毛兰素在制备靶向抑制AKT激活的抗膀胱癌药物中的应用的制作方法

毛兰素在制备靶向抑制akt激活的抗膀胱癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及毛兰素在制备靶向抑制akt激活的抗膀胱癌药物中的应用。


背景技术：

2.akt也称蛋白激酶b(protein kinase b,pkb)，是1991年发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，存在于哺乳动物中，由三种不同的基因翻译成三种亚型：akt1、akt2和akt3，在控制细胞存活和凋亡中起着至关重要的作用。其功能除了涉及细胞周期调控，凋亡启动等细胞生存调节外，还参与血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多重要的生理及病理过程。目前的研究发现，akt是肿瘤发生的重要信号分子,其亚型akt2是由481个氨基酸组成的蛋白质,当其第308位的丝氨酸和473位的苏氨酸磷酸化时,激酶活性增高,发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。细胞周期调控方面，活化的akt可以直接磷酸化其下游靶点mtor使其激活，启动细胞周期。p21、p27是细胞周期的负调控因子，能够导致细胞周期停止，阻断增殖。akt负性调节p21、p27的表达，通过磷酸化使其失活，抑制其对细胞周期造成的阻滞作用，从而促进g1期发展，细胞增殖与分化加快。由于akt在基因的表达调控和细胞凋亡中发挥着重要作用，因此其被作为多种肿瘤治疗的靶点。
3.毛兰素是从中药鼓槌石斛中分离得到的联苄类化合物，化学名为2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-乙基]-苯酚。有研究发现，毛兰素可增加细胞内药物蓄积，发挥抗肿瘤多药耐药作用，多机制抑制肿瘤的生长，并引起不可修复的dna损伤等。毛兰素不仅对骨肉瘤有抑制作用，还可以通过活化jnk/c-jun信号通路，从而促进乳腺癌细胞凋亡，最终达到抑制细胞增殖的目的。近年来，毛兰素在抗肿瘤治疗中有着高效的抗癌效果而备受关注。
[0004]
虽然毒副作用小的毛兰素在很多癌症抑制方面有较多研究，但是在抗膀胱癌细胞t24方面的研究较少。目前，毛兰素是否能有效靶向抑制akt激活，从而抑制膀胱癌细胞t24增殖不是很清楚。


