的代表性透射电子显微镜图像。分离线粒体是电子致密的，其中少于0.01％的线粒体破碎或受损(*)。图2e显示线粒体复合物i
‑
v的代表性活性结果。图2f显示状态3(活性)氧消耗(adp刺激的呼吸)的代表性结果。图2g显示有活力的自体胸大肌线粒体中的苹果酸诱导的(复合物i)和琥珀酸诱导的(复合物ii)氧消耗的呼吸控制指数(rci；状态3/状态4)的代表性结果。数据指示分离的线粒体维持着膜电位和活力。此外，数据指示苹果酸诱导的复合物i和琥珀酸诱导的复合物ii的氧消耗和呼吸控制指数与通过一些其他方法分离的线粒体等同。
[0236]
实施例2：分离的线粒体是存在的并且在注射到心肌中后至少28天有活力
[0237]
一旦通过如实施例1所述的方法分离，就将线粒体立即用于线粒体移植。
[0238]
线粒体剂量
[0239]
执行实验以确定自体线粒体的最佳剂量。这些实验展示2
×
105个线粒体/克组织湿重提供最佳功效。
[0240]
分离的线粒体的递送
[0241]
分离的线粒体通过血管输注直接注射到肺部的缺血区域或者通过雾化器进行递送。
[0242]
(a)：线粒体的直接注射提供了线粒体的局部分布。使用具有28g针的结核菌素注射器，将线粒体注射到肺动脉或右心房中。
[0243]
(b)：线粒体的血管内递送简化了线粒体向组织的递送并且允许自体线粒体在组织内的广泛分布。
[0244]
(c)：线粒体的雾化器递送：为了增加适用性并允许早期非手术干预和术后干预，通过雾化器将自体线粒体递送至肺部。
[0245]
血管递送提供局部递送。执行初步实验以展示通过右心房和通过肺动脉经血管内递送而递送自体线粒体的安全性和功效。初步实验的结果展示，通过这些途径中的任一种递送的自体线粒体移植提供了线粒体的组织特异性递送和摄取，并且是安全而有效的，在2小时缺血和24小时恢复后显著地增强了肺功能。
[0246]
结果
[0247]
荧光显微术和mri展示，移植的线粒体是存在的并且在注射到心肌中后至少28天有活力。大部分的线粒体初始存在于细胞间的胞间隙内。在递送后30分钟内，移植的线粒体通过内吞作用内化在细胞内，并且在位于肌节的z
‑
线之间的肌膜附近的心肌细胞内和内源性受损线粒体周围的簇中以及细胞核附近观察到。注射线粒体的计数显示43.52％
±
4.46(平均值
±
sem)的注射线粒体附着于心肌细胞或存在于心肌细胞内。三维超分辨率显微镜
和透射电镜用于确定人ips衍生的心肌细胞和原代心脏成纤维细胞中内吞的外源线粒体的细胞内命运。结果显示，分离的线粒体在数分钟内引入到心肌细胞中，然后通过胞吞作用转运到细胞中，此处它们与内源线粒体网络融合。
[0248]
图3a
‑
3d显示了心肌细胞中细胞外线粒体的摄取和内吞转运的代表性结果。图3a显示暴露于金标记的hcf线粒体2.5、5和10分钟并通过tem成像的ips
‑
cm的代表性图像。标记的线粒体具有电子致密沉积物，并且在所有三个研究时间，在细胞外部、邻近顶细胞表面、经历胞吞作用以及在细胞内部(从左到右并且由箭头指示)是明显的。图像是代表性的5分钟时的四个实验；比例尺，0.5μm。图3b显示在4小时外源线粒体与早期核内体共定位的四色3
‑
d sr
‑
sim的代表性图像。细胞核用dapi染色，并且内源性和外源性线粒体均用mtc02抗体检测。显示组合图像(左)和每种颜色(右)；比例尺，10μm。图3c显示hcf线粒体和晚期核内体在1小时的代表性覆盖显微图像；比例尺，10μm。图3d显示线粒体与溶酶体在4小时的代表性覆盖显微镜图像；比例尺，10μm。在图3c和3d中，箭头指示与每个隔室相关联的外源线粒体的实例，其也与抗线粒体mtc02抗体反应。细胞核用dapi染色，并且图像表示每个时间(0.5、1、2和4小时)分析的十二个单独体积；比例尺，0.5μm。
[0249]
移植的线粒体不是致心律失常的，如由连续12导联心电图分析和光学作图所证实。不存在室性心动过速、心动过缓、纤颤、或传导系统缺陷或复极不均一性，并且线粒体移植相关联的连续ecg、qrs持续时间或校正qt间期没有变化。在注射时或在自体线粒体移植后多至4周的任何时间，心室壁运动障碍、左室肥厚、瓣膜功能障碍、纤维化、或心包积液没有变化。另外，移植的线粒体不产生免疫或炎症反应。使用间接免疫荧光通过抗线粒体抗体测量的自身免疫反应是检测不到的。
[0250]
移植的线粒体在细胞外和细胞内均可起作用。一旦移植，线粒体就维持活力和功能至少28天，这是迄今进行的研究的时间限制。移植的线粒体也可立即增加心肌atp水平和atp合成并快速改变心肌蛋白质组。在注射后10分钟，当通过心外膜超声心动图首次观察到心室功能的改善时，蛋白质组学分析显示，与对照心脏相比，在治疗的心脏中线粒体的蛋白质途径以及用于能量和细胞呼吸的前体代谢物的生成显著更高(p<0.05，丰度得分>2.0)。在移植后10
‑
60分钟，移植的线粒体通过肌动蛋白依赖性胞吞作用内化到心肌细胞中。内化到双核心肌细胞中的线粒体数量在1小时后为每个细胞核40.9
±
11个，并且在24小时后为218.7
±
63.7个。一旦内化，移植的线粒体就进一步增加(p<0.05)细胞atp含量并且上调心脏保护细胞因子(表皮生长因子、生长相关癌基因、il
‑
6和单核细胞趋化蛋白
‑
3)。这些细胞因子通过如下方式与增强的心脏功能相关联：刺激细胞生长、增殖和迁移，增强血管形成，提供针对心肌细胞凋亡的防护，以及改善功能性心脏恢复和心肌重塑而不依赖于心肌细胞再生。局部缺血也损伤线粒体dna并减少atp合成，这种变化与人类心脏手术后的恢复不佳相关联。该实施例展示，线粒体移植以完整线粒体dna至少部分地替代了受损线粒体dna，并且拯救了心肌细胞功能。
[0251]
实施例3：动物和人类的初步研究：
[0252]
在一系列体外和体内灌注的动物心脏模型中验证线粒体移植的功效。这些研究的结果展示，线粒体移植拯救了心肌细胞活力并显著增强了缺血再灌注损伤后的缺血后心肌功能。
[0253]
在分离的灌注心脏和原位局部缺血心脏模型中使用缺血/再灌注方案，展示出自
