一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法与流程

1.本发明涉及香菇培养技术领域，尤其涉及一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法。


背景技术：

2.根据2020年最新发布的全球癌症负担报告显示，三十年前，癌症的疾病负担在全球位列第6，如今已经上升至第2位，在2007年－2017年期间，123个国家的癌症平均年龄标化发病率有所增加，其中中国大陆是发病率增幅最大的地区之一，年均增长超过2％。可见，癌症防治在我国，乃至全球范围内都任重而道远。特别是随着人类生活方式的改变，结直肠癌成为最常见的消化系统恶性肿瘤，并且分别成为恶性肿瘤发病和死因的第二和第三原因。但与此同时，大量的来自临床和流行病学的研究表明，如能及早发现危险因素并及早干预、及早诊断并早期治疗，结直肠癌是一种完全可以得到有效预防和治疗的肿瘤。开发一种能够辅助癌症，特别是结直肠癌症治疗，有效改善并提高癌症患者生存质量的健康食品，是一个在我国，乃至世界范围内都亟待解决的问题。
3.香菇以其低热量、高蛋白、高纤维、以及丰富的维生素含量而备受世界各地人们的青睐，特别是在东南亚国家已经有近千年的食用历史。我国在香菇的种植及使用上更是历史悠久，现存最早有关香菇种植的记载即是在我国汉代的《王祯农书》中，香菇也由此成为是我国历朝各代的珍馐佳品。除了丰富的营养价值，针对香菇的现代研究也表明，香菇中富含大量的多糖类成分，而且多是有益于免疫系统的治疗性活性多糖，具备有明确的抗癌细胞增殖及免疫调节作用，香菇提取物在乳腺癌、肺癌，特别是结直肠癌的干预上都已经显示出明确的生物活性。同时，香菇中含有的多种酵素有助于消化吸收，是保健食品的必要条件。除此之外，现代研究亦表明，食用菌的营养成分和生物活性在不同基质上生长时会发生显著变化。有研究表明，将蘑菇基质与其他营养物质一起作为培养基，用于培养包括香菇在内的五种不同蘑菇菌株，可以使蘑菇中的多糖及其生物量的浓度显著增加。
4.在2019年开展的一项研究中也观察到了类似的影响，在不同基质(具有不同化学成分)中种植蘑菇可以直接影响蘑菇物种的产量和营养元素组成。香菇多糖的免疫调节作用通过在富含硒补充的基质床上生长可以提供优异抗癌作用的蘑菇多糖。由此可见，香菇在肿瘤免疫调节方面具有巨大的开发潜力，日益进步的科学技术也提供了一种深入挖掘香菇药用价值的技术手段，然后，截至目前为止，香菇仍然作为一种普通食品，仅仅服务于餐桌，未能基于我国在香菇种植及使用的悠久历史上，将香菇的药用价值，特别是在肿瘤干预，肿瘤免疫调节方面的生物活性作用进行深入挖掘，更未见到基于此而开发的功能性香菇。
5.黄芪作为传统的中草药数千年来即被广泛用于治疗元气不足、癌症和免疫功能紊乱的患者。黄芪的现代活性药理成分研究也表明，黄芪多糖具有明确的免疫调节作用，并在临床上被用于减轻化疗药物的毒副作用和改善癌症患者的生活质量。我国科学家在如何将黄芪的药用价值引入香菇的栽培中也进行了部分研究，并就北芪硒菇的生产方法申请了专
利，但仅确定了硒含量在香菇中的变化，并未对黄芪中的活性成分是否成功转化至香菇开展研究，更未见到基于其可能存在的生物学效应而展开深入的科学研究，并以此为基础开发出具有潜在抗癌，及肿瘤免疫调节作用的功能性香菇。
6.目前对于香菇的研究多集中在通过改变培养基而改善香菇产量、或者对其普通营养成分的优化，仍属于粗放型添加，对培养基各组分配比及相应培育条件均未开展科学控制，对新培育出的香菇是否具备相应的有效成分和生物效用不得而知，从而导致在实际实施过程中，出现对香菇低效率重复研究，低水平低价值利用，无法在我国香菇栽培及使用的悠久历史上，实现对香菇高科技含量、科学化、国际化的深入开发，从而充分开发香菇的药用价值，更好地服务于人类健康。
