蛋白硒纳米酶及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种蛋白硒纳米酶及其制备方法和用途。


背景技术：

2.硒是人体必需微量元素，在生理活动中发挥着重要作用。硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属等重要生物功能。缺硒与40多种疾病相关，特别严重的如aids、乙型肝炎、肝癌、克山病、大骨节病、心脑血管疾病等。适当补硒则可以有效防控有关的疾病。关于正常人群的硒摄入量标准，世界卫生组织(who)规定为40～100μg/d，中国营养学会推荐为60～200μg/d，加拿大规定为98～224μg/d。世界上40多个国家和地区缺硒或低硒，中国约72％的地区，2/3的人口居住在低硒或缺硒地区。中国13省市的营养调查结果表明，成人每天的摄取硒仅为26μg，严重处于缺硒状态。因此，中国居民是普遍缺硒。目前为止，含硒无机物的典型代表为亚硒酸钠，其在空气中稳定，易溶于水，不溶于乙醇；国内外已有多家制药企业生产亚硒酸钠的片剂，用以治疗和预防属于地方病的克山病和大骨节病；硒酵母片用于低硒的肿瘤、肝病、心脑血管疾病病人或其他低硒引起的疾病；硒酵母锌片用于男性不孕不育，针对少精弱精，用于有效提高男性精子活跃度，预防前例腺炎。
3.然而，硒为一种微量有益元素，其有效性和安全性始终是需要平衡的第一大问题。食物来源或营养补充的硒化合物，不论是无机硒(亚硒酸钠(小鼠急性毒性ld
50
～10.7mg se/kg，中毒剂量～1.0mg se/kg)、硒酸钠)，还是有机硒(酵母硒(小鼠急性毒性ld
50
～37.37mg se/kg)、硒代蛋氨酸(小鼠急性毒性ld
50
～25.6mg se/kg，中毒剂量～3.0mg se/kg)、富硒菌(小鼠急性毒性ld
50
～18.94mg se/kg)、硒代半胱氨酸(小鼠急性毒性ld
50
～14.6mg se/kg)，在人类体内的安全剂量范围非常狭窄，硒的日营养推荐摄入量为60μg，每日摄取硒的量达到200～300μg时，具有癌症预防作用；然而每日摄入硒剂量等于或高于819
±
126μg se时，敏感病人则表现硒中毒现象。目前限定硒最高日摄入量为400～500μg。因此，补硒很容易因过量而产生毒性，这限制了传统硒化合物在临床疾病防治方面的广泛应用。
4.近年来，具有成本低，易于修饰，稳定性好等优点的纳米酶是一种具有高效活性的人工酶。与天然生物酶相比，纳米酶具有催化效率高、效果稳定、性价比高和可宏量制备等的优点。除催化底物产生自由基用于化学动力学治疗的过氧化物纳米酶在肿瘤治疗上受到广泛关注之外，纳米酶在医药、化工、食品、农业和环境等领域具有广泛的应用潜质。因此，研发新型的纳米酶具有非常重要的科学意义和实际应用价值。
5.前期研究发现，纳米硒颗粒具有清除自由基和超氧根的类人工酶性质，但尚未见到白蛋白硒纳米酶的绿色制备及其抗皮肤衰老、镇痛、酒精性肝损、消炎、止血、溃疡、创面修复和减少辐射损伤的新功能研究，构建新型硒纳米酶有助于推动硒纳米药物的临床应用。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的硒元素有效剂量和安全性窄等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种蛋白硒纳米酶的制备方法，该方法操作简单，将硒化合物和壳寡糖(壳聚寡糖、低聚壳聚糖，聚合度在2～20之间寡糖，分子量小于4000)加入还原型蛋白溶液中，集成还原蛋白内部过量巯基群、壳寡糖的阳离子聚合效应组装及硒化合物离子在白蛋白内部被还原，获得尺寸均一，分散性好，保存温度宽，保存时间长及在体液中具有良好稳定性的新型蛋白硒纳米酶，改善其在溶液中的分散和稳定性。
7.本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。
8.本发明的再一目的在于提供一种上述蛋白硒纳米酶的用途。
9.本发明的目的通过下述技术方案来实现：
10.一种蛋白硒纳米酶的制备方法，将硒化合物和壳寡糖加入经过二硫键还原剂处理后的蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液中，在蛋白内部原位还原成单质纳米硒，集成蛋白内部n、s、o活性基团和过量巯基群，以及单质纳米硒和壳寡糖的阳离子聚合效应诱导组装，获得蛋白硒纳米酶。
11.所述二硫键还原剂为还原型谷胱甘肽(gsh)、半胱氨酸、二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)、β
‑
巯基乙醇(β
‑
mercaptoethanol，β
‑
me)或三(2
‑
羧乙基)膦(tris(2
‑
carboxyethyl)phosphine，tcep)；
12.所述白蛋白为含二硫键的蛋白，包括天然来源或工程化重组得到的人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；
13.所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。
14.上述的制备方法，具体包括如下步骤：
15.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液；
16.b、将白蛋白加入二硫键还原剂溶液中，置入密封或除氧的瓶中，搅拌均匀，在33～60℃反应10～300min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液；
17.c、向步骤b所得白蛋白溶液中加入步骤a所得复合溶液，得到白蛋白终浓度为0.01～100mg/ml的反应液，4～24℃密封条件下进行搅拌反应1～12h，再经过透析，得到蛋白硒纳米酶溶液。
18.步骤a所述壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.1～0.5％，所述硒化合物在复合溶液中浓度为1～10mm。
