一种协同增效的刺参用复合免疫增强剂的制备方法与流程

1.本发明涉及一种协同增效的刺参用复合免疫增强剂，具体涉及一种中草药、地衣芽孢杆菌与矿物质元素葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜配伍的免疫增强剂及其制备方法与使用技术，属于棘皮动物免疫学技术领域。


背景技术：

2.刺参(apostichopus japonicus)属于棘皮动物门、海参纲，富含蛋白质、矿物质、维生素等多种天然活性物质，具有极高的营养和药用价值。随着刺参养殖规模的不断扩大以及集约化养殖方式下的不规范运作，刺参养殖过程中相继出现了种质退化、病害频发及成本增加等问题，严重阻碍了刺参养殖业的健康发展。刺参属于无脊椎棘皮动物，缺乏特异性免疫系统，主要依赖天然免疫机制对进入机体的异物进行识别、排除。刺参饲料的质量直接影响养殖刺参的健康和养殖环境质量，合理配伍的饲料添加剂可通过改善肠道健康、提高生长指数、增强抗病能力来大幅度提高刺参的非特异性免疫机能，从而提高刺参的养殖效益。抗生素类药物由于细菌抗药性、食品和环境安全等问题在刺参养殖上存在很大的局限性。目前市面上刺参用免疫增强剂产品质量良莠不齐，缺乏行业规范与管理。因此，寻找绿色无公害、营养丰富的刺参用免疫增强剂势在必行。
3.cn200910017176.7提供一种刺参腐皮综合征的抗菌免疫双效复方中草药，药物成分为穿心莲、大青叶、金银花和川芎；药物按重量配比为2∶1∶3∶2；药物呈粉末状，粒度200目。以口服方式防治刺参腐皮综合征，本发明是刺参腐皮综合征的专用药物，幼参期和成参期均可使用，在腐皮综合征高发期其预防效果良好；对患病刺参2～3周内的治愈率达到80～90％，存活率达85％以上。该复方中草药具有免疫、抗病双效作用，无毒副作用，使用方法简便，可减少或替代抗生素使用，适用于幼参培育和养殖生产疾病控制。
4.cn200810012641.3公开一种治疗刺参细菌性化皮病的复方中草药制剂，其药物成分及重量百分比为：乌梅80～90％，五倍子10～20％。水煎煮后用于化皮刺参的药浴或全池泼洒，在刺参体内无残留；添加量小，使用方便；组成简单，所用原料来源稳定，价格低廉，生产工艺简单。
5.cn201210206056.3公开一种刺参中草药复合免疫增强剂，其特征在于：包括如下组分：党参、茯苓、五味子、穿心莲、双花；刺参中草药复合免疫增强剂所有组份均为中药，杀菌、驱虫和抗病毒作用强，无毒、无副作用、无污染，成本低，制备容易，刺参为棘皮动物，属于无脊椎动物，免疫反应主要以非特异性免疫为主。
6.目前，市售的刺参用免疫增强剂大多是在饲料中单一添加益生菌制剂、中草药或者矿物质元素，制备及应用方式比较单一。首先，现有技术使用中草药的有效成分如淀粉、果胶、蛋白酶等成分含有葡萄糖苷类化合物，在刺参肠内难以吸收，生物利用度低。而且，中草药中的大分子物质的活性物质溶出率低，不利于机体吸收。而部分中草药的毒性成分也直接影响刺参的养殖效果。其次，地衣芽孢杆菌的生长需要专一性底物以提高其存活率，而刺参肠道内环境不适合地衣芽孢杆菌的有效增殖，生物利用率较低。再次，刺参养殖中免疫
增强剂的使用必须保证无污染、无残留、无抗药性、无毒副作用，而矿物质元素的铜、铁无机盐具有生物学毒性，对刺参的生长指标及免疫能力均有一定的负面影响。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种中草药、地衣芽孢杆菌与矿物质元素联合应用的刺参用复合免疫增强剂。该复合免疫增强剂各组分共同作用、协同增效，可以通过提高生长指数、增强相关酶活性、降低发病率、改善肠道健康等方面来综合提升刺参的非特异性免疫机能。
8.本发明的技术解决方案是：
