一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂及制备方法与流程

1.本发明涉及农业微生物技术领域，尤其是涉及一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂及制备方法。


背景技术：

2.马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物，马铃薯的种植区域广泛，病害也较为复杂，马铃薯疮痂病是目前影响马铃薯生产的重要病害之一，在国内马铃薯生产基地普遍存在，马铃薯疮痂病主要危害块茎，初期在薯块表皮产生褐色斑点，逐渐扩大成褐色近圆形或不定型大斑，病斑多分散在马铃薯的表层，导致病薯外观难看、不耐贮藏，使马铃薯的质量下降，降低了马铃薯的商品价值，马铃薯疮痂病一般可使马铃薯减产10
‑
30％。
3.目前，多采用轮作、薯苗及种子消毒、土壤消毒、加强栽培管理和喷药防治等综合性防治措施来降低马铃薯疮痂病的发生率，但效果一般，微生物菌剂是预防马铃薯疮痂病的新方向，微生物菌剂能够直接或间接改良土壤、预防土传病害、降解有毒害物质，能够有效降低马铃薯疮痂病的发生率，提高马铃薯的产品质量。
4.然而，当前用于预防马铃薯疮痂病的微生物菌剂多是在种植马铃薯后以灌施的方式进行施肥，造成土壤中水分含量过高，容易使土壤中病原菌的大量繁殖，降低微生物菌剂的拮抗作用，影响对马铃薯疮痂病的预防效果，尤其是有过马铃薯疮痂病病史的土地，病原菌繁殖更加严重。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂适应性强、稳定性好，有利于微生物在马铃薯根部的定殖和活性保持，无需对马铃薯进行灌施，提高了复合微生物菌剂的拮抗作用，解决了因灌施使土壤中病原菌大量繁殖的问题；本发明的第二目的在于提供一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂的制备方法。
6.本发明提供的一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂，包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌5
‑
25份、淡紫拟青霉菌5
‑
25份、哈茨木霉菌5
‑
25份、侧孢短芽孢杆菌5
‑
25份和葡萄糖48
‑
52份。
7.本技术从自然界中筛选获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌四种菌株，枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进马铃薯的生长，并使马铃薯能够抵抗病原菌的侵害；哈茨木霉菌具有较强根际能力，易于在马铃薯根部定殖，并产生刺激马铃薯生长和诱导马铃薯防御反应的化合物，改善马铃薯根系微生物环境，增强马铃薯的长势和抗病能力，提高马铃薯的产量和收益；淡紫拟青霉菌在马铃薯根系能够抑制线虫的污染，代谢产生的吲哚乙酸产物在低浓度时能够促进马铃薯根系生长；侧孢短芽孢杆菌能够增强光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸盐含量，固化若干重金属，降低马铃薯体内重金属含量，将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短
芽孢杆菌共同作用，并采用葡萄糖作为碳源，制备的复合微生物菌剂能够增强马铃薯根系的吸收作用和固定作用，为马铃薯植株生长提供丰富的营养物质，能够替代部分氮肥起到改良土壤、提高土壤肥力等作用，促进马铃薯植株的生长发育，减少了肥料的施用量，且哈茨木霉菌使制备的复合微生物菌剂易于在马铃薯根系定殖和活性保持，将复合微生物菌剂以拌种、喷洒的方式施入马铃薯根部附近即可，无需对马铃薯进行灌施，避免因土壤中水分含量较高而使病原菌大量繁殖的情况出现；此外，枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌和哈茨木霉菌协同作用，能够改善马铃薯根系微生物环境，提高马铃薯的免疫力，促进马铃薯根际土壤中有益细菌的富集，使马铃薯根际土壤由“真菌型”向“细菌型”转变，降低真菌病害的发生率，提高马铃薯的品质。
8.进一步地，枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的活菌数均大于3
×
108cfu/g。
9.进一步地，枯草芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，淡紫拟青霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，哈茨木霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，侧孢短芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g。本技术筛选获得的枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌，易分离培养，代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快、稳定性好，经发酵处理后可作为生防菌大量生产和应用。