19.步骤b所述二硫键还原剂溶液是指二硫键还原剂的磷酸盐或生理盐水溶液，ph值为5.0～9.0，其浓度为0.01～60mm，优选为0.1～40mm；所述白蛋白在还原型白蛋白溶液中的浓度为0.01～200mg/ml。
20.步骤b所述反应是在37～50℃条件下反应30～200min。
21.步骤c所述透析是将溶液放入透析袋，并于0～30℃的磷酸缓冲溶液或生理盐水中透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000；所述白蛋白终浓度为20～60mg/ml。
22.一种由上述的制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。
23.所述蛋白硒纳米酶的粒径分布范围为10～200nm，优选为10～150nm；蛋白硒纳米
酶中的硒：壳寡糖：白蛋白的摩尔比为1：(1～40)：(1/30～1)，优选地，硒：壳寡糖：白蛋白的摩尔比为1：(2～20)：(1/20～2)。
24.所述蛋白硒纳米酶在低温和常温情况下，在溶液中和各种体液中均可稳定存在。
25.上述的蛋白硒纳米酶在制备抗皮肤衰老护肤品、防治酒精性肝损药物、消炎药物、止血药物、防治溃疡药物、创面修复药物或防治射线辐射损伤药物中的用途。
26.蛋白硒纳米酶在使用的时候可以制成口服制剂或非口服制剂。
27.本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
28.本发明将硒化合物和壳寡糖(壳聚寡糖、低聚壳聚糖，聚合度在2～20之间寡糖，脱乙酰化度不低于90％，分子量小于4000)加入还原型白蛋白溶液中，通过集成还原蛋白内部过量巯基群和寡壳糖的阳离子聚合组装效应及硒化合物在白蛋白内部被还原，获得操作简单，尺寸均一，分散性好，保存温度范围广，保存时间长及在各种体液具有良好稳定性的新型得到蛋白硒纳米酶。抗皮肤衰老研究表明，蛋白硒纳米酶具有非常的抗皮肤衰老功能；同时，安全性实验表明，与亚硒酸钠比较，蛋白硒纳米酶具有更好的安全性，高剂量的急性肝损伤和短期毒性均最小；与生物利用度好的硒蛋氨酸比较，白蛋白硒纳米酶的口服生物利用度更好。
附图说明
29.图1为asem的dls水合粒径图。
30.图2为asem的tem电镜图。
31.图3为asem和nse的纳米氧化酶活性图。
32.图4为asem和nse对正常皮肤细胞毒性影响图。
33.图5为asem和nse对辐射胶原细胞hacat的生存率影响图。
34.图6为asem和nse对辐射胶原细胞hacat的增殖率影响图。
35.图7为asem和nse对辐射小鼠皮肤表皮影响图。
36.图8为asem和nse对辐射小鼠皮肤胶原组织影响图。
37.图9为asem和nse对辐射小鼠皮肤的he影响图。
38.图10为asem和nse对辐射小鼠皮肤胶原蛋白代谢因子col1a1、col3a3和mmp1的mrna影响图。
39.图11为asem和nse对辐射小鼠皮肤炎症因子tnf
‑
α和il
‑
1β的mrna影响图。
40.图12为asem和nse对辐射小鼠皮肤氧化应激信号nrf2和gpx1的mrna影响图。
41.图13为asem和nse对辐射小鼠皮肤衰老标志物p16和p21的mrna影响图。
42.图14为asem和nse对辐射小鼠皮肤抗氧化蛋白sod和mda表达影响图。
43.图15为asem和nse对放射肠炎小鼠血清炎症因子和过氧化物酶的影响图。
44.图16为asem和nse对放射肠炎小鼠体重影响图。
45.图17为asem和nse对放射肠炎小鼠生存期影响图。
具体实施方式
46.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
47.实施例1纳米硒(nse)的制备：
48.参照张劲松的专利申请(公开号cn1059638c)和文献(life sciences 2004；75：237
‑
244.)进行纳米硒的制备：将1ml的25mm的亚硒酸钠和4ml含有20mg牛血清白蛋白的25mm谷胱甘肽(gsh)混合均匀，然后用1m的氢氧化钠调ph为7.2，即获得红色的纳米硒和反应副产物gssg混合物，用透析袋经过96小时透析，冻干，获得含有牛血清白蛋白的红色纳米硒(nse)，纳米颗粒nse纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约20
‑
60nm。
49.实施例2白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
50.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.2％，硒化合物在复合溶液中浓度为10mm；
51.b、将人血清白蛋白(hsa)溶解于10mm的gsh新鲜溶液(gsh的磷酸盐缓冲液，ph值约为6.0)中，密封在37℃条件下反应100min，搅拌，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，hsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为50mg/ml；
52.c、向b溶液中加入适量a溶液，获得蛋白的终浓度为30mg/ml的反应溶液，密闭在4℃搅拌12h，得到红透的蛋白硒纳米酶溶液，放入透析袋(mw不小于1000)，并于4℃透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
53.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于60℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，计算se与hsa的摩尔分子比约为12.5:1；纳米尺寸均一，分布均匀(见图1)，平均粒径约20～30nm。
54.实施例3白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