技术实现要素：

[0005]
本发明旨在解决上述技术问题，提供毛兰素在制备靶向抑制akt治疗膀胱癌药物中的应用。
[0006]
本发明的技术方案为：
[0007]
毛兰素在制备靶向抑制akt激活的抗膀胱癌药物中的应用。
[0008]
所述毛兰素通过降低p-akt、akt的表达，同时上调细胞周期相关蛋白p27、p21表达，使细胞周期阻滞于g1期，从而抑制膀胱癌t24细胞的增殖。
[0009]
作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛兰素在制备阻断膀胱癌细胞周期的药物的应用。
[0010]
作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛兰素在制备上调膀胱癌细胞周期相
关蛋白表达量的药物中的应用，所述细胞周期相关蛋白为p27或/和p21。
[0011]
作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛兰素在制备抑制膀胱癌t24细胞增殖的药物中的应用。
[0012]
作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛兰素在制备抑制膀胱癌t24细胞克隆形成的药物中的应用。
[0013]
本发明的另一目的是提供一种产品。
[0014]
本发明提供的产品其活性成分为毛兰素，所述产品的用途为如下(1)-(4)中的至少一种：
[0015]
(1)靶向抑制akt激活；
[0016]
(2)阻断膀胱癌细胞周期；
[0017]
(3)上调膀胱癌细胞周期相关蛋白表达量；
[0018]
(4)抑制膀胱癌t24细胞增殖；
[0019]
(5)抑制膀胱癌t24细胞克隆形成。
[0020]
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
[0021]
本发明通过研究，发现毛兰素对膀胱癌细胞t24具有良好的体外抗肿瘤效应，对膀胱癌细胞t24增殖具有明显的抑制作用，并随着药物浓度的增加而抑制作用增强；也能够将t24细胞阻滞于g0/g1期；在毛兰素浓度为15.6-125ng/ml时，能够降低p-akt蛋白表达含量，在较高浓度250ng/ml时对akt蛋白表达含量产生抑制作用，并上调细胞周期相关蛋白p21和p27的表达。本发明提供了石斛有效成分毛兰素靶向抑制akt的表达，拓宽了毛兰素的医药用途，为治疗膀胱癌提供新的治疗方案。
附图说明
[0022]
图1是毛兰素化学结构式图；
[0023]
图2是ic50实验结果图；其中，a为24h的ic50结果图；b为48h的ic50结果图；
[0024]
图3是毛兰素对膀胱癌t24细胞增殖的抑制作用图；其中，a为细胞活力实验结果图；b为细胞增殖抑制率结果图；
[0025]
图4是毛兰素对膀胱癌t24细胞克隆形成的抑制作用图；其中，a为结晶紫染色结果图；b为不同浓度的毛兰素作用于t24细胞后对克隆形成的抑制率结果图；
[0026]
图5是毛兰素对膀胱癌t24细胞周期的影响图；其中，a为流式细胞仪检测结果图；b为细胞周期统计分析结果图；
[0027]
图6是毛兰素对膀胱癌t24细胞周期相关蛋白的表达影响图；其中a为毛兰素对细胞周期相关蛋白表达的免疫印迹实验结果图；b为p21、p27、p-akt和akt的量化灰度值结果图。
具体实施方式
[0028]
本发明的具体实施方案和效果将通过以下实施例说明，但不以此限定本发明的实施范围。
[0029]
实施例
[0030]
一、材料与方法
[0031]
1.细胞株。
[0032]
人膀胱癌t24细胞株，购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。
[0033]
2.药物及试剂。
[0034]
毛兰素，化学名为2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-乙基]-苯酚，化学结构式如图1所示，购自上海源叶生物科技有限公司，货号：b20844，cas号：95041-90-0。
[0035]
dmso试剂，用于溶解毛兰素，溶解过滤除菌后，室温避光存放备用。
[0036]
各种试剂均为市场零售商品，均可通过商业途径获得。
[0037]
3.主要仪器。
[0038]
311气套式co2培养箱，美国thermo fisher scientific公司；infinite m200 pro nano quant光栅型连续波长酶标仪，瑞士tecan公司；elix3 30l 3ynergy超纯水系统，美国millipore公司；allegra x-22r冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；chemidoc xrs 凝胶成像系统，美国bio-rad公司。
[0039]
4.cck-8实验。
[0040]
(1)取对数生长期膀胱癌t24细胞，在室温下用d-hanks液清洗2-3次；
[0041]
(2)用0.25％胰酶常规消化细胞后，用含10％fbs的dmem培养基中和胰酶，收集细胞悬液后2000rpm，离心5min；
[0042]
(3)用无血清dmem培养基吹打重悬成细胞密度为2
×
103/ml分布均匀的单细胞悬液，；
[0043]
(4)接种于96孔细胞培养皿中，培养于37℃、5％co2培养箱中；
[0044]
(5)细胞贴壁生长24h后，每组用不同浓度的毛兰素(7.8、15.6、31.2、62.5、125ng/ml)进行干预，对照组给予等体积的dmso(即0μg
·
l-1
毛兰素处理细胞)，培养细胞2h、1d、2d、3d、4d和5d；
[0045]
(6)取各孔板细胞，弃去旧培养基，每孔加入100μl的cck-8溶液，继续培养2h后，使用酶标仪检测各孔450nm处吸光值；
[0046]
(7)比较不同剂量毛兰素对t24细胞进行干预后对细胞增殖抑制的影响。细胞增殖抑制率(％)＝(1－药物组od450nm值/对照组od450nm值)
×
100％。；
[0047]
5.克隆形成实验。
[0048]
(1)室温下胰酶常规消化细胞后，用dmem培养基吹打成均匀分布的单细胞悬液，以每孔2
×
103个细胞的密度接种于6孔板中，继续培养于恒温培养箱中；
[0049]
(2)培养6d后加毛兰素，使其终浓度为15.6、31.2、62.5、125、250ng/ml，以等体积dmso代替毛兰素作为对照组，同一浓度设置3个复孔；
[0050]
(3)继续培养6d后弃去上层培养基，pbs轻柔洗板2次；
[0051]
(4)用4％多聚甲醛固定15min，弃去多聚甲醛；