10.本发明提供的一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
11.s1.分别对枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种进行筛选和纯化，对纯化后的菌种进行培养分离得到枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的单菌落，对单菌落进行再次培养，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株；
12.s2.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株接种到培养基中培养，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的液体种子；
13.s3.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的液体种子接种到固态发酵培养基中进行发酵，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液；
14.s4.将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液经恒温干燥后研磨成粉末，获得枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末；
15.s5.将枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末、侧孢短芽孢杆菌粉末和葡萄糖均匀混合，获得复合微生物菌剂。
16.进一步地，步骤s2为：将枯草芽孢杆菌的纯化菌株接种至活化培养基，在35
‑
40℃、180
‑
200r/min的条件下培养46
‑
50h，获得枯草芽孢杆菌的液体种子；将淡紫拟青霉菌的纯化菌株接种至活化培养基，在26
‑
30℃、180
‑
200r/min的条件下培养46
‑
50h，获得淡紫拟青霉菌的液体种子；将哈茨木霉菌的纯化菌株接种到pda斜面培养基，室温培养4
‑
6d，去除哈茨木霉分生孢子后，获得哈茨木霉菌的液体种子；将侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株接种到活化培养基，在28
‑
32℃、180
‑
200r/min的条件下培养46
‑
50h，获得侧孢短芽孢杆菌的液体种
子。
17.进一步地，步骤s3中，固态发酵培养基中的固体基质包括以下重量份数的原料：麸皮360
‑
440g/kg、稻壳粉180
‑
220g/kg、玉米粉180
‑
220g/kg、豆粕180
‑
220g/kg、麦芽糖9
‑
11g/kg、胰蛋白胨18
‑
22g/kg和mgso413.5
‑
16.5g/kg。
18.进一步地，步骤s3中，枯草芽孢杆菌液体种子的接入量为5
‑
10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1，发酵温度为35
‑
40℃，发酵时间为48
‑
72h；
19.淡紫拟青霉菌液体种子的接入量为5
‑
10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为20
‑
30℃，发酵时间为6
‑
9d。
20.进一步地，步骤s3中，哈茨木霉菌液体种子的接入量为5
‑
10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.05，发酵温度为25
‑
28℃，发酵时间为13
‑
15d；
21.侧孢短芽孢杆菌液体种子的接入量为5
‑
10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为25
‑
35℃，发酵时间为30
‑
40h。
22.本技术分别对枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌进行发酵培养，通过控制不同菌种的发酵温度、发酵时间，以及固体发酵培养基中固体基质和水的质量比，使菌种能够在适宜环境下生长，不容易受污染，从而获得一定数量和高质量的纯菌种，使复合微生物菌剂对真菌病害具有更优异的拮抗作用。
23.进一步地，步骤s4中，恒温干燥的温度为38
‑
42℃，枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末的含水量均小于10％。含水量较高时会使马铃薯根际土壤中病原菌大量繁殖，降低复合微生物菌剂的拮抗作用，本技术通过控制枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末的含水量，能够避免马铃薯根际土壤中病原菌大量繁殖的情况出现。
24.进一步地，步骤s5中，复合微生物菌剂的活菌数大于1
×
10
10
cfu/g。本技术制备的复合微生物菌剂使用安全方便，无毒无害，无腐蚀性，对人畜动植物无危害，不污染环境，具有生态安全性，且制备的复合微生物菌剂为固态粉末，成本低、便于运输和使用。
25.复合微生物菌剂的使用方法：在播种前1
‑
2天将发芽的马铃薯切块，采用复合微生物菌剂对薯块进行拌种处理，将拌种后的薯块施入土壤中，在花期或花期后分别在叶片及马铃薯块茎接地部位喷施复合微生物菌剂。