55.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.3％，硒化合物在复合溶液中浓度为10mm；
56.b、取人血清白蛋白溶解于25mm的gsh新鲜溶液(生理盐水，ph值为7.0)中，密闭在42℃水浴锅中搅拌反应25min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，hsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为50mg/ml；
57.c、向b溶液中加入a溶液，获得蛋白的终浓度为20mg/ml的反应溶液，密闭在20℃搅拌1h，得透红色的白蛋白硒纳米酶粗溶液；装入透析分子截留不低于1000透析袋中，并于10℃透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
58.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于70℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为12:1，得到平均粒径约为32～45nm的白蛋白硒纳米酶。
59.实施例4白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
60.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.3％，硒化合物在复合溶液中浓度为5mm；
61.b、将人血清白蛋白(hsa)溶解于10mm的tcep新鲜溶液(tcep的磷酸盐缓冲液，ph值为8.0)中，密闭在30℃条件下反应70min，搅拌，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，hsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为70mg/ml；
62.c、向b溶液中加入a溶液，调整蛋白的终浓度为50mg/ml的反应溶液，密闭在6℃磁
力搅拌6h，得淡红色的asem粗溶液；装入透析分子截留不低于1000透析袋中，并于15℃的pbs溶液透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
63.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于70℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为4.8:1，得到平均粒径约为30～40nm的白蛋白硒纳米酶。
64.实施例5白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
65.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.2％，硒化合物在复合溶液中浓度为9mm；
66.b、将人血清白蛋白(hsa)溶解于5mm的tcep新鲜溶液(tcep的pbs缓冲液，ph值为9.0)中，在30℃条件下反应50min，搅拌，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，has在还原型白蛋白溶液中的终浓度为80mg/ml；
67.c、向b溶液中加入a溶液，调整到蛋白的终浓度为50mg/ml的反应溶液，密闭于8℃下磁力搅拌2h，得淡红色的白蛋白硒纳米酶溶液；装入透析分子截留不低于1000透析袋中，并于8℃溶液中透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
68.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于60℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为7.1:1，得到平均粒径约为35～50nm的白蛋白硒纳米酶。
69.实施例6白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
70.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.1％，硒化合物在复合溶液中浓度为5mm；
71.b、将人血清白蛋白(hsa)溶解于5.8mm的dtt新鲜溶液(dtt的磷酸盐缓冲液，ph值为6.0)中，密闭在30℃条件下反应45min，搅拌，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，hsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为55mg/ml；
72.c、向b溶液中加入a溶液，获得蛋白的终浓度为44mg/ml的反应溶液，密封于15℃搅拌3.5h，得淡红色的白蛋白硒纳米酶粗溶液；装入透析分子截留不低于1000透析袋中，并于4℃透析3天除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
73.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于65℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为5.9:1，得到平均粒径约为30～45nm的白蛋白硒纳米酶。
74.实施例7白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
75.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.1％，硒化合物在复合溶液中浓度为7mm；