7.因此，我们提出了一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了解决现有技术中存在无法实现对香菇高科技含量、科学化、国际化的深入开发，从而充分开发香菇的药用价值，更好地服务于人类健康的缺点，而提出的一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法。包括以下步骤：
9.(1)制作黄芪母种培养液：分别取黄芪下脚料、玉米粉、葡萄糖、豆粉，加入纯化水，充分混合均匀，熬汁液装入培养瓶，并在 121℃下灭菌30min，经灭菌后，得到黄芪母种培养液；
10.(2)功能香菇母种液的获取：在无菌净化室将成熟香菇子实体接种到黄芪母种培养液上方，直到香菇子实体自行弹射孢子落到培养液上，对含有孢子的香菇子实体进行培养；
11.(3)培养96小时后组织块四周开始长出放射状的白色新菌丝，此后保持在25℃
±
1℃的温度下培养5
‑
7天得到功能香菇母种液；
12.(4)制造黄芪香菇培养基：分别取黄芪颗粒、醋柳木屑、田园土、甘草和石膏粉，充分混合均匀，得到混合干料；向混合干料中加水得到混合湿料，加水量为所述混合湿料重量的55
‑
65％，充分均匀混合，ph值为自然，将混合湿料121℃下灭菌30min，得到黄芪香菇培养基；
13.(5)制作功能香菇栽培种：将功能香菇母种液移接到黄芪香菇培养基中，在无菌条件下培养30天，得到功能香菇栽培种；
14.(6)出菇：将功能香菇栽培种接种到黄芪香菇培养基中，在25℃
ꢀ‑
28℃的条件下进行菌丝培养，培养40天后菌丝进入生理成熟期，再移入出菇室进入出菇培养，即可得到功能香菇。
15.优选的，黄芪母种培养液的配方包括：黄芪下脚料2
‑
8份、玉米粉15
‑
25份、葡萄糖10
‑
20份、豆粉10
‑
20份，纯化水1000
‑
1100份。
16.优选的，含有孢子的香菇子实体培养的湿度保持在60％
‑
70％，恒温24℃
‑
26℃。
17.优选的，香菇子实体用无菌水冲洗2
‑
3遍，再用灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分，且香菇子实体的菌褶位于靠近黄芪母种培养液的一面。
18.优选的，功能香菇栽培种的无菌培养湿度为60％
‑
70％，功能香菇栽培种的无菌培
养温度为前20天温度控制在25℃，20
‑
40天后温度降至20℃
‑
17℃。
19.优选的，黄芪香菇培养基的配方包括：醋柳木屑50％、黄芪颗粒 5％
‑
20％、麦麸20％、田园土5％
‑
20％、甘草4％和石膏粉1％。
20.优选的，出菇培养是对菌丝进行60％的见光培养，菌丝进入生理成熟期后，移至出菇室进行出菇培养。
21.优选的，功能香菇可采摘3
‑
4茬，功能香菇从长出菇蕾起计算，整个出菇周期为120天。
22.优选的，功能香菇可以在超低温粉碎技术下将转化后的功能香菇在新鲜状态下粉碎，制备得到保鲜的粉状功能食品。
23.相比于现有技术，本发明的有益效果是：
24.(1)通过我国传统中药优势和现代生物技术的成功引入，成功将黄芪中的有效生物活性成分转化至功能香菇，同时使功能香菇产生了新的活性物质。
25.(2)功能香菇具备比普通香菇更高的活性多糖含量以及提取效率。
