甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用的制作方法

1.本发明属于细胞学药理学技术领域，具体涉及一种涉及甲萘醌(menadione，简称mena)诱导肿瘤细胞发生程序性死亡的新型药物，即通过激活mapk8表达促进肿瘤细胞程序性坏死的新药物，还涉及mena用于治疗肠癌的新型药物的筛选方法。


背景技术：

2.尽管医疗水平不断提升，但肿瘤的治疗仍然面临着极大挑战，由于无法彻底杀死肿瘤细胞，不少肿瘤患者会出现预后差和复发等现象，因此寻找能够有效诱导肿瘤细胞发生死亡模式的药物已经成为了医学研究的重中之重。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,tnf)是一类能使多种肿瘤发生出血性坏死的细胞因子，根据分泌tnf的细胞，可将tnf分为两类：巨噬细胞分泌的tnf
‑
α和t淋巴细胞分泌的tnf
‑
β，目前常说的tnf多指tnf
‑
α。由于其强大的抗肿瘤特性，tnf在1984年被应用于临床试验，是第一个被用于肿瘤生物疗法的细胞因子。tnf能激活细胞的一系列程序性死亡通路包括凋亡和程序性坏死，但当大量的tnf进入机体循环系统时，其药物副作用极大，例如会诱导产生类似脓毒血症的症状，甚至引起中毒性休克，最终导致多器官衰竭和死亡。tnf严重的毒副反应使得其在临床上的应用受到了极大的限制，目前仅应用于少数疾病的局部治疗，如tnf与ifn
‑
γ和melphalan联合治疗四肢黑色素瘤和软组织肉瘤。因此，考虑到tnf应用的局限性，应当寻找一些可替代tnf、诱导细胞发生程序性死亡的化合物。
3.然而新药研发是一个漫长的过程，需要耗费巨大的人力和物力资源，目前关于药物筛选平台和新药筛选背景，主要存在的问题是：一是在新药和治疗性生物制品的开发创新方面研发时间长，投资风险大；二是研发的药物溶解性和安全性亟需动物及临床验证。为了节约医药资源，“老药新用”成为了开发“新药”的另一策略。例如，利用已有的药物化合物库，通过细胞的生理生化基础，选择适当的筛选模型筛选样品，发现作用优良并具有特点的药物。在上述“老药新用”的研究过程中，最重要的发现药物新功能的重要技术手段是构建高通量药物筛选平台。该技术手段包括：采用已知药理特性的化合物进行筛选，而且筛选规模越大，发现“老药新用”的机会越多；基于细胞生理生化特性构建细胞模型的筛选，特别适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能完成的复杂靶标(这些靶标可能涉及受体或细胞因子间复杂的相互作用)或多靶标。根据作用形式的不同，细胞模型可以分为作用于靶标(位于单一细胞位置，细胞膜上或细胞内)的筛选和作用于细胞整体功能、活性的筛选；其中前者作用位点和机制清楚，但必须明确靶标的生理功能及相应检测方法，后者能直接反映药物对细胞的整体反应，包括细胞毒性、细胞增殖特性、生长和死亡情况等。
4.同时，对于诱导肿瘤程序性坏死的现有药物的研究及应用，目前主要存在以下几个不足之处，包括：(1)以tnf
‑
α为代表的化合物，虽然容易穿过血脑屏障，是良好的分子机制研究工具，但因其化合物家族难溶于水或者电解质溶液，难以作为临床药物进行新药研发工作；(2)tnf
‑
α缺少靶向性以及较强的细胞毒性，在全身给药的情况下会伴随发热、寒战、恶心、呕吐、心动过速等不良反应；(3)已有新药筛选平台大多是基于未知天然产物或化
合物的筛选，其投入成本高，筛选周期和验证实验所需时间长；(4)基于未知化合物筛选出的药物，其对于人体的靶向性不明确，缺乏细胞毒性、细胞代谢和药物毒理学、药物动力学的数据；(5)目前已有的筛选平台基于普通细胞系或动物，筛选平台所用的模式细胞不利于判断药物对于程序性坏死的敏感度测试。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足，新药研发是一个漫长的过程，具有投入时间长，实验风险大等缺陷，为了节约医药资源，降低成本和风险提高成功率，充分开发现有药物的新用途，“老药新用”的研究层出不穷。因此本发明的目的是提供mena作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。
6.基于坏死通路敏感细胞系l929
‑
fadd基因敲除株，对fda批准药库内的化合物进行坏死抑制功能的研究，即基于fda批准药物库，利用坏死敏感细胞系建立高通量筛选平台，既加快了药物动力学和毒理学的实验过程，又能靶向性地在程序性死亡的生理生化通路上进行筛选，发现筛选的mena调控肠癌细胞凋亡和坏死的新化合物的靶点mapk8。
7.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
8.目的之一，本发明提供了mena作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。
9.作为优选的实施例，mena促进肿瘤细胞发生程序性死亡。
10.作为优选的实施例，程序性死亡肿瘤细胞发生凋亡和坏死细胞机制来实现。
11.作为优选的实施例，mena靶向mapk8诱导细胞发生坏死和凋亡。
12.目的之二，本发明提供了mena作为制备治疗肠癌肿瘤药物的筛选方法，其包括以下步骤：
13.(1)、坏死通路敏感细胞系l929
‑
fadd基因敲除细胞株复苏、培养与冻存；
