一种表达TgMIF蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法

一种表达tgmif蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及肝纤维化技术领域，具体涉及一种表达tgmif蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.肝纤维化是肝细胞损伤激活的一种保护机制，在消除病因后得以解决。但是，持续性损伤会导致肝纤维化演变为肝硬化，从而促进肝细胞癌的发展。目前仍然没有有效且特异的抗纤维化疗法。
3.巨噬细胞在肝纤维化的病理进程中发挥重要作用。以巨噬细胞为主要候选细胞的细胞疗法是治疗肝纤维化的一种新兴疗法。在ccl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，用lps和ifn
‑
γ诱导的经典活化的m1型巨噬细胞可改善肝纤维化，如公开号为cn103977029a的专利申请采用m1型巨噬细胞改善肝纤维化，但如何稳定定向调控巨噬细胞表型，以实现更精确更安全的肝纤维化治疗方法是目前研究的难点。
4.刚地弓形虫简称弓形虫，是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫。弓形虫几乎可以感染包括人类在内的所有恒温动物，引起重要的人畜共患弓形虫病。据估计，全球大约有三分之一的人慢性感染弓形虫。在弓形虫感染的固有免疫应答阶段，ii型虫株可以驱动巨噬细胞向m1极化，使其发挥胞内杀虫效应以控制感染，宿主获得强力的免疫力，从而使急性感染转为慢性/隐性感染。
5.巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,mif)由115个氨基酸组成，在物种间高度保守，具有互变异构酶和氧化还原酶活性。mif是一种具有广泛免疫调节特性的多功能蛋白质，可由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等多种细胞产生。mif可通过产生tnf
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α、il
‑
8等促炎介质参与固有免疫和适应性免疫。弓形虫mif样蛋白(tgmif)与人类的mif蛋白的同源性仅为26％，存在巨大差异，目前尚无tgmif在肝脏疾病中的研究。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种表达tgmif蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
8.一种表达tgmif蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用，所述tgmif蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.有益效果：本发明中的tgmif蛋白能够定向诱导巨噬细胞向m1偏移活化，并高表达溶解胶原的mmp9蛋白，通过缩小肝纤维化肝脏面积，减少表面颗粒度，从而为治疗肝纤维化提供细胞治疗方法。
10.优选地，所述tgmif蛋白编码的基因具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
11.优选地，编码所述tgmif蛋白的核苷酸序列的引物序列如下：上游引物：5
‘‑
ccggaattcgccaccatgcccaagtgcatgatcttttgcc
‑3’
，下游引物：5
‘‑
atttgcggccgcagccgaaagttcggtcgcccatggcc
‑3’
。
12.优选地，将tgmif蛋白编码的基因用慢病毒包装，稳定感染巨噬细胞，然后定向活化巨噬细胞，得到表达tgmif蛋白的巨噬细胞。
13.优选地，所述慢病毒为包含慢病毒质粒的293t细胞。
14.优选地，所述慢病毒包装包括以下步骤：将tgmif基因插入到plvx
‑
c
‑
flag
‑
mcmv
‑
zsgreen
‑
ires
‑
puro载体中。
15.本发明的优点在于：本发明中的tgmif蛋白能够持续定向诱导巨噬细胞向m1偏移活化，并高表达溶解胶原的mmp9蛋白，通过缩小肝纤维化肝脏体积，减少表面颗粒度，从而为治疗肝纤维化提供细胞治疗方法。
16.本发明要求保护用上述弓形虫虫源分子tgmif稳定转染的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
附图说明
17.图1为本发明实施例中载体plvx
‑
c
‑
flag
‑
mcmv
‑
zsgreen
‑
ires
‑
puro的图谱；
18.图2为本发明实施例中的荧光效率图，图中左边为荧光图，右边为白光图；
19.图3为本发明实施例中qpcr验证tgmif的表达结果图；
20.图4为本发明实施例中wb验证tgmif的表达结果图；
21.图5为本发明实施例中tgmif驱动巨噬细胞向m1方向极化结果图；
22.图中：raw264.7；稳转lv载体的raw264.7；稳定表达tgmif的raw264.7
23.图6为本发明实施例中tgmif促进巨噬细胞分泌mmp9结果图；其中a图为蛋白电泳图，b图为对细胞上清表达mmp9的统计，c图为对inos的统计，d图为对arg1的统计。图中稳转lv载体的raw264.7；稳定表达tgmif的raw264.7；稳定表达tgmif的raw264.7加dmso刺激；稳定表达tgmif的raw264.7加20μm u0126刺激；
24.图7为本发明实施例中冰冻切片显示存活时间图；dapi表示细胞核；merge为dapi图和tgmif图的合并；
25.图8为本发明实施例中肝纤维化小鼠血清学水平图；图中nc：未造模组。其余均用ccl4造模，根据尾静脉注射不同分为以下各组：pbs：注射pbs组；注射raw264.7组；注射稳转lv载体的raw264.7组；注射稳定表达tgmif的raw264.7组。
26.图9为本发明实施例中缓解肝纤维化的病理损伤图。a：造模及注射细胞的时间；b：肝脏肉眼观；c：肝纤维化病理损伤图。图中nc：未造模组。其余均用ccl4造模，根据尾静脉注射不同分为以下各组：pbs：注射pbs组；注射raw264.7组；注射