26.(3)功能香菇在结直肠癌细胞系上显示出了明确的抗癌细胞增殖的活性，同时还能够与经典的化学抗癌药物产生联合作用，从而促进阳性对照药物的抗癌活性。
27.(4)通过肿瘤免疫学的探查，可见功能香菇可以促进巨噬细胞的活化，促进树突状细胞的成熟，从而发挥癌症免疫调节作用。
28.(5)通过系列研究，发现功能香菇20％具备有更强的潜在抗癌及癌症免疫调节方面的生物活性。
29.综合所述，在传统香菇培育技术的技术上，充分利用我国传统中药优势技术，现代生物技术手段，以及最新科技研究成果，成功发明了一种明确潜在抗癌活性及癌症免疫功能调节作用的功能香菇，并对其最佳的提取及培育条件进行了功能验证性的筛选。
附图说明
30.图1基于气相色谱－液相色谱－质谱联用技术的不同比例功能香菇的总离子流图；
31.图2 不同比例功能香菇与普通香菇之间差异代谢物的韦恩示意图；
32.图3 三种不同提取方法比较功能香菇与普通香菇中的多糖含量；
33.图4 三种不同提取方法比较功能香菇与普通香菇的多糖提取率；
34.图5 功能香菇在大肠癌细胞系hct116的细胞毒性作用；
35.图6 功能香菇在大肠癌细胞系sw480的细胞毒性作用；
36.图7 功能香菇与奥沙利铂在乳腺癌细胞系t47d的细胞毒性协同作用；
37.图8 thp
‑
1共聚焦显微镜下各组thp
‑
1细胞分化的巨噬细胞乳胶珠吞噬作用；
38.图9 树突状细胞在不同组的活化时程实验。
具体实施方式
39.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
40.实施例一
41.一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法，包括以下步骤：
42.(1)制作黄芪母种培养液：分别取黄芪下脚料6份、玉米粉20 份、葡萄糖15份、豆粉15份，加入纯化水1000份，充分混合均匀，熬汁液装入培养瓶，并在121℃下灭菌30min，经灭菌后，得到黄芪母种培养液；
43.(2)功能香菇母种液的获取：在无菌净化室将成熟香菇子实体接种到黄芪母种培养液上方，香菇子实体在接种前用无菌水冲洗2
‑
3 遍，再用灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分，且香菇子实体的菌褶位于靠近黄芪母种培养液的一面，直到香菇子实体自行弹射孢子落到培养液上，对含有孢子的香菇子实体进行培养，培养的湿度保持在60％
‑
70％，恒温24℃
‑
26℃；
44.(3)培养96小时后组织块四周开始长出放射状的白色新菌丝，此后保持在25℃
±
1℃的温度下培养7天得到功能香菇母种液；
45.(4)制造黄芪香菇培养基：分别取醋柳木屑50％、黄芪颗粒5％、麦麸20％、田园土20％、甘草4％和石膏粉1％，充分混合均匀，得到混合干料；向混合干料中加水得到混合湿料，加水量为混合湿料重量的 60％，充分均匀混合，ph值为自然，将混合湿料121℃下灭菌30min，得到黄芪香菇培养基；
46.(5)制作功能香菇栽培种：将功能香菇母种液移接到黄芪香菇培养基中，在无菌条件下培养30天，培养湿度为60％
‑
70％，温度为前20天温度控制在25℃，20
‑
40天后温度降至20℃
‑
17℃得到功能香菇栽培种；
47.(6)出菇：将功能香菇栽培种接种到黄芪香菇培养基中，在25℃
ꢀ‑
28℃的条件下进行菌丝培养，即对菌丝进行60％的见光培养，菌丝进入生理成熟期后，移至出菇室进行出菇培养40天后菌丝进入生理成熟期，再移入出菇室进入出菇培养，即可得到功能香菇5％。功能香菇5％可采摘3
‑