76.b、将牛血清白蛋白(bsa)溶解于25mm的gsh新鲜溶液(gsh的磷酸盐缓冲液，ph值为6.0)中，密封在40℃条件下反应80min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，bsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为80mg/ml；
77.c、向b溶液中加入a溶液，调整白蛋白终浓度为60mg/ml的反应溶液，密封在4℃搅
拌4h，得淡红色的白蛋白硒纳米酶粗溶液；经过分子截留不低于1000的透析袋中于6℃透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得白蛋白硒纳米酶。
78.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于50℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为7:1，得到平均粒径约为25～46nm的白蛋白硒纳米酶。
79.实施例8白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
80.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.15％，硒化合物在复合溶液中浓度为10mm；
81.b、取牛血清白蛋白(bsa)溶解于8mm的tcep新鲜溶液(tcep的磷酸盐缓冲液，ph值为7.5)中，密闭在30℃条件下反应60min，搅拌，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，bsa在还原型白蛋白溶液中的终浓度为90mg/ml；
82.c、向b溶液中加入a溶液，调整蛋白的终浓度为55mg/ml的反应溶液，密封在8℃搅拌12h，得红色的白蛋白硒纳米酶粗溶液；借用透析分子截留不低于1000的透析袋，于10℃透析3天除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得asem。
83.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于55℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为7.1:1，得到平均粒径约为36～56nm的白蛋白硒纳米酶。
84.实施例9白蛋白硒纳米酶(asem)的制备：
85.a、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液(简称a溶液)；壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.1％，硒化合物在复合溶液中浓度为2mm；
86.b、将转铁蛋白(tf)溶解于30mm的gsh新鲜溶液(gsh的磷酸盐缓冲液，ph值为8.0)中，密封在15℃条件下反应100min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称b溶液)，tf在还原型白蛋白溶液中的终浓度为90mg/ml；
87.c、向b溶液中加入a溶液，获得转铁蛋白终浓度为50mg/ml的反应溶液，密封在4℃搅拌6h，得红色的转铁蛋白硒纳米酶粗溶液；经过透析分子截留不低于1000的透析袋于8℃透析3天除去多余的还原剂和硒化合物及其副产物，获得转铁白蛋白硒纳米酶。
88.d、经过bca蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于65℃水浴锅中消化过夜，icp
‑
ms检测，发现se与hsa的摩尔分子比约为1.4:1，得到平均粒径约为30～45nm的转铁蛋白硒纳米酶。
89.实施例10白蛋白硒纳米酶(asem)的表征和鉴定：
90.针对前述实施例2获得的白蛋白硒纳米酶和人血清白蛋白(hsa)分别进行动态光散射(dynamic light scattering)dls测定白蛋白颗粒纳米尺寸的水合粒径，从dls分析结果来看，hsa和asem水合粒径大约为10nm和100nm左右，且分散性良好，pdi值均<0.25，具体如图1。同时，对实施例2获得的白蛋白硒纳米酶进行了透射电子显微镜(transmission electron microscope)tem确证，扫描结果表明其干燥后的纳米尺寸约20nm左右，具体如图2。
91.为了比较实施例2的apsem和对照实施例1中nse的元素组成区别，将其分别溶解在
去离子水中，然后用15000g离心1小时，收集asem和nse的沉淀，对离心上清中se元素和白蛋白的浓度进行测定，发现nse颗粒中99.99％成分为se元素，0.01％的组成为分散剂白蛋白的物理吸附和白蛋白半胱氨酸通过sh于nse的键合效应；而apem组成则不同，se元素的含量为1.49％，其他组成的98.51％含量为蛋白质化合物。经过圆二色谱测定，asem具有与白蛋白几乎一样的特征峰，提示asem确实是通过自主组装制备成功，且没有改变hsa的高级结构。进一步进行傅里叶变换红外光谱(ft
‑
ir)分析，跟nse的光谱不同，发现apsem纳米颗粒组成中可以发现hsa的c＝o键(～1720和1670cm
‑1)、c
‑
n键(～1260cm
‑1)和c
‑
s(～1450cm
‑1)特征峰，其蓝移与se
‑
o、se
‑
n和se
‑
s键合形成有关；新增～870、820、540和480cm
‑1特征峰，提示hsa与se纳米通过亲和结合组成。
92.实施例11白蛋白硒纳米酶(asem)的氧化酶模拟评价：
93.为了探究nse(实施例1所得)或apsem(实施例2所得)模拟氧化酶活性，在10ml的离心管中先加入3.7ml的醋酸钠(0.2m，ph 4.0)，取200μl的纳米粒子(20μg/ml)或去离子水(对照)加入到缓冲溶液，混匀；然后，加入100μl体积0.1mm浓度的3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)溶液。25℃的室温下，反应60min，每10min检测反应体系在652nm处的吸光度。实验结果表明(如图3)，asem具有nse不可比拟的纳米氧化酶特性。