9.一种协同增效的刺参用复合免疫增强剂，其中复合中草药、地衣芽孢杆菌、葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜在单位重量饲料中的添加浓度如下：复合中草药40～60mg/g；地衣芽孢杆菌106～108cfu/g；葡萄糖酸亚铁0.5～1.5mg/g；葡萄糖酸铜0.2～0.8mg/g。
10.进一步，各组分在单位重量饲料中的优选添加浓度为：复合中草药50mg/g；地衣芽孢杆菌107cfu/g；葡萄糖酸亚铁0.8mg/g；葡萄糖酸铜0.4mg/g。
11.进一步，按质量份，本复合免疫增强剂中各味中草药的质量百分比组成如下：黄芩15～25份；黄柏10～20份；当归15～25份；大黄10～25份；大青叶5～10份；甘草5～15份；红景天15～25份；明日草10～20份。
12.进一步，所述复合免疫增强剂疫包括中草药黄芩、黄柏、当归、大黄、大青叶、甘草、红景天、明日草中的五种及以上。
13.为了实现上述发明目的，本发明提供了上述复合免疫增强剂的制备方法。其中，所述制备方法为：
14.(1)按照重量百分比称取各味中草药，采用中药粉碎机分别对各组分进行粗粉碎；
15.(2)将粗粉碎后的各种中草药原料依次投入混合机内，混合均匀，放入超微粉碎机粉碎，备用；
16.(3)将超低温冰箱冻存的地衣芽孢杆菌活化并重悬；
17.(4)将活化后的地衣芽孢杆菌菌悬液以5～8％的接种比例加入到msb液体培养基中，28～35℃、140～180rpm振荡培养；
18.(5)将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后，离心弃上清，用无菌海水重悬菌液，采用比浊法调整菌液浓度，备用；
19.(6)将处理后的中草药、地衣芽孢杆菌与矿物质元素葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜按比例添加到刺参饲料中，混合均匀。
20.所述步骤(1)中，粉碎粒度为50～100目。所述步骤(2)中，粉碎粒度为200～400目。
21.为了实现上述发明目的，本发明又提供了上述复合免疫增强剂的应用方法。其中，所述应用方法为：
22.(1)刺参单体质量3～10g，饲料日投量为刺参体质量的4～8％。将复合中草药、地衣芽孢杆菌与葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜按比例添加到饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。
23.(2)每日投喂1次，投喂时间为下午16:00～18:00，期间保持充气，定期换水，海水温度15～20℃，ph7.8～8.1，盐度29～32。溶解氧不低于5mg/l，氨氮不高于0.5mg/l。
24.技术方案机理为：
25.本发明中，地衣芽孢杆菌产生的有机酸，如柠檬酸参与三羧酸循环和atp的生成与转化。反应机理见下式：
[0026][0027]
有机酸在改善消化道环境的同时可以分别与葡萄糖酸亚铁中的fe
2
和葡萄糖酸铜中的cu
2
结合形成易于吸收的生物效价较高的络合产物。
[0028]
本发明中，黄芩、黄柏、大黄、大青叶含有黄酮、大黄酸和生物碱类物质，可以有效抑制条件致病菌生长，同时提高机体抵抗病毒和内毒素侵染的能力，增强机体的屏障防御能力。当归、甘草、明日草、红景天富含多种维生素、矿物质和良质氨基酸，能有效参与养分代谢，促进养分消化和肠道益生菌的增殖，可有效提高机体相关酶活性及抗氧化能力，具有免疫调节功能。地衣芽孢杆菌易于在机体内定植生长，其表面抗原或代谢物担当免疫原不断刺激机体的免疫防御系统，增强机体的非特异性免疫能力。地衣芽孢杆菌可以产生多种消化酶和生长因子，促进营养成分降解，辅助机体营养代谢。地衣芽孢杆菌还可以通过营养竞争、空间竞争等方式抑制部分致病菌的增殖，而对乳酸菌等有益菌有促进和共生作用。铁是细胞色素系统和过氧化氢酶、过氧化物酶的组成成分，在呼吸及生物氧化过程中起重要作用。铁的缺乏会影响蛋白质的合成及能量的利用，引起无机盐和维生素紊乱等现象。铜是与能量代谢和铁代谢有关的金属酶的重要组成部分，是构成细胞色素氧化酶、超氧物歧化酶、过氧化氢酶等的活性因子，它能改善机体组织细胞生物氧化功能和代谢功能。同时，铜还可以促进铁质在机体内的利用。