26.本发明的有益效果：
27.(1)本发明复合微生物菌剂适应性强、稳定性好，有利于微生物在马铃薯根部的定殖和活性保持，对马铃薯根际土壤中的真菌病害有较强的拮抗作用，通过促进马铃薯根际有益细菌的富集，使马铃薯根际土壤由“真菌型”向“细菌型”转变，从而降低真菌病害的发生率，抑制马铃薯疮痂病的发生，提高马铃薯的品质，同时，本发明复合微生物菌剂能够增强马铃薯根系的吸收作用和固定作用，为马铃薯植株生长提供丰富的营养物质，能够替代部分氮肥起到改良土壤、提高土壤肥力等作用，促进马铃薯植株的生长发育，提高马铃薯的产量。
28.(2)本发明枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌易分离培养，代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快，稳定性好，可作为生防菌大量生产和应用。
29.(3)本发明复合微生物菌剂使用安全方便、无毒无害、无腐蚀性、对人畜动植物无
危害、不污染环境，具有生态安全性，且本技术复合微生物菌剂为固态粉末，成本低、容易运输、方便使用。
30.(4)本发明复合微生物菌剂对播种前的薯块进行拌种处理，能够杀灭薯块携带的菌源，避免外部传染，并在花期或花期后分别在叶片及马铃薯块茎接地部位喷施复合微生物菌剂，使复合微生物菌剂对土壤中的真菌病害起到拮抗作用，起到增产、提质的作用。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
33.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂，包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌15g、淡紫拟青霉菌20g哈茨木霉菌7g、侧孢短芽孢杆菌10g和葡萄糖48g。
36.上述复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
37.s1.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种接种到固体培养基中进行筛选和纯化，枯草芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，淡紫拟青霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，哈茨木霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，侧孢短芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，对纯化后的菌种进行培养分离得到枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的单菌落，对单菌落进行再次培养，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株；
38.s2.将枯草芽孢杆菌的纯化菌株接种至活化培养基，在35℃、180r/min的条件下培养46h，获得枯草芽孢杆菌的液体种子；将淡紫拟青霉菌的纯化菌株接种至活化培养基，在26℃、180r/min的条件下培养46h，获得淡紫拟青霉菌的液体种子；将哈茨木霉菌的纯化菌株接种到pda斜面培养基，室温培养4d，清洗去除哈茨木霉分生孢子后，获得哈茨木霉菌的液体种子；将侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株接种到活化培养基，在28℃、180r/min的条件下培养46h，获得侧孢短芽孢杆菌的液体种子；
39.s3.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的液体种子接种到固态发酵培养基中进行发酵，枯草芽孢杆菌液体种子的接入量为8％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1，发酵温度为37℃，发酵时间为60h，获得枯草芽孢杆菌的菌种发酵液；淡紫拟青霉菌液体种子的接入量为10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为20℃，发酵时间为9d，获得淡紫拟青霉菌的菌种发酵液；哈茨
木霉菌液体种子的接入量为7％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.05，发酵温度为28℃，发酵时间为13d，获得哈茨木霉菌的菌种发酵液；侧孢短芽孢杆菌液体种子的接入量为8％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为30℃，发酵时间为35h，获得侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液；
40.其中，固态发酵培养基中的固体基质包括以下重量份数的原料：麸皮360g/kg、稻壳粉180g/kg、玉米粉180g/kg、豆粕180g/kg、麦芽糖9g/kg、胰蛋白胨18g/kg和mgso
4 13.5g/kg；