94.实施例12白蛋白硒纳米酶(asem)的保存放置时间稳定性评价：
95.针对前述实施例2所制备的asem在不同温度条件下放置不同时间，对其纳米的水合粒径和透明度进行考察，然后进行统计分析，发现其可以在不同温度条件下长期稳定保存(具体见表1和表2)。
96.表1不同温度和周期下的澄清透明度观察
[0097][0098]
表2不同温度和周期下的纳米粒径检测(平均值
±
sd)
[0099][0100]
实施例13白蛋白硒纳米酶(asem)的抗胃液、肠液和血浆中的稳定性评价：
[0101]
参考中国药典，配置人工胃液和人工肠液；实验所用血浆为临床所用的替代血浆样品。
[0102]
针对前述实施例2所制得的asem，分别取0.5ml稀释至2ml，加入截留分子量为3500的millipore透析管中，放入1l的人工体液中，37℃条件下搅拌，经过icp
‑
ms分析，具体结果
如下表3所示，提示asem在人工体液中稳定。
[0103]
表3人工体液中的asem稳定性研究(平均值
±
sd)
[0104][0105]
实施例14 asem的急性毒性、生物利用度和体内活性评价：
[0106]
采用前述实施例2所得asem对小鼠的急性毒性进行测试，asem的ld
50
为185.7mg se/kg bw(body weight)；硒蛋氨酸的ld
50
为79.5mg se/kg bw；而无机硒亚硒酸钠的ld
50
为15.1mg se/kg bw；这些结果提示，asem比亚硒酸钠的急性毒性剂量低10倍多；比有机硒更加安全。
[0107]
对正常和癌细胞活性的影响：在10～500ng/ml时，对强氧化剂h2o2诱导细胞毒时，asem的保护效应显著高于亚硒酸钠；同时，asem比亚硒酸钠对肝癌细胞株hepg2则表现更好的抑制效应。
[0108]
作用细胞硒酶活性的影响：跟亚硒酸钠比，高剂量asem对gpx酶活性的诱导作用更高，而tr效应则低于亚硒酸钠；口服asem对昆明小鼠肝脏中的gpx1，gpx4基因具有显著上调作用(3.5～7.1倍)。
[0109]
生物利用度比较：与硒蛋氨酸和无机纳米硒nse口服比较，asem具有口服更好的生物利用度(3.1～6.5倍)。
[0110]
硒的组织分布：在缺硒小鼠上，asem明显提高昆明小鼠血和各组织硒水平，且对小鼠肝、血和肾中硒水平补充作用相对较快。
[0111]
实施例15 asem抗皮肤衰老的体外和体内活性评价：
[0112]
细胞评价实验：所用皮肤细胞l929和hacat均采购于中国科学院上海细胞库，l929细胞用于评价本发明实施例2制备的asem及nse的正常毒性情况和剂量安全性；细胞和asem及nse共孵16个小时后，采用紫外灯(照射细胞的uvb紫外灯为312nm，16cm距离，辐照18s，60mj/cm2；然后在培养24和48小时评价hacat的生存活力、增殖率和胶原细胞生存率。
[0113]
动物评价实验：6周龄的icr小鼠，在麻醉下去毛，将0.1ml的100ng/ml的asem、nse和生理盐水对照组在皮下进行注射，在紫外灯340nm，20cm距离，8w功率，30s，3次/周，连续10周诱导皮肤光老化。在实验结束后，麻醉小鼠进行牺牲，将对应的皮肤组织进行取样，拍照，做基因水平、免疫组化he与masson染色胶原纤维蛋白及相关蛋白表达水平的生理生化分析(mrna:胶原蛋白代谢因子col1a1、col3a3、mmp1；炎症因子tnf
‑
α、il
‑
1β；氧化应激信号nrf2、gpx1；衰老标志物p16和p21；actin或gapdh为对照；皮肤组织的抗氧化蛋白表达：sod、mda)，如图4～14所示，*表示与模型组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；**表示与模型组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异。这些实验结果发现，asem对正常细胞的安全性显著提高，对辐射后的胶原细胞hacat的生存、增值率和活力具可以显著改善；在icr小鼠模型上，asem在整体上达到对照组皮肤的光滑、白嫩和细腻度，在mrna与蛋白分子水平是均可以抵抗uvb紫外灯诱导的光损伤效应，与修复胶原蛋白、减少炎症因子、降低氧化应激和抵抗衰老机理有关；这些结果表明asem比nse具有更加优秀的抗皮肤老化作用，有助于皮肤损伤
的修复功能。
[0114]
实施例16 asem对放射性大鼠皮损的修复评价：
[0115]
6周龄的雄性sd大鼠(200g左右)，每组6只，本戊巴比妥麻醉后，经过瓦里安23ex直线加速器产生的6mev电子线照射皮肤(4cmx5cm)，非mark笔圈部位铅衣遮盖，给放疗总剂量40gy；在实验组的圈定皮肤位置用棉签涂抹本发明实施例2制备的asem(300ng/ml)/2天，一周3次，连续5周，拍照收集皮损恢复情况。实验结果发现asem组6只大鼠的皮损全部愈合(100％)，且皮肤红润，与其他非辐射皮肤接近，且毛囊正常生长；而对照组的仅1只大鼠的皮损基本康复伴有红色斑块炎症点(16.7％)，其他5只大鼠皮损康复面积均低于50％；提示asem具有非常优秀的抗放射皮肤损伤效应。
[0116]
实施例17 asem对放射性小鼠血液系统的逆转评价：
[0117]
取spf适应1周的昆明雄性小鼠(20g左右)，每组10只，用医用电子直线加速器(瑞典医科达)x射线辐射5.0gy；辐射距离60cm；对照组为单纯未进行辐射的正常健康小鼠；模型组为辐射后给生理盐水，本发明实施例2制备的asem按0.05～0.2mg/kg体重隔天给药，连续4周；摘小鼠眼球收集血液进行血液系统分析，结果如表4所示。实验结果表明，asem干预具有非常显著地改善x射线辐射造血系统损伤的功能。
[0118]
表4 asem对x射线辐射小鼠的造血系统影响(n＝6，平均值
±
sd)
[0119][0120]