体线粒体移植是安全而有效的。研究展示，线粒体的直接和血管递送均显著改善缺血/再灌注损伤，并且增强心肌细胞活力和心肌缺血后功能恢复。这些效应在至少28天(原位存活实验的终点)内很明显。
[0254]
具有显著iri的儿科患者需要体外膜肺氧合(ecmo)的机械支持。ecmo的使用已显示是一种挽救生命的技术，但其可能导致出血、全身炎症反应和感染的并发症，因此其仅可在有限的时间段内使用。如果在ecmo支持的持续时间内没有实现心肌恢复，则患者最终遭受ecmo的并发症，这可能在患者插管之时和之后引起iri。研究显示，不能在72小时内脱离ecmo支持的患者是严重的预后指标，总存活率<30％。执行人类实验性研究，并展示了直接注射自体线粒体显著改善了五名儿科患者的心室功能，从而实现ecmo的拔管。没有患者经历任何不良效应，并且不存在心律失常、心肌内血肿或炎症反应的并发症。该实验性研究是新型自体线粒体移植技术用于改善iri患者的心功能的首次临床应用。
[0255]
实施例4：将气雾剂形式的外源线粒体给药于呼吸道导致定位于呼吸道衬里层细胞(以及内化在其内)
[0256]
为了评价作为气雾剂形式制备并给药至呼吸道的外源线粒体是否导致定位于呼吸道衬里层细胞(以及内化在其内)，使用雾化器系统制备并给药包含标记的线粒体的气雾剂，并评估肺组织中的生物分布。
[0257]
方法
[0258]
动物模型
[0259]
肺缺血/再灌注损伤的小鼠模型被选择用于本实验。c57bl/6j小鼠被良好地表征并且是所建立的用于ali的模型，从而允许结果的比较。
[0260]
生物分布
[0261]
在大鼠而非小鼠中执行外源线粒体在肺部中的生物分布的可视化，以增强可视化和分布分析。小鼠模型无法提供足够的区域来检测生物分布。简言之，将wistar大鼠(200g)通过腹膜内注射戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉并且维持0.5％吸入异氟烷。使用20g塑料导管执行经口气管插管，并且使大鼠机械换气，潮气量10ml/kg，呼吸率130
‑
140次/分钟。在第3肋间隙执行左侧开胸术，并且暴露出肺动脉。外源线粒体的生物分布通过用
18
f罗丹明6
‑
g标记人心脏成纤维细胞线粒体来测定。在大鼠、小鼠或猪模型中使用人线粒体允许基于对单克隆抗人线粒体抗体的免疫反应性来区分天然线粒体和移植线粒体。
[0262]
血管递送
[0263]
使用具有40g针的结核菌素注射器，经由注射至左肺动脉，将
18
f罗丹明6
‑
g标记的人心脏成纤维细胞线粒体在呼吸缓冲液(250mmol/l蔗糖，20mmol/l k
‑
hepes缓冲液，ph 7.2，0.5mmol/l k
‑
egta，ph 8.0)中以0.3ml的推注形式递送。
[0264]
雾化器递送
[0265]
使用flexivent雾化器，将90μl呼吸缓冲液中的
18
f罗丹明6
‑
g标记的人心脏成纤维细胞线粒体递送至全肺，总时间为40秒(10秒雾化，继之以1分钟的常规机械通气，重复4次)。
[0266]
线粒体浓度的测量
[0267]
在递送后使得线粒体循环30分钟以使得冲刷(washout)，然后通过二氧化碳过量对大鼠处以安乐死。使用albira pet/spect/ct临床前成像系统(bruker,billerica,ma)，
通过正电子发射断层显像(pet)和微型计算机断层扫描(μct)来测定线粒体生物分布。
[0268]
定量递送线粒体的细胞摄取
[0269]
为了确认肺组织中存在外源线粒体并鉴定肺细胞摄取，从右肺和左肺获得肺切片，用石蜡固定，并经受免疫组织化学分析。
[0270]
结果
[0271]
图4a
‑
4c显示在大鼠模型中通过肺动脉经血管输注递送至肺部的
18
f罗丹明6
‑
g线粒体(6
×
107个)的结果，并且使用alvira成像系统(bruker,billerica,ma)，使用正电子发射断层显像(pet)和微型计算机断层扫描(μct)进行成像。这些结果显示线粒体向肺部的递送导致了移植线粒体在整个肺部中的特定分布。
[0272]
图5a
‑
5b显示通过雾化器和通过肺动脉递送的小鼠肺组织中的免疫组织化学检测和外源线粒体的细胞摄取的结果。使用抗人线粒体抗体(mtc02[生物素]
–
abcam,cambridge,uk,目录号:#ab79479)和vectastain elite abc(vector laboratories,burlingame,ca)和aec 底物色原(dako,agilent,santa clara,ca)，检测人心脏成纤维细胞线粒体。在大鼠、小鼠或猪模型中使用人线粒体允许基于对单克隆抗人线粒体抗体的免疫反应性来区分天然线粒体和移植线粒体。在图中，线粒体显示为黑点。线粒体在肺内皮细胞、肺细胞、实质和肺泡之内和周围检测到。
[0273]
实施例5：以气雾剂形式制备并给药于呼吸道的外源线粒体可改善急性肺缺血(ali)的症状
[0274]
为了评价以气雾剂形式制备并给药于小鼠呼吸道的外源线粒体是否足以在小鼠ali模型中改善急性肺缺血(ali)的症状，使用雾化器系统制备并给药包含标记的线粒体的气雾剂，并且执行测定以评估肺功能和完整性。
[0275]
方法
[0276]
动物模型
[0277]
使用雄性c57bl/6j小鼠(8
‑
10周)(jackson laboratory,bar harbor,me)。所有实验均获得波斯顿儿童医院的机构动物护理与使用委员会(institutional animal care and use committee at boston children’s hospital)的批准，并符合国立卫生研究院(national institutes of health)关于动物护理和使用的指南。
[0278]
线粒体分离
[0279]