[0029]
本发明相对于现有技术有如下优点及效果：
[0030]
(1)本复合免疫增强剂的各成分之间具有协同增效作用。本发明应用的复合中草药、地衣芽孢杆菌、矿物质元素并非简单机械地组合，而是经过科学选择、合理配伍的联合应用。各个组分相辅相成、互为促进，具有显著的协同效应。本复合免疫增强剂无发霉、变质、腐败等现象，添加到饲料中的吸附性和稳定性好，沉降速度快，溃散性和溶失性较低，有利于提高饲料利用率，适合刺参底栖舔食的摄食习性。
[0031]
(2)中草药的有效成分含有葡萄糖苷类化合物，在刺参肠内难以吸收，生物利用度低。而地衣芽孢杆菌在新陈代谢过程中产生的α
‑
糖苷酶和β
‑
糖苷酶是中草药代谢反应中最重要的配糖体水解酶。这些外源消化酶可以有效激活刺参自身的消化酶活性，同时使中草
药的细胞壁降解，去除淀粉、果胶、蛋白酶等成分，将中草药中的大分子物质分解为更容易吸收的活性肽、氨基酸等小分子物质，提高生物活性物质溶出率，使中草药的有效成分最大限度地释放，有利于机体吸收。
[0032]
(3)地衣芽孢杆菌产生的外源消化酶具有氧化、甲基化、酯化、还原等多种生物功能，可以催化不同底物，将部分中草药的毒性成分转化为药理活性物质，从而降低中草药的毒副作用。反过来，中草药可以为地衣芽孢杆菌提供生长所需要的专一性底物，提高其存活率。而且，中草药中含有蛋白质、微量元素、维生素等多种营养成分及生物活性成分，可以为地衣芽孢杆菌的生长繁殖、新陈代谢提供营养物质，同时能增加肠道益生菌的种类和数量，抑制有害菌的生长和增殖，维持机体的微生态平衡。
[0033]
(4)葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜为葡萄糖酸衍生物，属于有机酸盐类，可溶性强、毒副作用小、生物利用率高。葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜作为酶催化的辅因子直接参与机体内免疫和代谢相关酶活力的维持和调节，可以有效降低肠道的ph值，营造更有助于地衣芽孢杆菌快速增殖的酸性环境，提高生物利用率，有效促进刺参对葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜的吸收。
[0034]
(5)本发明将复合中草药、地衣芽孢杆菌与葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜联合应用于刺参养殖过程中，在保证无污染、无残留、无抗药性、无毒副作用的前提下，有效提高了刺参的免疫机能，对提升养殖效果、增加经济效益具有重要意义。
附图说明
[0035]
图1复合免疫增强剂对刺参酸性磷酸酶活力的影响；
[0036]
图2复合免疫增强剂对刺参碱性磷酸酶活力的影响；
[0037]
图3复合免疫增强剂对刺参超氧化物歧化酶活力的影响；
[0038]
图4复合免疫增强剂对刺参溶菌酶活力的影响；
[0039]
图5复合免疫增强剂对刺参淀粉酶活力的影响；
[0040]
图6复合免疫增强剂对刺参脂肪酶活力的影响；
[0041]
图7复合免疫增强剂对刺参肠道菌群丰富度和多样性的影响，图a为刺参肠道菌群丰富度指数，图b为刺参肠道菌群多样性指数；
[0042]
图8复合免疫增强剂对攻毒刺参累积死亡率的影响；
[0043]
图9复合免疫增强剂对攻毒刺参发病情况的影响；