δ表示与对照组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；δδ表示与对照组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异；*表示与模型组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；**表示与模型组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异。
[0121]
实施例18 asem保护小鼠的酒精性肝损伤对评价：
[0122]
取spf适应一周的昆明雄性小鼠(20g左右)，每组10只，无菌水灌胃为正常组，按150mg/kg的40％酒精灌胃28天造模，同时配白酒组 本发明实施例2制备的asem(100和200μg/kg)组；末次灌胃后16小时牺牲小鼠取血(alt、ast、tg和tc)和肝组织匀浆上清进行指标测定(mda、gsh、gsh
‑
px和sod)，结果如表5
‑
7所示。实验结果表明，asem干预白酒肝损伤模型(肝脏体重比，血清中alt、ast、tg和tc指数，肝脏匀浆中mda、gsh、gsh
‑
px和sod的含量)具有非常显著地逆转保护功能。
[0123]
表5 asem对酒精小鼠肝脏发育的影响(n＝10，平均值
±
sd)
[0124][0125]
表6 asem对酒精小鼠血清中alt、ast、tg和tc的影响(n＝10，平均值
±
sd)
[0126][0127]
表7 asem对酒精小鼠肝脏匀浆中mda、gsh、gsh
‑
px和sod的影响(n＝10，平均值
±
sd)
[0128][0129]
δ表示与对照组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；δδ表示与对照组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异；*表示与模型组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；**表示与模型组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异。
[0130]
实施例19 asem在口腔疾病中的临床体验案例
[0131]
将实施例4中所得的asem按5％的体积比复配在无菌生理盐水中作为漱口水使用：
[0132]
(1)某男患者，夏某，32岁；长期口臭，严重交际困难。按每日3次，每次五分钟含漱且咽入，7天后口臭明显减轻；经吹气法进行hp幽门螺旋杆菌测定，hp指数显著降低，腹胀减少。
[0133]
(2)某男性患者，魏某，35岁；爱抽烟和嚼槟榔，口腔纤维化严重，牙龈肿胀；用本漱口水3次，5分钟/次，牙疼即止，可正常进食；且含漱后停2天，止痛效果仍然保持，患者精神振奋。
[0134]
(3)某男性患者，崔某，47岁；多年咀嚼槟榔导致长期牙周炎疼，常见抗炎药物无效；含漱本发明漱口水3次，每次5分钟，牙痛消失，牙龈消肿，可正常进食。
[0135]
(4)某女性患者，柯某，35岁；经阻生智齿拔除手术后一天，被拔牙部位的创面仍存在自发性出血，经过无菌棉球浸泡本漱口水，给患者压迫拔牙创3～5分钟，止血效果明显。
[0136]
(5)某男性患者，李某，37岁；系糖尿病并发症引起的牙周炎红肿和溃疡，体验本漱口水且咽下，六天后，牙周炎炎症减轻，三个月后痊愈。
[0137]
(6)某女性患者，杨某，39岁；在牙医诊所进行左下阻生齿拔除手术，一天三次、每次五分钟口服本发明漱口水，检查发现患者拔牙创面愈合快，于第四天基本愈合。
[0138]
(7)某女性患者，辛某，29岁；因进行义齿植入手术，严重创面，伤口需止血、修复和消炎镇痛；每日含漱本发明漱口水五分钟后咽下，疼痛感得到缓解，两天后出血停止；含漱五天后，患者创面完全痊愈。
[0139]
(8)某男性患者，谭某，61岁；因hp感染导致的胃炎和溃疡，含漱本发明漱口水二周后，口腔异味显著减轻，医院测定hp指数降低，胃部疼胀感改善，食欲提高。
[0140]
(9)某男性患者，余某，48岁；习惯熬夜，阴虚火旺，常年口臭，经常口腔发炎，每天含漱本发明漱口水，每次5分钟，口臭明显改善，口腔发炎频率减少。
[0141]
(10)某男患者，肖某，45岁；因进行了智齿拔行术，需止血、消炎和镇痛；在医师建议下，患者含漱本发明漱口水五分钟后且咽下，出血即止，疼痛缓解；继续使用四天后，患者创面完整修复。
[0142]
实施例20 asem的镇痛作用实验
[0143]
20.1材料与方法：
[0144]
20.1.1药品与仪器：将200ng/ml的本发明实施例2制备的asem和等剂量的nse(实施例1制备所得)稀释在生理盐水中(10％)，配制成实验研究用漱口水，其他仪器均为实验室常用。
[0145]
20.1.2实验动物：来源于上海斯莱克实验动物有限公司的昆明小鼠/雄性(体重20g左右)和雄性wistar大鼠(体重180g左右)。
[0146]
20.1.3实验方法
[0147]
20.1.3.1 asem对热板致小鼠痛阈值的影响
[0148]
将雌性昆明小鼠放置在55℃的智能热板仪内，参考5s<正常痛域值<30s，记录正常痛阈值的小鼠放入热板仪至出现舔后足的时间(s)，30只/3组，即asem(生理盐水配)、nse(生理盐水配)、生理盐水对照组。按0.2ml/10g灌胃，3次/天，连续6天，于末次给药后半个小时后测痛阈值。
[0149]
20.1.3.2 asem对醋酸致小鼠扭体反应的影响
[0150]
取小鼠30只/3组，按0.2ml/10g灌胃6天；末次给药后0.5小时，腹腔注射0.8％的醋酸0.2ml/只，小鼠出现扭体反应(腹部内凹，躯干与后肢伸张，臀部高起等行为反应)；观察并记录注射醋酸后15min内小鼠出现扭体反应的次数。
[0151]
20.2实验结果
[0152]
20.2.1 asem对热板致小鼠痛域影响
[0153]
从表8可以看出，asem能显著提高小鼠痛阈，与对照、nse组比较具有显著性差异(p<0.01)，提示asem具有功能效应，且对比的nse未见提高痛阈值效应。
[0154]