从同系c57bl/6j小鼠获得的骨骼肌中分离线粒体。对于同系线粒体的单次或连续注射，不存在直接或间接、急性或慢性同种异体反应性、同种异体识别或损伤相关分子模式分子(damp)反应。简言之，解剖来自c57bl/6j小鼠的骨骼肌并立即用于分离同系线粒体。将线粒体分离，并且测定分离的线粒体的数量和活力。将分离的线粒体悬浮在0.3ml呼吸缓冲液中，并立即用于线粒体移植。
[0280]
小鼠肺ali模型：
[0281]
执行手术，左肺门闭塞2小时以诱导缺血/再灌注损伤。简言之，将c57bl/6j小鼠通过腹膜内注射戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，并在手术期间维持0.5％吸入异氟烷。使用20g塑料导管执行经口气管插管，并且使小鼠机械换气，潮气量10ml/kg，呼吸率130
‑
140次/分钟。在第三肋间隙执行左侧开胸术，并且暴露出左肺门。
[0282]
急性肺缺血：
[0283]
在呼气结束时使用微型血管夹(roboz surgical instrument co.,gaithersburg,md,usa)将左肺门闭塞2小时，潮气量降至7.5ml/kg。通过含有(60ui肝素/1ml)的肝素溶液中浸泡的纱布覆盖手术切口。在缺血期结束时，移除夹。
[0284]
实验组：
[0285]
将动物随机分成三个实验组：
[0286]
(a)：血管递送(v)：在缺血期和移除夹后立即随机选择动物，以接受0.3ml呼吸缓冲液(媒介物
‑
v)或0.3ml含有线粒体的呼吸缓冲液(线粒体
‑
v)。使用具有40g针的结核菌素注射器，经由注射至左肺动脉，将媒介物和线粒体以0.3ml的推注形式递送。通过本文所述的方法，测定线粒体浓度。
[0287]
(b)：雾化(n)：在缺血期和移除夹后立即随机选择动物，以接受90μl呼吸缓冲液(媒介物
‑
n)或90μl含有线粒体的呼吸缓冲液(线粒体
‑
n)。使用flexivent雾化器，将媒介物和线粒体递送至全肺，总时间为40秒(10秒雾化，继之以1分钟的常规机械通气，重复4次)。测定线粒体浓度。考虑到雾化器研究中2/3的更大体积(包括右叶和左叶)，使用3x浓度。
[0288]
(c)：假手术对照小鼠在不夹紧肺门的情况下经历胸廓切开术，并在返回笼之前机械换气2小时。需要假手术对照组以分离出操作期间麻醉、切口创伤和动物组织潜在创伤引起的特定效应。
[0289]
确定允许改善ali所需的最佳线粒体浓度：
[0290]2×
105个自体线粒体/克组织湿重在心脏中提供心脏保护。为了确定针对ali在肺部中的安全性和功效的最佳线粒体浓度，测试了几种剂量，具体为2
×
105、2
×
106和2
×
107个线粒体/克组织湿重。
[0291]
肺功能分析
[0292]
在恢复24小时后(缺血肺的再灌注)，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉小鼠。使用塑料18g导管执行气管造口术或气管内插管，并使小鼠机械换气。执行中间剖腹术和胸骨切开术以暴露出肺部，并夹住左肺门以评估损伤左肺的功能。潮气量(tv)降至5ml/kg，然后将小鼠连接到专门的啮齿动物呼吸机(flexivent,scireq,montreal,quebec,canada)以评估左肺的吸气峰压(peak inspiratory pressure，pip)、呼吸系统阻力(resistance of respiratory system，rrs)、呼吸系统顺应性(compliance of respiratory system，crs)、呼吸系统弹性(elastance of respiratory system，ers)和组织阻尼(tissue damping，g)。
[0293]
损伤相关分子模式分子(damp)分析
[0294]
为了确定是否存在与注射同系或同种异体线粒体相关联的damp相关损伤，检测循环游离线粒体dna。使用允许估计循环游离mtdna的独特引物，并且该方法考虑了可影响mtdna的精确定量的细胞核和线粒体插入序列。简言之，使用dneasy blood&tissue试剂盒根据制造商的说明书(qiagen,valencia,ca)提取总dna(细胞核和线粒体)。dna通过nanodrop 2000(thermo scientific,wilmington,de)定量并调节至10ng/ul。通过定量实时聚合酶链反应来分析循环游离线粒体dna(mtdna)。
[0295]
用于小鼠mtdna(mmitof1(5
′→3′
)ctagaaaccccgaaaccaaa(seq id no:1)；mmitor1(5
′→3′
)ccagctatcaccaagctcgt(seq id no:2))以及小鼠β
‑
2微球蛋白(mb2mf1：(5
′→3′
)atgggaagccgaacatactg(seq id no:3)；mb2mr1：(5
′→3′
)：
cagtctcagtgggggtgaat(seq id no:4))的引物(eurofins genomics,louisville,ky)用于扩增小鼠mtdna。使用quantifast sybr green pcr试剂盒(qiagen,valencia,ca)执行实时pcr。使用eppendorf mastercycler ep realplex2仪器(eppendorf,hauppauge,ny)执行所有测定。实时pcr(qpcr)条件由以下组成：在95℃下预孵育5分钟，继之以在95℃下变性10秒、在56℃下退火15秒和在60℃下延伸15秒的40个循环。在qpcr运行完成之后，执行熔融曲线分析，包括在95℃下熔融5秒，在65℃下冷却60秒，继之以加热至95℃并连续监测荧光，最终在40℃下冷却30秒。使用公式2
‑
δct(δct＝ctmtdna
‑
ctb2m)，将mtdna倍数变化归一化为单拷贝细胞核dna。
[0296]
成像染色肺组织以评估肺完整性
[0297]