14.(2)、targetmol公司供应的fda批准的药物库的若干小分子化合物定量，且以肿瘤坏死因子tnf
‑
α及其相关复合物作为阳性对照药物；
15.(3)、构建用于制备治疗肿瘤的药物筛选的细胞模型肠癌细胞ht
‑
29；
16.(4)、检测步骤(3)中细胞模型的细胞存活率，并筛选候选药物为mena；
17.(5)、蛋白免疫沉淀检验步骤(4)中候选药物在程序性死亡mapk8信号通路的表达。
18.作为优选的实施例，步骤(1)和步骤(3)的具体方法为：在液氮中取出冻存的l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动融解细胞，然后将l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞分别转入培养皿中加入培养基进行过夜培养，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代。
19.其中，ht
‑
29细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基，在5％体积分数co2、37℃和饱和湿度条件下培养。
20.l929
‑
fadd
‑
ko细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基且加入0.05μl/ml pruo和0.33μl/ml nec
‑
1，在5％体积分数co2、37℃和饱和湿度条件下培养。
21.再选生长状态好、生长旺盛的ht
‑
29细胞和l929
‑
fadd
‑
ko细胞用pbs洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用rpmi
‑
1640培养基终止反应，800rpm离心5min后弃上清，加入冻存液，将细胞分装在冻存管中，放入程序降温盒中保存于
‑
80℃超低温冰箱中，24h后转移至液
氮中。
22.其中，rpmi
‑
1640培养基内含10％体积分数胎牛血清(fbs)、1％体积分数青霉素和链霉素，终止反应条件为：95％体积分数空气、5％体积分数二氧化碳、37℃。
23.冻存液的成分为：10％体积分数二甲基亚砜(dmso)和90％体积分数小牛血清。
24.作为优选的实施例，步骤(2)中，相关复合物包括tnf
‑
α、smac模拟物smac mimetics和泛素半胱天冬酶抑制剂z
‑
vad
‑
fmk。
25.作为优选的实施例，步骤(2)中，小分子化合物定量为：每管体积为100μl，浓度为10mmol/l，使用浓度为30μmol/l，tnf
‑
α、相关复合物的使用浓度分别为30μmol/l作为阳性对照药物。
26.作为优选的实施例，步骤(3)中，细胞模型的构建方法为：在白色96孔板里加入l929
‑
fadd
‑
ko细胞，每孔体积为50μl，细胞数量为5000个/孔，经不同药物组处理后均放入培养箱24h；其中，药物组包括：
27.tnf
‑
α组：按1ml：1μl的比例在完全培养基中加入20ng/ml的tnf
‑
α，再加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α的终浓度为10ng/ml。
28.nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入90mmol/l浓度的nec
‑
1，再加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，nec
‑
1的终浓度为30μmol/l。
29.tnf
‑
α nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α nec
‑
1，然后加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与nec
‑
1的终浓度均保持不变。
30.tnf
‑
α fda approval drug组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α和1068种不同的fda药物，然后加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与fda药物的终浓度保持不变。
31.作为优选的实施例，步骤(4)中，检测细胞模型的细胞存活率的方法为：将celltiter
‑
glo试剂加入经过药物处理后的白色96孔板，每孔体积为100μl，再将白色96孔板温和振荡混匀2min，培养箱孵育5min，使细胞充分裂解产生稳定的发光信号，检测化学发光强度，统计在不同暴露浓度下细胞存活率，筛选候选药物。
32.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
33.第一、本发明的筛选体系通过坏死敏感的特殊细胞系(l929/l929 fadd ko)作为细胞增殖筛选模型，以及fda药物批准药物库的小分子化合物(1068种)的联合应用，从细胞坏死的特殊细胞株和安全性极高的fda药库，进行“老药新用”的坏死抑制剂筛选，从而能精确筛选出安全有效的抑制剂化合物，即影响细胞死亡的药物，并通过坏死抑制剂nec
‑
1作为对照，与候选药物共同培养l929
‑