表8 asem漱口水对热板致小鼠痛域值的影响(n＝10)
[0155][0156]
注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01。
[0157]
20.2.2 asem对醋酸致小鼠扭体反应的影响
[0158]
从表9可以看出，asem能显著降低醋酸致小鼠扭体反应的次数，与空白对照和nse组比较具有显著性差异，证实asem的功能效应；而nse尚未发现相关功能。
[0159]
表9 asem对醋酸致小鼠扭体反应的影响(n＝10)
[0160][0161]
注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01。
[0162]
上述实验数据充分说明asem具有明显效果的镇痛作用。
[0163]
实施例21 asem的抗炎作用评价
[0164]
21.1材料与方法
[0165]
21.1.1材料与试剂：同上来源动物，其他均为常用试剂和实验设备。
[0166]
21.1.2方法
[0167]
21.1.2.1 asem对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
[0168]
取昆明小鼠30只/3组，即本发明实施例2制备的asem、实施例1制备的nse和生理盐水对照组。按30ml/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次涂药后30min时于每只小鼠右耳廓内外两侧涂抹二甲苯0.05ml诱导致炎，左耳空白对照。涂抹30min后，经颈椎脱臼方式处死小鼠，沿小鼠耳廓基线用手术剪刀剪下左右两耳，然后用直径8mm的打孔器取下左右双耳相应部位的耳片，进行称重和记录，根据两耳片的重量差值，计算肿胀抑制百分率来评价小鼠耳廓肿胀度。耳廓肿胀度＝右耳廓重
‑
左耳廓重，肿胀抑制百分率(％)＝[(空白对照组耳廓肿胀度
‑
药物处理组耳廓肿胀度)/空白对照组耳廓肿胀度]
×
100％。
[0169]
21.1.2.2 asem对冰醋酸诱导小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响
[0170]
取雄性小鼠30只/3组，30ml/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次给药后30min，分别给小鼠按10ml/kg尾静脉注射伊文思蓝(0.5％)，并立即按10ml/kg腹腔注射醋酸(0.6％)；注射完30min后，小鼠经颈椎脱臼处死，接着用6ml生理盐水对腹腔进行冲洗，收集冲洗液，3000rpm进行10min离心，轻取上清液于590nm处测得吸光度(a)。结合腹腔液中伊文思蓝的含量，来判断漱口水对小鼠腹腔毛细血管通透性。
[0171]
21.1.2.3 asem对鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响
[0172]
取雄性大鼠30只/3组，5ml/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次给药后30min，再分别给大鼠灌水5ml/只，并在右踝关节处用mark笔划圈标记，方便测定大鼠右足跖容积；同时，将10％新鲜鸡蛋清0.1ml/只在大鼠足跖中部皮下注射诱导致炎，制备足跖肿胀炎症模型。
[0173]
21.1.2.3.1足跖肿胀度评价：致炎后0.5，1，2，4，6小时，测定大鼠的足跖容积，按足跖肿胀度＝(致炎后
‑
致炎前)足跖容积差值计算足跖肿胀度。
[0174]
21.1.2.3.2大鼠血清il
‑
1β浓度测定：在末次测定足跖肿胀度后，麻醉大鼠，眼眶采抗凝血，3000rpm离心得血清，elisa法测定血清中il
‑
1β的含量。
[0175]
21.1.2.4.3足跖组织pge2浓度测定：在末次测定足跖肿胀度后，麻醉处死大鼠，在其踝关节上0.5cm处剪下肿胀足跖；进行称重并剪碎，用5ml的预冷生理盐水浸泡1h，充分涡旋混后，3000rpm，15min；取上清液0.5ml，再加入0.5mol/l的氢氧化钾
‑
甲醇溶液2ml，50℃恒温放置20min；用分析纯甲醇定容至5ml，紫外可见分光光度计于278nm处测定吸光度(a)，然后按每克组织的吸光度值表示pge2浓度，即按pge2(μg/g)＝(e278
×
13.13
×
vt
×
d)/w。其中e278：278nm吸光值；vt：浸泡液的总体积；d：稀释倍数；w：右下肢的重量)。
[0176]
21.2实验结果
[0177]
21.2.1 asem对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的作用
[0178]
由表10可知，asem能显著抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，抑制百分率达到66％，而nse组有效性仅有20％，两者具有显著性差异。
[0179]
表10 asem对小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10)
[0180][0181]
注：与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与nse比较，
δ
p<0.05，
δδ
p<0.01。
[0182]
21.2.2 asem对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的作用
[0183]
由表11可知，与对照组比较，asem比nse组更具有显著性作用。
[0184]
表11 apsem对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响(n＝10)
[0185][0186]
注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较，
δ
p<0.05，
δδ
p<0.01。
[0187]