41.s4.将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液在38℃下恒温干燥后研磨成粉末，获得枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末，枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末的含水量均小于10％；
42.s5.将枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末、侧孢短芽孢杆菌粉末和葡萄糖均匀混合，获得复合微生物菌剂，复合微生物菌剂的活菌数大于1
×
10
10
cfu/g。
43.实施例2
44.一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂，包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌5g、淡紫拟青霉菌10g、哈茨木霉菌15g、侧孢短芽孢杆菌20g和葡萄糖50g。
45.上述复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
46.s1.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种接种到固体培养基中进行筛选和纯化，枯草芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，淡紫拟青霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，哈茨木霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，侧孢短芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，对纯化后的菌种进行培养分离得到枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的单菌落，对单菌落进行再次培养，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株；
47.s2.将枯草芽孢杆菌的纯化菌株接种至活化培养基，在38℃、190r/min的条件下培养48h，获得枯草芽孢杆菌的液体种子；将淡紫拟青霉菌的纯化菌株接种至活化培养基，在28℃、190r/min的条件下培养48h，获得淡紫拟青霉菌的液体种子；将哈茨木霉菌的纯化菌株接种到pda斜面培养基，室温培养5d，清洗去除哈茨木霉分生孢子后，获得哈茨木霉菌的液体种子；将侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株接种到活化培养基，在30℃、190r/min的条件下培养48h，获得侧孢短芽孢杆菌的液体种子；
48.s3.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的液体种子接种到固态发酵培养基中进行发酵，枯草芽孢杆菌菌种的接入量为7％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1，发酵温度为40℃，发酵时间为48h，获得枯草芽孢杆菌的菌种发酵液；淡紫拟青霉菌菌种的接入量为7％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为30℃，发酵时间为6d，获得淡紫拟青霉菌的菌种发酵液；哈茨木霉菌菌种的接入量为8％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.05，发酵温度为27℃，发酵时间为14d，获得哈茨木霉菌的菌种发酵液；侧孢短芽孢杆菌菌种的接入量为10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为25℃，发酵时间为40h，获得侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液；
49.其中，固态发酵培养基中的固体基质包括以下重量份数的原料：麸皮400g/kg、稻壳粉200g/kg、玉米粉200g/kg、豆粕200g/kg、麦芽糖10g/kg、胰蛋白胨20g/kg和mgso
4 15g/kg；
50.s4.将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液在40℃下恒温干燥后研磨成粉末，获得枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末，枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末的含水量均小于10％；
51.s5.将枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末、侧孢短芽孢杆菌粉末和葡萄糖均匀混合，获得复合微生物菌剂，复合微生物菌剂的活菌数大于1
×
10
10
cfu/g。
52.实施例3
53.一种预防马铃薯疮痂病的复合微生物菌剂，包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌10g、淡紫拟青霉菌13g、哈茨木霉菌20g、侧孢短芽孢杆菌5g和葡萄糖52g。
54.上述复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