fadd
‑
ko细胞验证出通过诱导细胞发生坏死的药物，并进行不同的药物浓度的相关性检测。
34.第二、本发明筛选出的药物mena作为抑制坏死的新药，其药效作用在l929
‑
fadd敲除株与阳性药物tnf
‑
α类似；在肠癌细胞模型ht
‑
29中的药效与tsz阳性对照相似，对于细胞坏死有类似的抑制功效；但mena的水溶性更好，由于mena作为维生素k的前体，是fda已获批的临床药物，其各项体内体外的药理毒理指标均比tnf
‑
α好，即其药物动力学和体内毒性均已有过临床数据，药理毒理数据齐全，靶向性和安全性有保障，易于临床推广，故进行老药新用的临床实验数据更全。
附图说明
35.图1为本发明的实施例中l929
‑
fadd
‑
ko细胞经tnf、nec
‑
1和tnf nec
‑
1处理后的细胞存活率示意图。
36.图2为本发明的fda药物处理后的细胞存活率示意图(1为menamenadione，2为双硫仑disulfira，3为伯舒替尼bosutinib，4为偶氮蓝evans blue，5为结晶紫crystal violet，6为吡硫锌zinc pyrithione，7为盐酸决奈达隆dronedarone hydrochloride，8为马来酸替加色罗tegaserod maleate，9为克唑替尼crizotinib，10为帕纳替尼ponatinib，11为醋酸巴多昔芬bazedoxifene acetate，12为米尔贝肟milbemycin oxime，13为凡德他尼vandetanib，14为色瑞替尼ceritinib，15为溴酸沃替西汀vortioxetinehbr，16为盐酸芬戈莫德fingolimodhydrochloride，17为迈瑞替尼mesylate)。
37.图3为本发明的实施例中tsz对于诱导肿瘤细胞ht
‑
29的时间/浓度
‑
梯度反应关系示意图。
38.图4为本发明的实施例中mena对于诱导肿瘤细胞ht
‑
29的时间/浓度
‑
梯度反应关系示意图。
39.图5为本发明的实施例中tsz、mena
‑
3μm和mena
‑
8μm诱导ht
‑
29细胞程序性死亡示意图。
40.图6为本发明的实施例中control、tsz、mena
‑
3和mena
‑
8诱导mapk8的死亡通路示意图。
具体实施方式
41.本发明提供了一种mena作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。即选择坏死通路敏感细胞系l929
‑
fadd基因敲除细胞株，和肠癌细胞株ht
‑
29作为细胞增殖和坏死的模式细胞，基于targetmol公司供应的的fda批准的药物库，从fda药物库的小分子化合物(1068种)中筛选能诱导细胞程序性死亡的药物，并且发现mena是通过激活程序性死亡通路诱导细胞死亡的药物。进行不同药物浓度的相关性检测，明确药物的毒性
‑
效应浓度，基于对毒性和恢复效率的综合考量，获得通过抑制细胞发生坏死来治疗程序性坏死疾病的新型药物mena。
42.本发明证实mena在坏死敏感细胞系l929
‑
fadd敲除株、人细胞系ht29和动物模型上都有极好的调控细胞死亡的效果，这种程序性死亡的机制调控是通过mena促进mapk8基因表达来实现的。
43.本发明的mena作为制备治疗肠癌肿瘤新型药物中的应用。
44.具体地，mena促进诱导肿瘤细胞发生程序性死亡。
45.程序性死亡肿瘤细胞发生凋亡和坏死细胞机制来实现。
46.mena通过靶向激活细胞mapk8基因，从而发生坏死和凋亡来实现。
47.本发明的mena作为制备治疗肠癌肿瘤药物的筛选方法，将坏死通路敏感细胞系l929
‑
fadd基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从fda药物库若干小分子化合物中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物作为候选药物，再对候选药物在肠癌细胞ht
‑
29进行不同药物浓度、给药时间的检测，明确候选药物的毒性
‑
效应浓度，然后从毒性和恢复效率综合评估，获得mena，通过调控细胞发生程序性死亡路径作为治疗肠癌肿瘤的新型
药物。
48.具体包括以下步骤：
49.(1)、坏死通路敏感细胞系l929
‑
fadd基因敲除细胞株复苏、培养与冻存；
50.(2)、fda药物库的若干小分子化合物定量，且以肿瘤坏死因子tnf
‑
α及其相关复合物(包括tnf
‑
α、smac模拟物smac mimetics和泛素半胱天冬酶抑制剂z
‑
vad
‑
fmk)，简称为tsz，作为阳性对照药物；
51.(3)、构建用于制备治疗肿瘤的药物筛选的细胞模型肠癌细胞ht
‑
29；
52.(4)、检测步骤(3)中细胞模型的细胞存活率，并筛选候选药物为mena；
53.(5)、蛋白免疫沉淀检验步骤(4)中候选药物在程序性死亡mapk8信号通路的表达。
54.其中，步骤(1)和步骤(3)的具体方法为：在液氮中取出冻存的l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动细胞快速融解，然后将l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞分别转入培养皿中加入培养基进行过夜培养，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代。