4茬，功能香菇5％从长出菇蕾起计算，整个出菇周期为120天。将功能香菇5％可以在超低温粉碎技术下将转化后的功能香菇5％在新鲜状态下粉碎，制备得到保鲜的粉状功能食品。
48.实施例二
49.一种可抗癌细胞增殖及调节肿瘤免疫的功能香菇的培养方法，包括以下步骤：
50.(1)制作黄芪母种培养液：分别取黄芪下脚料6份、玉米粉20 份、葡萄糖15份、豆粉15份，加入纯化水1000份，充分混合均匀，熬汁液装入培养瓶，并在121℃下灭菌30min，经灭菌后，得到黄芪母种培养液；
51.(2)功能香菇母种液的获取：在无菌净化室将成熟香菇子实体接种到黄芪母种培养液上方，香菇子实体在接种前用无菌水冲洗2
‑
3 遍，再用灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分，且香菇子实体的菌褶位于靠近黄芪母种培养液的一面，直到香菇子实体自行弹射孢子落到培养液上，对含有孢子的香菇子实体进行培养，培养的湿度保持在60％
‑
70％，恒温24℃
‑
26℃；
52.(3)培养96小时后组织块四周开始长出放射状的白色新菌丝，此后保持在25℃
±
1℃的温度下培养5
‑
7天得到功能香菇母种液；
53.(4)制造黄芪香菇培养基：分别取醋柳木屑50％、黄芪颗粒20％、麦麸20％、田园土5％、甘草4％和石膏粉1％，充分混合均匀，得到混合干料；向混合干料中加水得到混合湿料，加水量为混合湿料重量的 60％，充分均匀混合，ph值为自然，将混合湿料121℃下灭菌30min，得到黄芪香菇培养基；
54.(5)制作功能香菇栽培种：将功能香菇母种液移接到黄芪香菇培养基中，在无菌条件下培养30天，培养湿度为60％
‑
70％，温度为前20天温度控制在25℃，20
‑
40天后温度降至20℃
‑
17℃得到功能香菇栽培种；
55.(6)出菇：将功能香菇栽培种接种到黄芪香菇培养基中，在25℃
ꢀ‑
28℃的条件下进行菌丝培养，即对菌丝进行60％的见光培养，菌丝进入生理成熟期后，移至出菇室进行出菇培养40天后菌丝进入生理成熟期，再移入出菇室进入出菇培养，即可得到功能香菇20％。功能香菇20％可采摘3
‑
4茬，功能香菇20％从长出菇蕾起计算，整个出菇周期为120天。将功能香菇20％可以在超低温粉碎技术下将转化后的功能香菇20％在新鲜状态下粉碎，制备得到保鲜的粉状功能食品。
56.结果分析
57.(一)对黄芪、香菇、实施例一得到的功能香菇5％，实施例二得到的功能香菇20％的差异代谢物进行分析
58.通过使用基于气相色谱－液相色谱－质谱联用等技术，对黄芪、香菇、功能香菇5％，功能香菇20％进行全代谢组学检测，以对其代谢组学成分进行全方位探查。结果显示，在负离子模式下，总共获得3307个峰，正离子模式下获得了3130个峰。获得的峰的总离子电流如图1基于气相色谱－液相色谱－质谱联用技术的不同比例功能香菇的总离子流图所示。
59.进一步分析可见，黄芪、普通香菇，功能香菇5％，功能香菇20％之间代谢物有不同程度的差异。将这些差异代谢物进行分析，结果如图2不同比例功能香菇与普通香菇之间差异代谢物的韦恩示意图。可见通过黄芪作为培养基的加入，可以明确鉴定的19个代谢物从黄芪中成功转入功能香菇5％，14个代谢物从黄芪成功转入功能香菇20％。不仅如此，通过黄芪的培养，分别有18个和22个新的代谢物仅分别存在于功能香菇5％、功能香菇20％中。这说明中药生物活性转化技术成功在功能香菇中实现，功能香菇具备了具有特定生物活性的物质基础。