[0044]
图10复合免疫增强剂对攻毒刺参灿烂弧菌的抑制作用。
具体实施方式
[0045]
下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。
[0046]
以下各实施例中刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心，刺参单体质量5.65
±
0.74g，暂养于四个相同规格水族箱中(100cm
×
80cm
×
75cm)，每箱50头。水族箱分别编号a、b、c、d。刺参暂养一周后添加复合免疫增强剂。
[0047]
实施例1：
[0048]
按以下重量称取各中草药，其中黄芩15g，黄柏10g，当归15g，大黄10g，大青叶5g，甘草5g，红景天15g，明日草10g。采用中药粉碎机分别对各组分进行粗粉碎，粉碎粒度为50目，将粗粉碎后的中草药原料依次投入混合机内，混合均匀，放入超微粉碎机粉碎，粉碎粒度为200目。将
‑
80℃冰箱冻存的地衣芽孢杆菌活化并重悬，将活化后的地衣芽孢杆菌菌悬液以5％的接种比例加入到msb液体培养基中，28℃、140rpm振荡培养。将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后，离心弃上清，用无菌海水重悬菌液，采用比浊法调整菌液浓度。将处理后的中草药、地衣芽孢杆菌与葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜按比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。单位重量饲料中各组分的添加浓度如下：复合中草药40mg/g；地衣芽孢杆菌106cfu/g；葡萄糖酸亚铁0.5mg/g；葡萄糖酸铜0.2mg/g。
[0049]
按刺参体质量的4％投喂饲料到水槽a。水槽d用作对照例，不添加免疫增强剂。饲养实验持续30天，共设3组平行，每个处理3次重复。期间每日投喂1次，投喂时间为下午16:30，饲养期间保持充气，每2天换水一次，海水温度15℃，ph7.8，盐度29。溶解氧不低于5mg/l，氨氮不高于0.5mg/l。
[0050]
在饲养实验开始和结束时测定刺参体质量，参照以下公式计算刺参质量增加率和特定生长率：
[0051]
质量增加率(wgr)＝100
×
(w
t
‑
w0)/w0[0052]
特定生长率(sgr)＝100
×
(lnw
t
‑
lnw0)/t
[0053]
其中w0和w
t
分别表示刺参初始体质量和终末体质量，t为实验天数。
[0054]
在饲养实验结束后用无菌离心管收集刺参肠道内容物用于肠道菌群的高通量测序。在添加免疫增强剂后第0天、10天、20天、30天分别在各水族箱随机选取3只刺参，剖开腹腔获得体腔液及肠组织。将刺参体腔液合并，4℃、3500r/min离心10min，取上清液用于测定免疫酶活性。将刺参肠组织合并，用磷酸缓冲液(ph7.5)冲洗后用滤纸吸干，以10倍磷酸缓冲液匀浆。匀浆液于4℃、3000r/min离心20min，上清液用于测定消化酶活性。采用南京建成科技有限公司测试盒测定刺参免疫酶及消化酶活性。酸性磷酸酶活力和碱性磷酸酶活力采用磷酸苯二钠法测定，超氧化物歧化酶活力采用wst
‑
1法测定，溶菌酶活力采用比浊法测定，淀粉酶活力采用碘—淀粉比色法测定，脂肪酶活力采用甲基试卤灵底物法测定，具体测定步骤按照试剂盒说明书进行。酶活检测实验重复3次，酶活力大小以比活力的形式表示，单位为u/mg蛋白。
[0055]
在30天饲养实验结束后，用灿烂弧菌对刺参进行攻毒实验。通过预试验确定灿烂弧菌对刺参的半致死浓度为2
×