55.其中，ht
‑
29细胞的培养基为含10％体积分数fbs的高糖dmem培养基，在5％体积分数co2、37℃和饱和湿度条件下培养。
56.l929
‑
fadd
‑
ko细胞的培养基为含10％体积分数fbs的高糖dmem培养基且加入0.05μl/ml pruo和0.33μl/ml nec
‑
1，在5％体积分数co2、37℃和饱和湿度条件下培养。
57.再选生长状态好、生长旺盛的ht
‑
29细胞和l929
‑
fadd
‑
ko细胞用pbs洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用rpmi
‑
1640培养基终止反应，800rpm离心5min后弃上清，加入冻存液，将细胞分装在冻存管中，放入程序降温盒中保存于
‑
80℃超低温冰箱中，24h后转移至液氮中。
58.其中，rpmi
‑
1640培养基内含10％体积分数fbs、1％体积分数青霉素和链霉素，终止反应条件为：95％体积分数空气、5％体积分数co2、37℃。
59.冻存液的成分为：10％体积分数dmso和90％体积分数小牛血清。
60.在步骤(2)中，小分子化合物定量为：每管体积为100μl，浓度为10mmol/l，使用浓度为30μmol/l，tnf
‑
α、tsz的使用浓度分别为30μmol/l作为阳性对照药物。
61.在步骤(3)中，细胞模型的构建方法为：在白色96孔板里加入l929
‑
fadd
‑
ko细胞，每孔体积为50μl，细胞数量为5000个/孔，经不同药物组处理后均放入培养箱24h；其中，药物组包括：
62.tnf
‑
α组：按1ml：1μl的比例在完全培养基中加入20ng/ml浓度的tnf
‑
α，再加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α的终浓度为10ng/ml。
63.nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入90mmol/l浓度的nec
‑
1，再加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，nec
‑
1的终浓度为30μmol/l。
64.tnf
‑
α nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α nec
‑
1，然后加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与nec
‑
1的终浓度均保持不变。
65.tnf
‑
α fda approval drug组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α和1068种不同的fda药物，然后加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与fda药物的终浓度保持不变。
66.在步骤(4)中，检测细胞模型的细胞存活率的方法为：将celltiter
‑
glo试剂加入经过药物处理后的白色96孔板，每孔体积为100μl，再将上述白色96孔板放在振荡器上温和振荡混匀2min，培养箱孵育5min，使细胞充分裂解产生稳定的发光信号，检测化学发光强度，其强度代表atp的量，与细胞数量一致，统计在不同暴露浓度下细胞存活率，筛选与tnf
‑
α相比细胞活率50％及以下的药物作为候选药物。
67.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
68.实施例1：
69.1.敏感测试细胞复苏、培养与冻存：
70.复苏细胞时，从液氮中取出冻存的l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动冻存管使细胞快速融解，然后将l929
‑
fadd
‑
ko细胞和ht
‑
29细胞分别转入培养皿中加入正常培养基进行培养过夜，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代。其中，ht
‑
29细胞及l929
‑
fadd
‑
ko细胞均使用含10％体积分数fbs的高糖dmem培养基，含5％体积分数co2、37℃及饱和湿度条件下培养，l929
‑
fadd
‑
ko细胞另外在培养基里加入0.05μl/ml pruo 0.33μl/ml nec
‑
1。细胞冻存时，选生长状态好、生长旺盛的细胞用pbs洗细胞两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用含10％体积分数fbs的正常培养基终止反应，细胞800rpm离心5min后弃上清，加入冻存液。细胞培养基为rpmi
‑
1640培养基，含10％体积分数fbs、1％体积分数青霉素和链霉素。培养条件：95％体积分数空气、5％体积分数co2、37℃。冻存液成分：10％体积分数dmso和90％体积分数小牛血清。将细胞分装在冻存管中，放入程序降温盒中保存于
‑
80℃超低温冰箱中，24h后转移至液氮中。
71.2.fda药物库的化合物定量
72.fda
‑
approved drug library(96
‑