60.经过在现有代谢物注释数据库中的对比，对目前可以识别的上述差异代谢物进行具体分析，并将在组间呈现差异的具体差异代谢物进行归纳，结果见表1。其中由黄芪转化入功能香菇的代谢物是指存在于黄芪和功能香菇中，但是在普通香菇中未见到的化合物，提示这些化合物可能通过培育从黄芪成功转化入功能香菇；仅存在于功能香菇中的化合物是指既不存在于普通香菇中，也不存在于黄芪中，仅在功能香菇中发现的化合物，该部分化合物是由于黄芪的培育，而在功能香菇中新生成的化合物。进一步分析可知，11种代谢物，即aspargine4，3
‑
cyanoalanine，2
‑
deoxytetronic acid，erythrose 2，l
‑
threose2，2,4
‑
diaminobutyric acid 3，3
‑
methylamino
‑
1,2
‑
propanediol 2， cholestan
‑
3beta
‑
ol，以及 (2r,3s)
‑2‑
hydroxy
‑3‑
isopropylbutanedioic acid成功地从黄芪转移到功能香菇中。cholestane
‑
3,5,6
‑
triol和 1,4
‑
cyclohexanedione 1仅存在于功能香菇5％中，而cycloleucine1和resveratrol 1则仅在功能香菇20％中被检测到。这些结果充分证实了次生代谢物已经从黄芪转移到功能香菇中，这为功能香菇在潜在抗肿瘤及肿瘤免疫方面的调节作用奠定了物质基础。
61.表1不同组间的差异代谢物
62.[0063][0064]
结合表1，进一步对具体的次生代谢物进行分析，可以发现threose nucleic acids可以特异性、靶向性地抑制癌细胞中抗凋亡蛋白bcl
‑
2的mrna和蛋白质表达，从而显示抗癌作用。另一种从黄芪中转化至功能香菇中的化合物asparagine，已经被证实具有抗增殖活性并调节癌细胞中的mtor信号传导。类似地，发现其他转移的化合物如erythrose，2,4diaminobuturic acid，以及cholestane
‑
3 β,5α,6β
‑
triol均被报道具有明确的抗癌细
胞增殖和抗肿瘤特性。这些证据都为功能香菇可能存在的抗肿瘤作用提供了化学证据。 (二)功能香菇的提取率及生物活性多糖含量均较普通香菇显著增加
[0065]
由于多糖是香菇以及黄芪中均已被明确证明具有高抗癌细胞增殖特性的主要成分，对功能香菇中多糖含量的研究分析，可以提供活性多糖含量及提取量的变化，从而对其潜在的抗癌细胞增殖作用的功能提供相应的生物学基础。
[0066]
为了更科学、更全面地揭示切实的研究结果，在该发明中引入了三种绿色创新提取技术，分别是微波 酶促法、超声 酶促法、微波 超声 酶促法，可以在确定相应多糖产量的同时，可以确保该富含多糖的提取物可用于食品乃至制药行业。相应的多糖含量及提取率的结果分析分别见图3三种不同提取方法比较功能香菇与普通香菇中的多糖含量和图4三种不同提取方法比较功能香菇与普通香菇的多糖提取率。
[0067]
由图3和图4可以看出，三种不同的提取方法均显示功能香菇的总多糖含量及提取率均较普通香菇高，而且三种提取方法之间没有显著差别。其中以微波 超声 酶促法显示出最高的多糖含量，功能香菇 20％，功能香菇5％，普通香菇三者的多糖含量分别为66.2
±
6.3％、60.4
ꢀ±
1.6％、48.5
±
1.3％(图3)；以超声 酶促法显示出最高的多糖提取率，功能香菇20％，功能香菇5％，普通香菇三者的多糖提取率分别为11.1
±
0.29％、8.07
±
0.35％、6
±
0.13％(图4)。
[0068]
(三)功能香菇的在结直肠癌细胞系上显示出抗癌活性
[0069]