收集肺部并分成3等份。肺部的上部用于通过计算湿/干(w/d)重量比来评估组织水肿。收集后立即对肺部称重(湿重)，放入70℃烘箱中72小时，然后再次称重(干重)并计算w/d重量比。立即将肺部的中部固定在10％福尔马林中。将组织石蜡包埋并以5μm厚度切片。连续切片用于苏木精和伊红(h&e)染色、髓过氧化物酶染色和tunel测定。肺部的底部分用于透射电子显微镜分析肺部的结构损伤。使用评分系统，将h&e染色的切片评价为肺损伤严重程度的读数。分析每个切片的二十五个随机(20x)视野。基于炎性细胞在空气空间或血管壁中的浸润或聚集，对肺损伤进行分级：
[0298]
等级1：仅壁；
[0299]
等级2：气腔(air space)中的少数细胞(1
‑
5个细胞)；
[0300]
等级3：中度；以及
[0301]
等级4：重度(气腔充血)。
[0302]
对于间质充血和透明膜形成，使用以下等级：
[0303]
等级1：正常肺；
[0304]
等级2：适度(肺切片的25％)；
[0305]
等级3：中度(肺切片的25
–
50％)；以及
[0306]
等级4：重度(肺切片的50％)；
[0307]
对于出血，使用以下等级。
[0308]
等级0：不存在；以及
[0309]
等级1：存在。
[0310]
结果
[0311]
图6显示2小时左肺ali缺血和24小时恢复后小鼠肺部的代表性宏观图像。经受缺血程序的肺部用红色圆圈表示。右肺以r显示，左肺以l显示。心脏(h)显示在每个图像中。媒介物肺部表现出严重水肿和细胞损伤(媒介物
‑
v)。相比之下，接受线粒体治疗的肺部保留宏观细胞结构。
[0312]
图7a
‑
7b显示了小鼠肺部中的肺完整性，特别是肺阻力和弹性的定量量度(n＝4)。在24小时恢复后经受过2小时左肺缺血的小鼠肺部中测量阻力(图7a)和弹性(图7b)。媒介物或线粒体通过左肺动脉(v)经血管内或者通过雾化器(n)递送。线粒体的浓度为2
×
107个线粒体/克肺组织湿重。通过雾化器递送的线粒体为6
×
107个线粒体/克肺组织湿重，以考虑增加的肺体积。这些结果展示，与媒介物处理的肺部相比，通过血管或通过使用雾化器的气雾剂递送的线粒体移植显著地保留肺阻力和弹性。结果也显示，在假手术对照(无缺血)
与接受通过左肺动脉经血管内或通过雾化器递送的线粒体的缺血肺之间没有显著差异。对于组织阻尼和肺顺应性获得了类似的结果。
[0313]
图8a显示了通过实时pcr对仅接受呼吸缓冲液(假手术)或线粒体(3
×
107个，呼吸缓冲液中)的balb/cj小鼠中的全血样本测定的循环游离mtdna的定量。在i.p.注射后10天获得血样。将mtdna倍数变化(平均值
±
sem)归一化为单拷贝细胞核dna(β
‑
2微球蛋白)。结果显示与假手术相比，线粒体注射的循环游离mtdna没有增加(p＝0.96)。图8b显示苏木精和伊红染色的肺组织的代表性显微图。图8c显示masson的三色染色的肺组织的代表性显微图。肺组织学显示与假手术相比，在线粒体注射的连续肺切片中没有超微结构差异。所有切片显示来自呼吸道和肺泡的正常上皮。图8d显示来自右下叶的代表性透射电子显微照片。电子显微镜图像显示了所有组中保留的内皮和基底膜。比例尺为1um。箭头指示肺泡腔。肺组织的组织学和电子显微镜分析显示没有炎症或细胞损伤的证据。如由ttc染色所确定，不存在心肌细胞坏死的证据，并且没有心肌组织或肺内皮或基底膜损伤中胶原蛋白含量增加的证据。
[0314]
实施例6：以气雾剂形式制备并给药于呼吸道的外源线粒体足以改善猪ali模型中的症状
[0315]
猪肺具有与人肺相当的体积，这使得其成为研究呼吸功能的有利模型。猪肺具有与人肺相当的细胞谱系和组成。猪气道的一般解剖分布概括了人的解剖分布，有一些微小的例外。猪气道周围的软骨在分布上比在人类中更广泛，在气管支气管树中向下延伸得更远。猪肺在到达小叶前的最后一个软骨板后仅具有3代细支气管，而人具有大约10代。其他较小的差异包括比人类中更长的猪末端细支气管以及更短且更不明确的猪呼吸细支气管。同样类似于人，猪在呼吸道中具有一整套先天免疫效应，以保护粘膜表面，引发炎症反应以及协调适应性免疫反应。因此，使用与在人类中使用的相同的仪器和方案在较大动物模型(例如，猪模型)中进行重复实验可以提供与人类中的临床使用更好的相关性。
[0316]
方法
[0317]
动物模型
[0318]
将yorkshire猪(雄性和雌性，40
‑
50kg)随机分配至每组。
[0319]
猪模型在临床相关性方面具有许多优点。猪生理学与成人高度相似，并且该模型可在转化为人类实施之前为实验证明提供手术相关性。猪肺是正常人肺的优异模型，并且是已建立的肺缺血
‑
再灌注损伤模型。
[0320]
实验方案
[0321]
用telazol(4
‑
6mg/kg，im)和赛拉嗪(1.1
‑
2.2mg/kg，im)诱导猪，随后放置耳静脉导管。用带套囊气管内导管对动物插管，并经由容量控制通气进行机械换气，调整tv 10ml/kg、fio
2 0.4、peep 5cm h2o、rr 12
‑
15次呼吸/分钟，以获得基线paco
2 35
‑
45mmhg。用异氟烷(多至3％)诱导全身麻醉，并使用0.5
‑
4％维持。
[0322]
采血样
[0323]
经皮放置股动脉导管以监测平均动脉压(map)并在整个程序中进行动脉血采样。另选地，可利用经由切口放置的颈动脉导管。股静脉或颈静脉可用经皮放置的导管插管，以用于cvp监测和静脉血采样。在这些血管不能使用超声插入导管的情况下，执行切开，并且在直接可视化下将导管放置在血管中。然后用vicryl或pds线(4
‑
0)缝合伤口。在夹住左肺
门以达到目标act>300秒之前，经由耳静脉给予肝素钠200ui/kg。在整个手术中检查act，如有必要，可用额外的肝素剂量调节凝血，以保持act>300秒。如果手术期间发生心室纤颤，则给予受试者1％利多卡因(5ml，iv)。在整个程序中经由耳静脉或股静脉输注乳酸林格氏液或盐水以支持动脉血压。在验证深度麻醉后，在第5肋间隙执行左侧开胸术，从而进入左肺门。另选地，如果在胸廓切开术方法中进入肺门受限，则可使用正中胸骨切开术。肺动脉用pvc脐导管插管，以用于pap监测。然后，使用pvc脐导管经由左心耳对左心房插管以测量lap并用于采血样。使用加热垫连续监测和维持核心温度。