well)购自targetmol公司，包含1068种经美国fda批准的药物化合物，每管体积为100μl，浓度为10mmol/l。实验用浓度为30μmol/l。同时，tnf
‑
α和tsz分别作为l929
‑
fadd
‑
ko和ht
‑
29在药物筛选中的阳性对照药物，实验浓度也为30μmol/l。
73.3.建立坏死相关药物筛选细胞模型
74.在白色96孔板里加入l929
‑
fadd
‑
ko细胞，每孔体积为50μl，细胞数量为5000个/孔，经不同药物组处理后均匀放入培养箱24h。具体分组如下：
75.control组：将完全培养基加入含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl。
76.tnf
‑
α组：按1ml：1μl的比例在完全培养基中加入20ng/ml浓度的tnf
‑
α，加入含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α的终浓度为10ng/ml。
77.nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入90mmol/l浓度的nec
‑
1，加入含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，nec
‑
1的终浓度为30μmol/l。
78.tnf
‑
α nec
‑
1组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α nec
‑
1，加入含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与nec
‑
1的终浓度均保持不变。
79.tnf
‑
α fda approval drug组：按1ml：0.66μl的比例在完全培养基中加入tnf
‑
α和
1068种不同的fda药物，然后加入至含有l929
‑
fadd
‑
ko细胞白色96孔板，每孔体积为50μl，tnf
‑
α与fda药物的终浓度保持不变。
80.4.检测替代nec
‑
1药物的ic50值
81.分别用l929
‑
fadd
‑
ko细胞和l929细胞检测候选药物的ic50值，用不同浓度梯度的fda坏死相关候选药物进行处理，给予24h的暴露时间，未给药的空白对照组给予同体积的完全培养基。在暴露结束后，用化学发光法检测细胞活性，并统计在不同暴露浓度下细胞的存活率，通过计算机软件计算得出ic50。
82.5.化学发光法细胞存活率检测
83.celltiter
‑
glo试剂使得细胞裂解产生的发光信号与存在的atp量成正比。而atp量直接与培养物中的细胞数量成正比，通过对atp进行定量测定来检测培养物中活细胞的数量。将celltiter
‑
glo试剂加入经过药物处理后的白色96孔板，每孔体积为100μl，后将微孔板放在振荡器上温和振荡混匀2min，培养箱孵育5min，使细胞充分裂解产生稳定的发光信号，检测化学发光强度，其强度代表atp的量，与细胞数量一致。
84.6.药物靶点实验
85.将筛选的后续药物进行蛋白免疫沉淀检验，验证其在坏死信号通路上的表达。
86.实施例2：
87.1.建立l929
‑
fadd
‑
ko敲除株细胞模型进行坏死相关药物筛选的方法
88.首先，本实施例在利用阳性对照(tnf
‑
α组)和nec
‑
1抗坏死抑制剂的拮抗组，在l929
‑
fadd
‑
ko细胞系中检测并确定该细胞系对于不同功能药物的敏感度。为坏死相关药物筛选的细胞增殖模型初步建立，以及用于fda药物的初筛奠定基础。
89.用各组药物处理l929
‑
fadd
‑
ko细胞，24h后通过atp水平检测细胞存活率，control组作为标准，化学发光仪检测数据分析如下，tnf
‑
α组(10ng/ml)对细胞的杀伤力几乎达到50％，nec
‑
1组(30μmol/l)能将细胞恢复到90％(见表1及图1)。
90.表1 l929
‑
fadd
‑
ko细胞经tnf、nec
‑
1和tnf nec
‑
1处理后的细胞存活率
91.controltnftnf nec
‑
1nec
‑
110.54050.89010.875710.52070.92610.926110.51710.91170.9892
92.2.fda药物替代tnf
‑
α在l929
‑
fadd
‑
ko敲除株中的筛选
93.用l929
‑
fadd
‑
ko敲除株细胞增殖模型对fda药物库进行坏死相关的初筛。经一千余个fda药物(10μmol/l)分别处理24h后，若同一药物处理的三个复孔细胞存活率均高于50％(数值0.5以上)，认为该药对l929
‑
fadd
‑
ko细胞具有较强抑制坏死作用，可以作为候选药物进行进一步的功能研究(图2)。
94.3.筛选药物在肠癌模型ht
‑
29浓度和时间梯度的验证
95.首先，本实施例探究阳性对照药物细胞坏死因子及其相关化合物的剂量毒性效应，选择tsz(包括tnf
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α、smac模拟物smac mimetics和泛素半胱天冬酶抑制剂z
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vad