1.功能香菇在大肠癌细胞系hct116上的细胞毒性作用如图5功能香菇在大肠癌细胞系hct116的细胞毒性作用。由图5可见，功能香菇5％和功能香菇20％在干预大肠癌细胞系hct116 48小时之后，与普通香菇相比较均显示出了更强的细胞毒性作用，最高的细胞毒性作用发生在1.6mg/ml浓度时，功能香菇20％和功能香菇5％分别导致了 94
±
3.14％和77
±
2.82％的癌细胞死亡率。可见以功能香菇20％的细胞毒作用更为明显。
[0070]
2.功能香菇在大肠癌细胞系sw480上的细胞毒性作用如图6功能香菇在大肠癌细胞系sw480的细胞毒性作用。
[0071]
由图6可见，功能香菇5％和功能香菇20％在干预大肠癌细胞系 sw480 72小时之后，浓度从1.25mg/ml开始，功能香菇5％和20％与普通香菇相比较即显示出了更强的细胞毒性作用。功能香菇20％更是在0.3125mg/ml时即显示出高达80％的癌细胞死亡率。结果提示，与功能香菇5％相比，功能香菇20％在大肠癌细胞系上显示了更强的抗癌细胞增殖的活性。
[0072]
(四)功能香菇与常用抗癌化学药物存在协同/增效作用
[0073]
功能香菇与抗癌常用阳性药物奥沙利铂(oxaliplatin)在乳腺癌细胞系t47d上的作用如图7功能香菇与奥沙利铂在乳腺癌细胞系 t47d的细胞毒性协同作用所示。
[0074]
由图7可见，功能香菇5％和功能香菇20％均可以对阳性药物奥沙利铂产生协同增效作用，且以功能香菇20％效果更为明显。提示功能香菇与阳性抗癌药物奥沙利铂一起使用，具有增强奥沙利铂抗癌作用的生物效应。
[0075]
(五)功能香菇对免疫细胞有激活作用，从而发挥肿瘤免疫调节作用
[0076]
巨噬细胞的活化能释放直接杀伤肿瘤细胞的物质，从而为抗肿瘤提供防御机制。功能香菇对增加诱导巨噬细胞吞噬作用的结果见图8。
[0077]
由图8thp
‑
1共聚焦显微镜下各组thp
‑
1细胞分化的巨噬细胞乳胶珠吞噬作用可
见，共聚焦显微镜下可见功能香菇5％和功能香菇20％均比普通香菇有更强的吞噬能力，均可以通过提高免疫力而发挥更强的肿瘤杀伤作用。但两者相比，20％的功能香菇显示了更强的免疫细胞激活作用。
[0078]
(六)功能香菇可以促进树突状细胞的成熟：
[0079]
树突状细胞是机体免疫反应的中央调节器。树突状细胞成熟为细胞毒t细胞提供共刺激信号，从而有利于杀死肿瘤细胞。在许多肿瘤中都发现树突状细胞的成熟被抑制，功能香菇(10μg/ml)对树突状细胞活化时程及成熟作用结果见图9树突状细胞在不同组的活化时程实验。
[0080]
由图9可见功能香菇5％和功能香菇20％均较普通香菇在培育48 小时后呈现更多的双阳性细胞，提示功能香菇可以促进树突状细胞的成熟，显示出更强的免疫激活效应。
[0081]
综合上述分析可以看到，通过我国传统中药优势和现代生物技术的成功引入，成功将黄芪中的有效生物活性成分转化至功能香菇，同时使功能香菇产生了新的活性物质，同时，具备比普通香菇更高的活性多糖含量以及提取效率。在这些化学物质的基础上，功能香菇在结直肠癌细胞系上显示出了明确的抗癌细胞增殖的活性，同时还能够与经典的化学抗癌药物产生联合作用，从而促进阳性对照药物的抗癌活性。除此之外，通过肿瘤免疫学的探查，可见功能香菇可以促进巨噬细胞的活化，促进树突状细胞的成熟，从而发挥癌症免疫调节作用。而且通过系列研究，发现功能香菇20％具备有更强的潜在抗癌及癌症免疫调节方面的生物活性，这为以该功能香菇为基础的后续研究奠定了坚实的基础。
[0082]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。