[0324]
血流监测
[0325]
可以解剖升主动脉和主肺动脉，并附接跨音速流探针以监测血流。
[0326]
心肌功能评估
[0327]
可通过将电导导管直接放置入rv和lv腔中来评估心肌功能。导管可以通过荷包缝合插入。荷包缝合可防止出血，并可将导管固定在适当位置。另选地，rv导管可经由颈静脉经中央静脉系统放置。记录可在整个实验中连续获得。
[0328]
超声心动图
[0329]
可执行心外膜超声心动图以确定心肌功能。在基线、临注射自体线粒体或呼吸缓冲液之前以及注射后3小时，获得心外膜2d超声心动图。
[0330]
线粒体分离
[0331]
可对胸大肌或腹直肌进行定位和解剖，并可使用活检穿孔器通过手术提取出两小块肌肉组织(约0.01g)，并用于在无菌条件下进行线粒体分离。为了维持临床相关性，在符合目前实验室标准的情况下，线粒体分离可在少于30分钟内执行。
[0332]
左肺急性缺血
[0333]
左主支气管可剥离1cm长度以切除任何支气管循环。夹住肺门
‑
动脉、静脉和支气管90分钟。可针对单肺通气将通气调节至tv 6ml/kg、peep 5cmh2o，基于so2水平调节fio2。单肺通气维持90分钟。如果在缺血时段期间最大气道压力pmax增加至高达20
‑
22cmh2o，则容量控制通气可切换到pmax 20
‑
22cmh20的压力控制通气，从而防止肺气压伤。在不存在吸气和呼气运动时，可通过收缩的左肺视觉上确认支气管夹紧。
[0334]
实验组：
[0335]
(a)假手术对照组——可将左肺门解剖但不夹紧(不存在左肺缺血)并且可监测动物90分钟，然后在再灌注期间再监测3小时。在左肺缺血90分钟后，可释放肺门夹，并且左肺接受单次注射的15ml无菌呼吸缓冲液(媒介物
‑
v)或单次注射的15ml含有线粒体的无菌呼吸缓冲液(线粒体
‑
v)。
[0336]
(b)线粒体或媒介物注射的血管递送可使用18g针以推注给药于左肺动脉。注射部位可用4
‑
0号prolene缝合线缝合以控制出血。
[0337]
(c)雾化器递送可使用附连到呼吸器管路的商业级雾化器(allied health care)执行。
[0338]
再灌注可持续3小时的时段。在该时间期间使动物保持麻醉。
[0339]
数据收集
[0340]
map、cvp、pap、lap将在基线、再灌注时段开始时、临注射自体线粒体或呼吸缓冲液前、以及再灌注期间1、2、3小时记录。在基线、再灌注时段开始时、临注射自体线粒体或呼吸
缓冲液前、以及再灌注期间1、2、3小时，将执行吸气峰压、吸气平台压以及abg的动脉和混合静脉血的呼吸测量。
[0341]
支气管肺泡灌洗
[0342]
可在再灌注时段结束时执行左肺和右肺灌洗。在引入导管通过口部经气管先进入左肺的尾叶中，然后进入右肺之后，可在支气管镜引导下执行灌洗。然后可将30ml盐水引入肺部中，并且可在一分钟后吸出流体。此后，可将另外15ml盐水引入肺部中，并且在一分钟后吸出。吸出的流体可作进一步分析。bal流体可立即在4℃下以500x g离心5分钟，并且可收集上清液并在
‑
80℃储存，直到进一步分析以测定细胞因子和趋化因子的表达水平。细胞因子和趋化因子分析可通过eve technology(calgary,ab,canada)执行。可测试以下生物标记：嗜酸细胞活化趋化因子、g
‑
csf、gm
‑
csf、ifnγ、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12(p40)、il
‑
12(p70)、il
‑
13、il
‑
15、il
‑
17a、ip
‑
10、kc、lif、lix、mcp
‑
1、m
‑
csf、mig、mip
‑
1α、mip
‑
1β、mip
‑
2、rantes、tnfα、vegf。所有样本可一式三份运行。
[0343]
主要结果测量
[0344]
在基线、再灌注时段开始、自体线粒体或呼吸缓冲液临处理前、以及再灌注的1、2、3小时，可以执行血液动力学测量，包括例如hr、lvpdp、cf、lvedp、 dp/dt、co、pvr、lap，以及肺功能测量，包括例如氧
‑
pao2、ppvo2、oi、so2、aado2、顺应性、弹性、阻力、cdyn、peep、ccs、pip、rrs、crs、ers和g(左肺的组织阻尼)和肺压、容量环。在再灌注时段结束时执行左肺和右肺的支气管肺泡灌洗。可以测定生物化学和蛋白质组学、细胞因子、趋化因子和免疫反应。可通过分析ppi、oi、组织学和炎性细胞因子的表达来检查肺部炎症反应。可通过tunel和肺水肿来测定肺细胞凋亡。可以测定每个线粒体浓度的缺血前后的肺功能，并且可以执行生物化学和组织学分析以测定每个浓度的功效。
[0345]
统计计划和数据分析
[0346]
功效分析指示每组6只动物的样本量提供了超过85％的功效来检测等于组内标准偏差两倍的差异(α＝0.05，双侧)，以及82％来检测等于组内标准偏差2.5倍的差异(α＝0.0083，双侧，用于5组之间的事后比较的bonferroni调整显著性标准)。对于发现的存在/不存在，每组6只动物将具有95％的功效检测到在至少40％的动物中发生的效应，而每组10只动物将具有95％的功效检测到在至少26％的动物中发生的效应。假设采用独立组student t
‑
检验(nquery advisor 7.0版,statistical solutions,cork,ireland)的合并标准偏差为10％(效应大小＝1.0)，10只动物的样本可提供80％的统计功效(双尾α＝0.05，β＝0.20)来检测治疗组与对照组之间10％或更大的平均差异。该样本量也可提供80％功效，以使用mann
‑
whitney u
‑
检验功效来捕获组之间的24小时差异。基于初步研究和动物死亡率，通常每个实验组由约6至10只动物组成。对于所有变量，计算所有数据的平均值