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fmk)诱导细胞发生程序性坏死，作为阳性对照。在相关文献报道中，smac模拟物(smac mimetics)和泛素半胱天冬酶抑制剂z
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vad
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fmk作用于ht
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29细胞能够引起细胞发生坏死，并且与tnf
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α联合作用能够增强其诱导ht
‑
29细胞死亡的能力，是tnf
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α诱导细胞发生程序
性死亡的经典模型，结果如图3所示：tsz作用于ht
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29的剂量效应反应关系无明显变化，说明tsz对促进肠癌细胞ht
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29并无特异性。接着，本实施例探究mena作用于结直肠癌细胞系ht
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29的剂量毒性效应。如图4所示，设置mena浓度的梯度分别为4μmol/l、6μmol/l、8μmol/l和10μmol/l，处理ht
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29细胞24h后，利用celltiter
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glo发光活细胞检测试剂盒测定细胞活率。celltilter
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glo试剂盒的检测原理是通过测定atp含量从而确定活细胞数目，试剂盒具有很好的灵敏度和稳定性。细胞活率检测结果如图4所示，可见mena确实能够诱导ht
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29细胞死亡，效率随浓度增加而增加，且高浓度mena几乎能够完全杀死ht
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29细胞。
96.4.筛选药物mena的靶向mapk8验证
97.在确定了mena确实能够诱导结直肠癌细胞ht
‑
29死亡并激活程序性死亡相关通路后，采用qiagen公司的rt
2 profiler
tm pcr array human cell death pathway finder(简称cell death pcr array)高通量测定细胞死亡相关通路基因的表达情况。如图5所示，实验共设置四组：control组、menadione
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3μm组、menadione
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8μm组和tsz组(与rt
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qpcr为同一批rna)。筛选差异表达基因(differentially expressed genes,degs)，进一步探究其关键作用分子。结合差异分析结果，mapk8为mena诱导ht
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29细胞死亡的关键信号分子。mapk8为mena处理组的上调差异表达基因，在蛋白互作(ppi)网络分析中，mapk8与其他基因相互作用程度大，表明mapk8是一个关键调控分子。
98.5.免疫共沉淀实验证实肠癌细胞中mena诱导mapk8的死亡通路
99.如图6所示，肠癌细胞ht
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29与阳性对照tsz，以及3μmol/l的mena(简写为mena
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3)、8μmol/l的mena(简写为mena
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8)进行共处理，所得细胞通过westernblot免疫共沉淀法，检测mapk8的表达。说明mena靶向刺激mapk8的表达，及其相关坏死、凋亡关键基因caspase8(简称为cas
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8)信号通路。
100.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。