55.s1.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种接种到固体培养基中进行筛选和纯化，枯草芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，淡紫拟青霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，哈茨木霉菌的活菌数为5
×
109cfu/g，侧孢短芽孢杆菌的活菌数为1
×
10
10
cfu/g，对纯化后的菌种进行培养分离得到枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的单菌落，对单菌落进行再次培养，获得枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株；
56.s2.将枯草芽孢杆菌的纯化菌株接种至活化培养基，在40℃、200r/min的条件下培养50h，获得枯草芽孢杆菌的液体种子；将淡紫拟青霉菌的纯化菌株接种至活化培养基，在30℃、200r/min的条件下培养50h，获得淡紫拟青霉菌的液体种子；将哈茨木霉菌的纯化菌株接种到pda斜面培养基，室温培养6d，清洗去除哈茨木霉分生孢子后，获得哈茨木霉菌的液体种子；将侧孢短芽孢杆菌的纯化菌株接种到活化培养基，在32℃、200r/min的条件下培养50h，获得侧孢短芽孢杆菌的液体种子；
57.s3.分别将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的液体种子接种到固态发酵培养基中进行发酵，枯草芽孢杆菌菌种的接入量为7％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1，发酵温度为40℃，发酵时间为48h，获得枯草芽孢杆菌的菌种发酵液；淡紫拟青霉菌菌种的接入量为8％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为25℃，发酵时间为8d，获得淡紫拟青霉菌的菌种发酵液；哈茨木霉菌菌种的接入量为10％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.05，发酵温度为25℃，发酵时间为15d，获得哈茨木霉菌的菌种发酵液；侧孢短芽孢杆菌菌种的接入量为7％，固体发酵培养基中固体基质与水的质量比为1:1.1，发酵温度为35℃，发酵时间为30h，获得侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液；
58.其中，固态发酵培养基中的固体基质包括以下重量份数的原料：麸皮440g/kg、稻壳粉220g/kg、玉米粉220g/kg、豆粕220g/kg、麦芽糖11g/kg、胰蛋白胨22g/kg和mgso
4 16.5g/kg；
59.s4.将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌的菌种发酵液
在42℃下恒温干燥后研磨成粉末，获得枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末，枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末和侧孢短芽孢杆菌粉末的含水量均小于10％；
60.s5.将枯草芽孢杆菌粉末、淡紫拟青霉菌粉末、哈茨木霉菌粉末、侧孢短芽孢杆菌粉末和葡萄糖均匀混合，获得复合微生物菌剂，复合微生物菌剂的活菌数大于1
×
10
10
cfu/g。
61.对比例1
62.一种复合微生物菌剂，其原料与制备方法与实施例2基本相同，唯一不同之处在于，包括以下重量份数的原料：淡紫拟青霉菌13g、哈茨木霉菌17g、侧孢短芽孢杆菌20g和葡萄糖50g。
63.对比例2
64.一种复合微生物菌剂，其原料与制备方法与实施例2基本相同，唯一不同之处在于，包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌10g、淡紫拟青霉菌15g、侧孢短芽孢杆菌25g和葡萄糖50g。
65.对比例3
66.一种复合微生物菌剂，其原料与制备方法与实施例2基本相同，唯一不同之处在于，采用胶冻样芽孢杆菌代替淡紫拟青霉菌。
67.对比例4
68.一种复合微生物菌剂，其原料与制备方法与实施例2基本相同，唯一不同之处在于，采用巨大芽孢杆菌代替侧孢短芽孢杆菌。
69.测试例
70.1.菌株间的拮抗作用
71.拮抗作用是微生物界的普遍现象，一般是指一类微生物抑制或杀死它类微生物的作用。本技术采用琼脂平板的抑菌圈实验对选取的菌株两两进行拮抗实验，拮抗结果如表1所示。
72.表1
73.菌种枯草芽孢杆菌淡紫拟青霉菌哈茨木霉菌侧孢短芽孢杆菌枯草芽孢杆菌
‑‑‑‑
淡紫拟青霉菌
‑‑‑‑
哈茨木霉菌
‑‑‑‑
侧孢短芽孢杆菌
‑‑‑‑
74.注：
“‑”
表示无拮抗作用。
75.由表1可知，枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌之间均无拮抗作用，各菌株之间不会相互抑制，可将枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌协同使用预防农作物病虫害，提高农作物的产量，