21.2.3 asem对鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响
[0188]
由表12可知，与对照组比较，asem组大鼠足跖肿胀度显著降低，nse作用很微弱。
[0189]
表12 asem对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响(n＝10)
[0190][0191]
注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较，
δ
p<0.05，
δδ
p<0.01。
[0192]
21.2.4 asem对蛋清致足跖肿胀大鼠血清il
‑
β和炎性组织pge2浓度的影响
[0193]
由表13可知，asem和nse组大鼠血清il
‑
1β和pge2的浓度显著降低，其中apsem比nse的效果更好，且两者显著差异。
[0194]
表13 asem对蛋清致足跖肿胀大鼠血清il
‑
β和炎性组织pge2的影响(n＝10)
[0195][0196]
注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较：
△
p<0.05，
△△
p<0.01。
[0197]
实施例22 asem对大鼠肝脏止血实验评价
[0198]
取雌/雄性各半大鼠(200g左右体重)20只/2组，胶原蛋白海绵组(参照)和asem冻干明胶组(在胶原蛋白海绵表面加入10％重量/体积比的200ng/ml的本发明实施例2制备的asem溶液，冷冻干燥制得)；经1％戊巴比妥腹腔注射麻醉(40mg/kg)后，解剖开腹，暴露肝脏，用组织钳将左叶中间位置切取一块(5x3x2mm)，造成敞开型伤口，自由出血5s，将两组止血膜敷上，10g砝码按压20s，拿走观察30s，记录止血时间；称重对手术中使用的无菌纱布吸收用药后所流出血液，计算手术中的出血量和止血时间，具体如表14所示。手术后2周，分别将其中5只大鼠进行解剖考察创面的血肿、腹腔粘连等情况。2周后，创面止血部位组织未见坏死、水肿、炎症细胞浸润等组织学病变，也未见组织毒性改变。这些结果提示白蛋白纳米硒具有显著的止血功能。
[0199]
表14 asem对大鼠肝脏止血使用的影响(n＝10)
[0200][0201]
注：与胶原蛋白组比较：**p<0.01。
[0202]
实施例23 asem对糖尿病大鼠创面修复评价
[0203]
参照文献方法制造糖尿病大鼠创面模型，即为取雌/雄性各半大鼠(200g左右体重)20只/2组，65mg/kg尾静脉注射stz，然后于5，10，15天从眼眶取血测定血糖，以大于16.7mmol/l为造模成功；麻醉大鼠，脱毛，从背部剪下2x1cm的皮肤，为糖尿病创面模型；分别给予生理盐水、透明质酸凝胶、asem凝胶(将10％的200ng/ml本发明实施例2制备的asem体积比掺入透明质酸中制备)，按2天/次涂抹，连续给药2周共计14天；然后，通过免疫组织化学和拍照计算创面愈合率(将愈合好的创面和原始创面的百分比计算)进行综合评价，如表15所示，结果提示asem具有促进创面愈合的优秀功能。
[0204]
表15 asem对大鼠创面修复的影响(n＝10)
[0205][0206]
注：与对照组比较：**p<0.01。
[0207]
实施例24 asem对放射性小鼠肠炎的修复作用：
[0208]
按每组10只小鼠，采用6mv x射线单次15.0gy剂量辐射小鼠腹部，其他部位用铅板防护；mark标记3.0x5.0cm照射面积，照射高度100cm；以小鼠出现稀便、黏液血便为造模成功。正常组小鼠不做任何处理，造模小鼠随机分组(生理盐水、nse(200μg/kg)、本发明实施例2制备的asem(200μg/kg))予第7天开始灌胃，每天一次，连续1周；记录小鼠生存情况，然
后予末次给药12h处死小鼠，收集血清进行炎症因子和过氧化物酶(mpo)测定，取出回盲部以上肠段约5cm液氮保存做组织评分和炎症因子(炎症正相关因子il
‑
6)和血二胺氧化酶(dao)表达水平分析。从组织学评分表16～18和图15可得出，asem比nse具有更好的抗放射肠炎修复活性，两者具有显著性差异；具体与减少炎症因子il
‑
2，il
‑
6，tnf
‑
α，过氧化物酶mpo和血二胺氧化酶dao的表达水平密切相关。
[0209]
表16 asem对放射肠炎小鼠肠道组织学评分统计
[0210][0211]
注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较：
△
p<0.05，
△△
p<0.01。
[0212]
表17 asem对肠道组织il
‑
6相关基因mrna的改变
[0213][0214]
注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较：
△
p<0.05，
△△
p<0.01。
[0215]
表18 asem对肠道组织血二胺氧化酶(dao)含量改变
[0216][0217]
注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与nse比较：
△
p<0.05，
△△
p<0.01。
[0218]
实施例25 asem诱导小鼠急性肠炎的治疗作用dss对：
[0219]
将6～8周龄的spf级雄性c57bl/6小鼠用注入3％质量分数dss的饮用水诱导急性肠炎模型至模型组全部死亡，大概1周时间。因本实验为治疗实验，我们在7天诱导死亡肠炎模型基础上，为减少死亡率，控制诱导4天，每组5只；然后进行生理盐水、nse(200μg/kg)和本发明实施例2制备的asem(200μg/kg)进行治疗，观察死亡率和体重改变情况。统计结果如图16和17所示，提示asem可以对dss模型小鼠的生存率和小鼠体重进行恢复，证明asem对dss诱导小鼠急性肠炎具有确定的治疗功能，而nse组则没有相关治疗作用。
[0220]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。