±
平均值的标准误差。如果数据是正态分布的，则使用配对双尾student的t
‑
检验进行简单的介入前后比较，或者对于其他连续数据进行wilcoxon signed rank检验。当对于动物仅存在单个正态分布变量时，使用单因素方差分析来比较组，并在广义线性模型框架中扩展以评估其他变量的效应。在对动物进行多次测量的情况下，混合模型方差分析(mm
‑
anova)可用于评估以组和/或药物作为固定效应的统计显著性，并将随时间推移的重复测量作为受试者内因素引入。通常，自回归相关(ar(1))相关性可用于建模随时间推移的测量之间的关
系。ar(1)是用于随时间推移对数据进行建模的标准方法，并且意味着距离越近的测量比距离越远的测量更相关。对于非正态分布的变量，可执行数据变换以归一化数据(例如，对数变换)，或者可使用广义估计方程来分析数据。
[0347]
统计显著性
[0348]
p<0.05阈值指示统计显著性。使用bonferroni校正来调整组之间的事后比较以用于多重比较。可使用fisher的精确检验来比较功效。随机化可以使用r软件包基于使用uniform(0,1)数发生器的1:1分配来执行。可使用sas 9.3版(sas institute,cary,nc)进行统计分析。
[0349]
结果
[0350]
预期以气雾剂形式制备并给药于呼吸道的外源线粒体足以改善猪ali模型中的症状。
[0351]
实施例7：以气雾剂形式制备并给药于呼吸道的外源线粒体足以改善小鼠ali模型中的症状
[0352]
为了评价以气雾剂形式制备并给药于小鼠呼吸道的外源线粒体是否足以在小鼠ali模型中改善急性肺缺血(ali)的症状，使用雾化器系统制备并给药包含标记的线粒体的气雾剂，并且执行测定以评估肺功能和完整性。
[0353]
方法
[0354]
动物
[0355]
使用雄性c57bl/6j小鼠(8
‑
10周，n＝35；jackson laboratory,bar harbor,me)。所有实验均获得波斯顿儿童医院的机构动物护理与使用委员会(institutional animal care and use committee at boston children’s hospital)的批准，并符合国立卫生研究院(national institutes of health)关于动物护理和使用的指南。
[0356]
线粒体分离
[0357]
解剖来自c57bl/6j小鼠(n＝6)的腓肠肌并立即用于分离同系线粒体。将线粒体分离，并且如前所述测定分离的线粒体的数量和活力。将分离的线粒体悬浮在用于血管递送组的0.3ml呼吸缓冲液(250mmol/l蔗糖，20mmol/l k
‑
hepes缓冲液，ph 7.2,0.5mmol/l k
‑
egta，ph 8.0)或用于雾化递送组的90μl呼吸缓冲液中，并立即用于线粒体移植。
[0358]
小鼠肺iri模型：
[0359]
实验方案显示于图1中。手术根据先前描述的程序执行，作出了若干修改。简言之，将c57bl/6j小鼠(n＝29)通过腹膜内注射戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，并在手术期间维持0.5％吸入异氟烷。使用20g塑料导管执行经口气管插管，并且使小鼠机械换气，潮气量10ml/kg，呼吸率130
‑
140次/分钟。在第3肋间隙执行左侧开胸术，并且暴露出左肺门。在呼气结束时使用微型血管夹(roboz surgical instrument co.,gaithersburg,md,usa)将左肺门闭塞2小时，潮气量降至7.5ml/kg。通过含有(60ui肝素/1ml)的肝素溶液中浸泡的纱布覆盖手术切口。在缺血期结束时，移除夹。将动物随机分成2个实验组：血管递送(v)或雾化(neb)组。在再灌注开始时的血管递送组中，使用具有40g针的结核菌素注射器，经由注射至左肺动脉，将0.3ml呼吸缓冲液中的1
×
108个线粒体(mito v，n＝6)或0.3ml呼吸缓冲液(媒介物v，n＝7)递送至左肺。在再灌注开始时经由雾化组的递送中，将90μl呼吸缓冲液中的3
×
108个线粒体(mito neb，n＝6)或90μl呼吸缓冲液(媒介物neb，n＝6)递送至全肺，总时间
为40秒的(10秒雾化，继之以1分钟的常规机械通气，重复4次)。允许小鼠恢复并返回其笼中24小时。假手术对照小鼠(假手术，n＝4)在不夹紧肺门的情况下经历胸廓切开术，并在返回笼之前机械换气2小时。
[0360]
线粒体生物分布和摄取
[0361]
在额外的实验中，wistar大鼠(200
‑
250g，n＝6，charles river laboratories,worcester,ma)用于肺部中线粒体摄取的可视化。供体大鼠(n＝2)用于同系线粒体分离和
18
f
‑
罗丹明6g线粒体标记。将wistar大鼠(n＝3)麻醉并维持2
‑
3％吸入异氟烷。然后，在一组大鼠中执行胸骨切开术并暴露出肺动脉干。使用具有30g针的结核菌素注射器，经由注射到肺动脉干，将
18
f
‑
罗丹明6g标记的线粒体(1
×
109个，0.5ml呼吸缓冲液中)递送至肺部。
[0362]
在另一组wistar大鼠(n＝3)中，将
18
f
‑
罗丹明6g标记的线粒体(1
×
109个，0.3ml呼吸缓冲液中)以气雾剂经由喷雾递送至肺部。
[0363]
在递送线粒体后十分钟，使动物在co2室中安乐死，并通过正电子发射断层显像(pet)和微型计算机断层扫描(μct)成像。
[0364]
在一组单独的c57bl/6j小鼠(n＝4)中，如前所述
29
从人心脏成纤维细胞中分离线粒体，并经由雾化器和经由肺动脉递送至小鼠肺组织。在小鼠肺部中使用人线粒体允许基于对单克隆抗人线粒体抗体(生物素
‑
mtco2，abcam,cambridge,ma)的免疫反应性来区分内源小鼠线粒体和移植人线粒体。使用抗人线粒体抗体来检测线粒体，并如前所述使用vectastain(vector laboratories,burlingame,ca)和aec 底物色原(dako,agilent,santa clara,ca)可视化。