[0052]
(5)结晶紫溶液染色15min，清水反复浸洗；
[0053]
(6)室温晾干采集图像保存；
[0054]
(7)每孔加入2ml10％的冰醋酸溶液溶解结晶紫，每孔再取100μl置于96孔板中，使用酶标仪检测各孔560nm波长处吸光度值。克隆抑制率(％)＝(1－药物组od560nm值/对照组od560nm值)
×
100％。
[0055]
6.细胞周期分析。
[0056]
(1)取对数生长期膀胱癌t24细胞，t24细胞以每孔5
×
105的浓度接种于6孔板，每孔2ml；
[0057]
(2)培养24h后加入浓度为125ng/ml的毛兰素进行干预，对照组加入溶解125ng毛兰素同体积的dmso。24h后胰酶消化法收集细胞；
[0058]
(3)用预冷pbs洗涤细胞2次，再以预冷pbs重悬成单细胞悬液，缓慢滴加预冷乙醇，轻轻吹打混匀后，4℃固定过夜；
[0059]
(4)取出细胞以1000rpm离心10min，弃上清，预冷pbs洗涤2次，pbs重悬细胞；
[0060]
(5)加入rnase a溶液，37℃水浴30min；以1000r离心10min，弃上清；
[0061]
(6)加入pi染色液重悬细胞，4℃避光孵育30min；
[0062]
(7)上机检测激发波长为488nm，采用flowjo软件分析细胞周期分布。
[0063]
7.蛋白印迹。
[0064]
7.1细胞蛋白的提取。
[0065]
(1)培养人膀胱癌t24细胞至对数生长期，去掉培养基后，pbs洗涤3次；
[0066]
(2)在4℃温度下预冷，再4℃离心机12000rpm离心10min；
[0067]
(3)加入ripa细胞裂解液于冰盒上4℃静置30min，收集细胞裂解液；
[0068]
(4)取2μl上清液用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度；
[0069]
(5)在蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后，95℃金属浴10min，冰上放置10min后，保存于-20℃冰箱备用。
[0070]
7.2sds-page凝胶电泳。
[0071]
按常规配置分离胶为12％，浓缩胶为5％，胶厚度为1.0mm，应用不连续缓冲系统进行垂直板电泳。
[0072]
7.3转膜、孵抗体、显影
[0073]
(1)用半干转法将蛋白转移至nc膜上；
[0074]
(2)将转膜后的nc膜，放入丽春红工作液中，染色5min；
[0075]
(3)用去离子水冲洗染色后的膜，按蛋白marker的位置依次将目的蛋白和内参蛋白裁剪；
[0076]
(4)用tbst将膜上丽春红洗净后，放入tbst配置的5％脱脂奶粉；
[0077]
(5)5％脱脂奶粉(tbst配制)室温摇床封闭1h；
[0078]
(6)β-actin一抗4℃孵育过夜，第二天回收一抗；
[0079]
(7)tbst洗膜5次，每次10min；
[0080]
(8)室温孵育二抗1.5h，tbst洗膜5次，每次10min；
[0081]
(9)配制适量发光液，将a液和b液等体积混合；
[0082]
(10)吸去nc膜上多余的tbst，滴加配制好发光液，反应2-3min；
[0083]
(11)x线片曝光、显影、定影；
[0084]
(12)β-actin作为蛋白质对照，采用gel-pro analyzer图像分析系统计算分析x线片吸光度值，分析结果。
[0085]
实验数据处理
[0086]
所有数据均采用spss18.0软件进行统计学分析，数据均以均数
±
标准差(x
±
s)表示，多个样本间的均数比较采用单因素anova进组间比较分析。p《0.05为差异具有统计学意
义。
[0087]
二、结果
[0088]
(一)毛兰素对t24细胞增殖的抑制作用
[0089]
结果如图2，cck-8实验结果显示，毛兰素可以显著抑制膀胱癌细胞t24的增殖，24h的ic50为217.6
±
0.03ng/ml，48h的ic50为160
±
0.04ng/ml。如图3，通过cck-8法测定在培养的t24细胞中添加不同浓度的毛兰素分别干预2h,1d,2d,3d,4d和5d，在干预第3天后，所有剂量组均有明显抑制作用,并呈现出剂量效应依赖关系，其中第5天的增殖抑制率最高，抑制效果最明显。
[0090]
(二)毛兰素对t24细胞克隆形成的影响
[0091]
结果见图4。由结晶紫染色后结果可见图4-a，随着毛兰素浓度逐渐增加，阳性染色就逐渐减少，这表明毛兰素抑制作用在逐渐增强；通过560nm处od值结果与对照组比较，显示15.6、31.2、62.5、125、250ng/ml的毛兰素均对克隆形成具有明显的抑制作用(p《0.05)。图4-b是由不同浓度的毛兰素作用于t24细胞后对克隆形成的抑制率结果，发现随着浓度增高，毛兰素对t24细胞克隆抑制率随之增大。
[0092]
(三)毛兰素对细胞周期的影响
[0093]
结果见图5。流式细胞术结果和细胞周期检测分析结果显示，给药组与对照组相比，g1期细胞数占比增加，而s期和g2期的细胞比例明显减少，差异具有统计学意义(p《0.05)。
[0094]
(四)毛兰素对细胞周期相关蛋白表达的影响
[0095]
毛兰素对细胞周期相关蛋白表达的免疫印迹实验结果见图6-a，结果显示，添加不同浓度毛兰素干预后，细胞周期相关蛋白p27和p21表达均随药物浓度的增加而逐渐升高，p-akt的蛋白表达随药物浓度的增加而逐渐减少。p21、p27、p-akt和akt的量化灰度值结果如图6-b，结果提示，毛兰素干预t24细胞后，上调了p21和p27蛋白的表达，下调p-akt的蛋白表达水平；akt蛋白表达水平在毛兰素浓度为15.6、31.2、62.5、125ng/ml时无明显变化，在毛兰素浓度为250ng/ml时，akt蛋白表达受到抑制。
[0096]
根据上述实验结果，用毛兰素干预膀胱癌t24细胞后，毛兰素能降低p-akt的表达；在毛兰素浓度为15.6、31.2、62.5、125ng/ml时，akt蛋白表达含量无明显变化，在毛兰素浓度为250ng/ml时，akt蛋白表达受到抑制，同时上调细胞周期相关蛋白p27、p21的表达，使细胞周期阻滞于g1期，从而抑制膀胱癌t24细胞的增殖。
[0097]
综上，毛兰素能有效靶向抑制akt激活，从而抑制膀胱癌细胞t24增殖。
[0098]
最后所应当说明的是，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，进行多样的变更以及修改，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。