76.2.复合微生物菌剂的效果评价
77.分别对实施例1
‑
3和对比例1
‑
4制备的复合微生物菌剂进行效果评价。
78.具体测试过程如下：
79.(1)供试土壤：该试验于2020年5
‑
9月在甘肃省张掖市甘州区沙井镇沙井村采用露
地栽培的方式进行，土壤类型为灰灌漠土，肥力中上等，地力均匀，土地长5m、宽4m，面积为20m2；供试土壤基础养分为：有机质2.4％、氮1.07g/kg，速效磷(p2o5)9.87mg/kg，速效钾(k2o)117.48mg/kg；前期作物情况：马铃薯，40％感染疮痂病，供试作物马铃薯。
80.(2)处理组：
81.处理组1：常规施肥；
82.处理组2：常规施肥 对比例1制备的复合微生物菌剂；
83.处理组3：常规施肥 对比例2制备的复合微生物菌剂；
84.处理组4：常规施肥 对比例3制备的复合微生物菌剂；
85.处理组5：常规施肥 对比例4制备的复合微生物菌剂；
86.处理组6：常规施肥 实施例1制备的复合微生物菌剂；
87.处理组7：常规施肥 实施例2制备的复合微生物菌剂；
88.处理组8：常规施肥 实施例3制备的复合微生物菌剂；
89.每个处理组设三个重复，随机区组排列，以处理组1为空白对照组。
90.(3)操作方法：处理组2
‑
8：在播种前1
‑
2天将发芽的马铃薯切块，分别采用实施例1
‑
3和对比例1
‑
4制备的复合微生物菌剂对薯块进行拌种，拌种后于5月22日播种，苗高12
‑
15cm时开始间苗、定苗，使马铃薯株行距为14cm
×
18cm，并进行第一次中耕，疏松土壤，6月26日进行第二次中耕，清除杂草，7月13日进行第三次中耕，培土，在花期和花期后分别在叶片及马铃薯块茎接地部位喷施复合微生物菌剂。整个生长周期共浇三次水，追施尿素(46％)3次，每次施用尿素75kg/hm2。
91.处理组1：常规施肥采用的是播前基肥发酵腐熟牛粪12000kg/hm2、商品复合肥(17
‑
13
‑
14)600kg/hm2、磷酸二铵(18
‑
46
‑
0)300kg/hm2。
92.试验区域采取分别起垄的方式将各个区域隔离分开，在浇水过程中严格按照试验要求分别处理，确保试验区域相互之间不干扰。
93.(4)复合微生物菌剂对马铃薯生育时期的影响
94.测试结果如表2所示。
95.表2
[0096][0097]
注：表中数据均为播种后三次重复的平均数。
[0098]
由表2可知，与处理1相比，处理组2
‑
8的出苗期依次提前2d、3d、4d、4d、5d、5d、5d，成熟期依次提前6d、9d、11d、11d、15d、15d、15d，此外，处理组2
‑
8马铃薯疮痂病的发生率明显降低，表明复合微生物菌剂能够减轻病害发生，有效降低预防疮痂病的发生率，其中，处理组6
‑
8中马铃薯出苗和成熟最早，且均未发现疮痂病，表明枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌协同使用时，复合微生物菌剂对土壤中马铃薯疮痂病病原菌的拮抗作用最强，对马铃薯疮痂病的预防效果最好。
[0099]
(5)复合微生物菌剂对马铃薯产量的影响
[0100]
测试结果如表3所示。
[0101]
表3
[0102][0103][0104]
注：表中数据均为播种后三次重复的平均数。
[0105]
由表3可知，处理组2
‑
8的出苗率和株高均高于处理组1，马铃薯的产量也明显提高，增产率在9.8
‑
44.4％之间，表明复合微生物菌剂能够促进马铃薯幼苗的生长，提高马铃薯的产量，其中，处理组6
‑
8中马铃薯的出苗率、株高和增产率明显高于处理组2
‑
5，表明枯
草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌协同作用时能够更高效低刺激马铃薯幼苗的生长，增产效果更好。
[0106]
(6)复合微生物菌剂对根际土壤中微生物的影响
[0107]
分别在不同处理区的马铃薯植株根部表土下10cm处取土壤样品稀释至10
‑6，分别在细菌、真菌、放线菌培养基平板中加入100μl稀释液，用无菌涂棒涂布均匀，室温静置5
‑
10min，使菌液吸附培养基，然后放入恒温箱中过夜培养，计算每克土壤中的细菌、真菌和放线菌数量，测试结果如表4所示。
[0108]
表4
[0109]
处理组细菌105cfu/g真菌103cfu/g放线菌105cfu/g16.6423.244.21214.3511.274.03316.4610.643.92416.519.423.87517.858.133.42619.343.572.13720.014.022.09819.523.692.10
[0110]
注：表中数据均为播种后三次重复的平均数。
[0111]
由表4可知，处理组2
‑
8马铃薯根际土壤中细菌数量均高于处理组1，真菌数量均低于处理组1，表明复合微生物菌剂能够提高马铃薯根际土壤中的细菌数量，降低真菌数量，使马铃薯根际土壤由“真菌型”向“细菌型”转变，从而降低真菌病害的发生，其中，处理组6
‑
8马铃薯根际土壤中细菌数量均高于处理组2
‑
5，真菌数量均低于处理组2
‑
5，表明枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌、哈茨木霉菌和侧孢短芽孢杆菌共同作用时，能够加快真菌的转化，提高真菌的转化数量，对真菌病害的抑制效果更好。
[0112]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。