[0365]
肺功能
[0366]
在再灌注24小时之后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉小鼠。使用塑料18g导管执行气管造口术和气管内插管，并使小鼠机械换气。接着，执行中间剖腹术和胸骨切开术以暴露出肺部，并夹住右肺门以评估损伤左肺的功能。tv降至5ml/kg，然后将小鼠连接到专门的啮齿动物呼吸机(flexivent,scireq,montreal,quebec,canada)，以评估左肺的呼吸系统的动态顺应性(dynamic compliance)、呼吸系统阻力(resistance)、组织阻尼(作为外周组织阻力的指标)、吸气峰压以及深吸气量。
[0367]
组织分析
[0368]
在再灌注24小时之后，收集左肺并将每个肺部分成3份。
[0369]
左肺的上部用于通过计算湿/干(w/d)重量比来评估组织水肿。收集后立即对肺部称重(湿重)，放入70℃烘箱中72小时，然后再次称重(干重)并计算w/d重量比。
[0370]
立即将左肺的中部固定在10％福尔马林中。将组织石蜡包埋并以5μm厚度切片。连续切片用于苏木精和伊红(h&e)染色、髓过氧化物酶染色和tunel测定。
[0371]
使用先前描述的评分系统，评价h&e染色的切片的肺损伤严重程度。分析每个切片的五个随机(15x)视野。使用以下项对肺损伤进行分级：等级1代表正常的肺组织学；等级2指示轻度嗜中性白血细胞浸润以及轻度至中度间质充血；等级3代表中度嗜中性白血细胞浸润、血管周围性水肿形成以及肺结构的部分破坏，并且等级4包括密集嗜中性白血细胞浸润、脓肿形成以及肺结构的完全破坏。
[0372]
如前所述执行髓过氧化物酶(mpo)染色，并评价切片的嗜中性粒细胞浸润。在每个切片的5个随机(15x)视野中测定嗜中性粒细胞的数量。
[0373]
tunel测定如前所述执行
29
。tunel
‑
阳性细胞核的数量表示为在每个切片的16个随机(10x)视野中计数的所有细胞的百分比。
[0374]
左肺的底部分如前所述用于透射电子显微镜(tem)以分析肺部的结构损伤。
[0375]
支气管肺泡灌洗(bal)分析
[0376]
在肺功能评估之后，使用1ml盐水溶液，使左肺经历bal。将bal流体立即在4℃下以500x g离心5分钟，并且收集上清液并在
‑
80℃储存，直到通过eve technology(calgary,ab,canada)进一步分析以测定细胞因子和趋化因子的表达水平。测试以下生物标记：嗜酸细胞活化趋化因子、g
‑
csf、gm
‑
csf、ifnγ、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12(p40)、il
‑
12(p70)、il
‑
13、il
‑
15、il
‑
17a、ip
‑
10、kc、lif、lix、mcp
‑
1、m
‑
csf、mig、mip
‑
1α、mip
‑
1β、mip
‑
2、rantes、tnfα、vegf。所有样本一式三份运行。
[0377]
统计分析
[0378]
所有数据由对治疗不知情的观察者收集。所有数据表示为平均值
±
平均值的标准误差(sem)。通过非参数mann
‑
whitney u检验对除bal分析结果以外的所有数据执行统计分析，其中用单因素方差分析来评价组间比较。通过精确的双尾p<0.05来定义统计显著性。
[0379]
结果
[0380]
放射性标记的线粒体的肺摄取
[0381]
经由血管递送(图9a)或经由雾化(图9b)而递送的
18
f
‑
罗丹明6g放射性标记的线粒体被肺部广泛地吸收，并且不存在于身体的任何其他区域中。
[0382]
人线粒体的肺组织摄取
[0383]
经由血管递送(图10a)或经由雾化(图10b)而递送的来自人心脏成纤维细胞的外源线粒体在肺内皮细胞、肺细胞、实质和肺泡之内和周围检测到。
[0384]
肺功能性能
[0385]
在缺血2小时和再灌注24小时之后，经由血管递送接受线粒体的小鼠具有显著增加的动态顺应性(10.79
±
1.11μl/cmh2o)和深吸气量(0.24
±
0.02ml)以及显著减少的阻力(2.02
±
0.28cmh2o)、组织阻尼(10.49
±
0.91cmh2o/ml)和吸气峰压(9.48
±
0.40cmh2o)，并且与媒介物v(分别为5.91
±
0.46，.0.127
±
0.01，3.33
±
0.40，20.02
±
2.75和11.96
±
0.74，各自p<0.05；图11a
‑
e)进行比较。mito v组中的所有肺功能参数与假手术肺(分别为9.75
±
0.35，.0.18
±
0.01，1.51
±
0.20，9.46
±
0.63和8.62
±
0.20，各自p>0.05；图11a
‑
e)相比并没有显著不同。深吸气量(p>0.05)除外，媒介物v肺中的所有参数与假手术肺相比均显著不同(p<0.05)。
[0386]
在缺血2小时和再灌注24小时之后，经由雾化接受线粒体的小鼠具有显著增加的动态顺应性(7.88
±
1.05ul/cmh2o)和深吸气量(.0.18
±
0.02ml)以及显著减少的阻力(2.13
±
0.23cmh2o)、组织阻尼(13.63
±
1.55cmh2o/ml)和吸气峰压(1.0.18
±
0.40cmh2o)，并且与媒介物neb(分别为5.13
±
0.93，.0.10
±
0.02，4.74
±
0.83，34.02
±
5.04和11.82
±
0.53，各自p<0.05；图12a
‑
d)进行比较。
[0387]
mito neb组中的所有肺功能参数与假手术肺(分别为9.75
±
0.35，.0.18
±
0.01，1.51
±
0.20和9.46
±
0.63，各自p>0.05；图3d
‑
f、i、j)相比并没有显著不同，吸气峰压(8.62
±