107cfu/ml。攻毒实验设3组平行，每组取25头刺参，灿烂弧菌注射剂量为0.1ml/头，记录攻毒后15天内刺参的弧菌发病情况及累积死亡率。攻毒实验结束后，每组随机取3头刺参，解剖获得肠组织，用30mlpbs缓冲液匀浆处理10min。用无菌生理盐水将肠组织匀浆液稀释10倍，取0.05ml稀释液涂布至tcbs弧菌选择性培养基，28℃倒置培养，2天后统计刺参肠道弧菌数目。
[0056]
数据用spss19.0软件进行单因素方差分析(one
‑
wayanova)以及duncan多重比较法，结果以平均值
±
标准差(x
±
sd)表示，当p<0.05时认为差异显著，以不同小写字母表示。肠道菌群所有研究结果均使用r平台的“ggplot2”包进行可视化分析。
[0057]
实施例2：
[0058]
按以下重量称取各中草药，其中黄芩17g，黄柏13g，当归18g，大黄15g，大青叶7g，
甘草10g，红景天17g，明日草15g。采用中药粉碎机分别对各组分进行粗粉碎，粉碎粒度为60目，将粗粉碎后的中草药原料依次投入混合机内，混合均匀，放入超微粉碎机粉碎，粉碎粒度为300目。将
‑
80℃冰箱冻存的地衣芽孢杆菌活化并重悬，将活化后的地衣芽孢杆菌菌悬液以6％的接种比例加入到msb液体培养基中，31℃、160rpm振荡培养。将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后，离心弃上清，用无菌海水重悬菌液，采用比浊法调整菌液浓度。将处理后的中草药、地衣芽孢杆菌与葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜按比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。单位重量饲料中各组分的添加浓度如下：复合中草药50mg/g；地衣芽孢杆菌108cfu/g；葡萄糖酸亚铁1mg/g；葡萄糖酸铜0.4mg/g。
[0059]
按刺参体质量的5％投喂饲料到水槽b。水槽d用作对照例，不添加免疫增强剂。饲养实验持续30天，共设3组平行，每个处理3次重复。期间每日投喂1次，投喂时间为下午16:30，饲养期间保持充气，每2天换水一次，海水温度18℃，ph8.0，盐度30。溶解氧不低于5mg/l，氨氮不高于0.5mg/l。酶活检测、攻毒实验等操作同实施例1。
[0060]
实施例3：
[0061]
按以下重量称取各中草药，其中黄芩25g，黄柏20g，当归25g，大黄25g，大青叶10g，甘草15g，红景天25g，明日草20g。采用中药粉碎机分别对各组分进行粗粉碎，粉碎粒度为100目，将粗粉碎后的中草药原料依次投入混合机内，混合均匀，放入超微粉碎机粉碎，粉碎粒度为400目。将
‑
80℃冰箱冻存的地衣芽孢杆菌活化并重悬，将活化后的地衣芽孢杆菌菌悬液以8％的接种比例加入到msb液体培养基中，35℃、180rpm振荡培养。将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后，离心弃上清，用无菌海水重悬菌液，采用比浊法调整菌液浓度。将处理后的中草药、地衣芽孢杆菌与葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸铜按比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。单位重量饲料中各组分的添加浓度如下：复合中草药60mg/g；地衣芽孢杆菌107cfu/g；葡萄糖酸亚铁1.5mg/g；葡萄糖酸铜0.8mg/g。
[0062]
按刺参体质量的8％投喂饲料到水槽c。水槽d用作对照例，不添加免疫增强剂。饲养实验持续30天，共设3组平行，每个处理3次重复。期间每日投喂1次，投喂时间为下午16:30，饲养期间保持充气，每2天换水一次，海水温度20℃，ph8.1，盐度32。溶解氧不低于5mg/l，氨氮不高于0.5mg/l。酶活检测、攻毒实验等操作同实施例1。
[0063]
结果分析：实施例1、2、3对刺参质量增加率和特定生长率的影响如表1所示，饲料中添加复合免疫增强剂的刺参的质量增加率和特定生长率明显高于对照例，其中实施例3刺参的质量增加率和特定生长率相对最高。这表明本复合免疫增强剂可以加强刺参对营养物质的吸收利用，有效促进刺参生长。
[0064]
表1复合免疫增强剂对刺参质量增加率和特定生长率的影响
[0065][0066][0067]
实施例1、2、3对刺参免疫酶和消化酶活力的影响如图1～6所示，在选定的酶活指
标中，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是刺参体腔细胞内参与免疫防御活动的重要水解酶。超氧化物歧化酶可以清除机体内多余的自由基，阻断脂质过氧化作用，修复受损细胞。溶菌酶能够破坏细菌的细胞壁，消除侵入机体内的致病菌。淀粉酶和脂肪酶可以有效反映刺参对营养物质的吸收利用能力。在使用复合免疫增强剂之前，各实施例刺参酶活力与对照例相比没有显著差异。在使用复合免疫增强剂的10天、20天、30天时，各实施例刺参体腔液体中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和肠道中的淀粉酶、脂肪酶活力均显著高于对照例，其中实施例3对免疫酶和消化酶的激活效果优于实例1和实例2。表明本复合免疫增强剂可以显著提高刺参的磷酸酶响应能力及消化功能，有效抑制氧化损伤。
[0068]
实施例1、2、3对刺参肠道菌群丰富度和多样性的影响如图7所示，各实施例中刺参的肠道菌群丰富度和多样性指数明显高于对照例。相比于对照例，各实施例中刺参肠道菌群组成更平衡，菌群功能更稳定。复合免疫增强剂对刺参肠道菌群分布的影响见表2，各实施例中嗜油菌、科尔韦尔氏菌、暗棕色杆菌、亮发菌、芽孢杆菌所占比例均高于对照例，其中嗜油菌可以降解石油沉积物中的致癌物质，也可以分解鱼类尸体中的脂肪酸残渣。科尔韦尔氏菌可以在低温条件下产生胞外活性酶，降低宿主被病原菌侵染的风险。暗棕色杆菌和亮发菌属于化能有机营养型细菌，作为益生菌使用时有较强的肠道适应性和代谢活性。各实施例中芽孢杆菌所占比例均显著高于对照组，表明复合免疫增强剂中的地衣芽孢杆菌已经成功定植于刺参肠道。而水产养殖中常见的致病菌射光杆菌、假交替单胞菌、弓形杆菌在各实施例中所占的比例均明显低于对照例。表明饲料中添加复合免疫增强剂可以有效改善刺参肠道菌群结构，促进肠道有益菌生长，抑制致病菌增殖。
[0069]
表2复合免疫增强剂对刺参肠道菌群分布的影响
[0070][0071][0072]
实施例1、2、3对攻毒刺参累积死亡率的影响如图8所示，攻毒后首个死亡个体出现在对照例，而各实施例中刺参的累积死亡率均明显低于对照例。实施例1、2、3对攻毒刺参发病情况的影响如图9所示，对照例与各实施例刺参均出现不同程度的肿嘴、摇头、吐肠、化皮等症状。而各实施例刺参的表皮溃疡面积均小于对照例，对外界刺激的反应能力、相对免疫
保护率也高于对照例。复合免疫增强剂对攻毒刺参灿烂弧菌的抑制作用如图10所示，各实施例刺参肠道的灿烂弧菌数目明显少于对照例。表明本复合免疫增强剂可以抑制灿烂弧菌增殖，有效提高刺参的抗病能力。
[0073]
综合以上试验结果，本复合免疫增强剂的各组分共同作用、协同增效，可以通过提高生长指数、增强免疫酶和消化酶活性、改善肠道健康、提高抗病能力来综合提升刺参的非特异性免疫机能。
[0074]
以上实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。本领域的技术人员在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、优化等均包含在本发明的保护范围之内。