0.20，p<0.05)除外。媒介物neb肺中的所有参数与假手术肺相比显著地不同(p<0.05)。
[0388]
代表性的压力
‑
容量环展示，与mito v、mito neb和假手术组相比，媒介物v和媒介
物neb具有较低的肺容积容量和较高的压力(图13)。
[0389]
肺组织损伤
[0390]
h&e分析显示，分别与媒介物v和媒介物neb相比，在mito v和mito neb肺中，炎性细胞浸润和间质充血显著减少，且无肺结构破坏的迹象(等级1.8
±
.0.1，等级2.5
±
.0.1；分别对于血管递送组；等级1.7
±
.0.1，等级2.5
±
.0.1；分别对于雾化组，两者均p<0.05；图14、图15a
‑
e)。与所有组相比，在假手术肺中观察到显著改善的肺组织保留(等级1.3
±
.0.1，p<0.05)。
[0391]
分别与媒介物v和媒介物neb相比，在mito v和mito neb组中观察到嗜中性粒细胞计数的显著减少(120.2
±
5.5，159.9
±
6.5；分别对于血管递送组；77.8
±
3.8，125.7
±
4.9；分别对于雾化组，两者均p<0.05，图14、图15b、图15e)。与mito v、媒介物v和媒介物neb肺相比，假手术肺中的嗜中性粒细胞计数显著减少(55.3
±
3.6,p<0.05)。与mito neb相比，并未观察到假手术组中的嗜中性粒细胞的数量的显著差异(p>0.05)。
[0392]
tunel分析显示出，分别与媒介物v和媒介物neb相比，在mito v和mito neb组中观察到凋亡阳性细胞核的计数的显著减少(1.38
±
0.25，1.55
±
.0.18；分别对于血管递送组；3.1
±
0.38，3.15
±
0.25；分别对于雾化组，两者均p<0.05)。与mito v和mito neb组相比，假手术肺中凋亡阳性细胞核计数并没有显著差异(0.3
±
.0.1，p<0.05)(图14、图15c、图15f)。
[0393]
在再灌注24小时后，来自左下叶的tem显示出媒介物v和neb以及mito v和neb中保留的内皮和基底膜。肺泡腔没有差异。这指示不存在基膜损伤(图4)。
[0394]
在媒介物v左肺(88.9
±
0.5％)与右肺(87.1
±
1.1％)，mito v左肺(88.5
±
0.3％)与右肺(88.3
±
0.6％)，媒介物neb左肺(87.5
±
1.1％)与右肺(89.2
±
1.1％)，以及mito neb左肺(88.5
±
1.2％)与右肺(89.3
±
0.6％)和假手术左肺(88.7
±
1.0％)与右肺(9.0.1
±
1.0％；各自p>0.05；图15g)之间，在湿干重百分比方面没有发现显著差异。
[0395]
支气管肺泡灌洗细胞因子
[0396]
在再灌注的24小时，各组之间的细胞因子和趋化因子没有显著差异(图16)。
[0397]
讨论
[0398]
在iri期间，由活性氧物类诱导的毒性、细胞生物能量学的失效、上调的细胞凋亡、细胞因子产生和先天免疫组成的线粒体损伤在急性肺损伤中发挥着显著作用。在该研究中，我们已经展示了线粒体移植在肺iri的小鼠模型中的功效和安全性。缺血损伤后再灌注24小时之后，线粒体移植改善了肺功能性能并减少了肺组织损伤。
[0399]
先前探索小鼠肺iri的研究利用60分钟至90分钟的缺血时间。这些实验提供了肺组织损伤的详细分析。然而，它们并未提供任何功能分析，或者是在非生理的分离的离体系统中测量肺功能。在我们的研究中，使用flexivent机器，从而实现体内功能测量。基于我们的初步实验，我们选择2小时的缺血时间。较短的缺血时间导致肺iri不足，并且将不允许在我们的研究组之间进行功能评价和比较分析。
18
f
‑
罗丹明6g放射性标记的线粒体用于展示递送的线粒体的分布。我们经由血管递送或雾化来递送放射性标记的线粒体。我们的结果显示了两组中整个肺部的线粒体分布。沿着气管和支气管树发现了经由雾化以气雾剂递送的线粒体，这表明线粒体在第一接触期间粘附到了气道组织。
[0400]
在我们的研究中，人线粒体用于测定移植线粒体的细胞摄取。人线粒体允许移植线粒体的靶向标记，因此排除了标记内源性小鼠线粒体的可能性。在整个肺部的所有细胞
中发现了人线粒体，这展示了经由脉管系统或雾化递送的线粒体被有效地移植。
[0401]
在该研究中使用两种不同的线粒体递送方法。线粒体可经由脉管系统递送到靶器官。为了允许侵入性较小但仍临床相关且容易使用的方法，经由雾化的递送被用作额外的研究组。在再灌注24小时之后，当与媒介物肺相比时，经由血管递送和雾化在接受线粒体的肺中观察到显著的功能改善。在一个功能参数pip中，在mito v与媒介物v之间观察到显著差异，但当比较mito neb与媒介物neb时未观察到显著差异。这可能意味着经由脉管系统递送的线粒体的有效性提高。然而，该观察可由以下事实来解释：经由雾化递送的线粒体不像经由脉管系统递送的线粒体被递送地那样远，并且优选的是递送较高浓度的线粒体，因为它们也摄取至气管和支气管树。执行实验以确定通过雾化递送的最佳线粒体浓度是必要的。还重要的是需注意，组织分析显示当与它们的媒介物组相比时，mito v和mito neb两者在再灌注24小时后的细胞活力显著改善。
[0402]
总之，我们已经展示了线粒体移植在肺iri的鼠模型中的功效和安全性。缺血损伤后再灌注24小时之后，线粒体移植改善了肺功能并减少了肺组织损伤。这些结果表明，该疗法可用于保护肺组织免受iri，因此降低了如以下几种临床情形下的发病率和死亡率：肺移植、心肺复苏术、肺栓塞、败血症和低血压事件以及心肺转流术或机械循环支持期间的程序。
[0403]
其他实施方案
[0404]
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式对本发明进行了描述，但是前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改形式在以下权利要求书的范围之内。