稳转lv载体的raw264.7组；注射稳定表达tgmif的raw264.7组。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
29.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
30.一、plvx
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tgmif
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3flag
‑
zsgreen
‑
puro质粒构建
31.1、弓形虫总rna的提取：从液氮中取出弓形虫和rh株和me49株，37℃迅速解冻后加入hff细胞中培养，连续传代三次后，收集弓形虫，室温4000rpm离心10min，沉淀用于总rna提取，加入trizol，根据常规rna提取方法进行。
32.2、tgmif基因的特异性扩增：以弓形虫总rna为模板，参照primescript
tm
rt master mix(perfect real time)试剂盒(takara)使用说明，特异性扩增tgmif目的基因，反应体系为：5
×
primescript rt master mix(perfect real time)2μl，总rna模板3μl，补加rnase free dh2o至10μl，逆转录反应条件为：37℃反应15min，85℃失活5s。
33.tgmif基因的特异性扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共进行3循环，最后72℃延伸10min。上游引物：5
‘‑
ccggaattcgccaccatgcccaagtgcatgatcttttgcc
‑3’
(下划线为ecori酶切位点)，下游引物：5
‘‑
atttgcggccgcagccgaaagttcggtcgcccatggcc
‑3’
(下划线为noti酶切位点)。
34.3、目的基因的连接、转化与测序：rt
‑
pcr产物经回收纯化后与质粒载体plvx
‑
c
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flag
‑
mcmv
‑
zsgreen
‑
ires
‑
puro(购买自武汉维诺赛生物技术有限公司)进行ecori和noti双酶切，如图1所示。16℃条件下连接过夜，取10ul连接产物转化于100ul jm109感受态细菌，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序引物为cmv
‑
f，其引物序列为：5
‘‑
cgcaaatgggcggtaggcgtg
‑3’
。结果命名为plvx
‑
tgmif
‑
3flag
‑
zsgreen
‑
puro质粒。
35.二、rlv
‑
tgmif
‑
3flag
‑
zsgreen
‑
puro慢病毒包装及稳转raw264.7细胞系构建
36.1、慢病毒包装
37.将慢病毒质粒plvx
‑
tgmif
‑
3flag
‑
zsgreen
‑
puro导入293t细胞，产生高滴度含目的基因的慢病毒(简称rlv
‑
tgmif
‑
3flag
‑
zsgreen
‑
puro)，具体步骤如下：
38.(1)在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293t细胞，以含10％血清的dmem培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8
×
106cells到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。
39.(2)第二天，在转染前2～4h，用5ml不含p/s的完全培养基换液(dmem 10％fbs)。然后进行转染，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
40.(3)第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液(dmem 10％fbs p/s)。
41.(4)第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基(dmem 10％fbs p/s)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱继续培养。
42.(5)第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm pvdf滤器过滤至50ml圆底离心管中。
43.(6)4℃，50000g高速离心2.5h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
44.(7)小心弃去上清，晾干，按100ul/10cm培养皿的量加入dmem(不含血清、双抗)或者pbs重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml ep管中，
‑
80℃冰箱保存。
45.2、构建稳转细胞株
46.用慢病毒来感染raw264.7细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)，筛选混合克隆细胞系，以下简称细胞具体步骤如下：
47.(1)复苏raw264.7细胞，等细胞生长至80
‑
90％细胞密度时传代细胞，连续传代2
‑
3次；
48.(2)培养raw264.7细胞，待细胞生长至80
‑
90％细胞密度时消化细胞并计数，按5
×
105cells/孔的细胞密度接种细胞到6孔板中；
49.(3)第二天按照moi＝50分别加入慢病毒rlv
‑
tgmif
‑
3flag
‑
zsgreen
‑
puro和对照慢病毒rlv
‑
zsgreen
‑
puro，37℃，5％co2培养箱中培养过夜；
50.(4)加入病毒24h后用dmem 10％fbs 1％p/s完全培养基换液；
51.(5)加入病毒48h后按照5ug/ml的终浓度分别加入puromycin做抗性筛选，每2
‑
3天换液(含5ug/ml puromycin的完全培养基)；
52.(6)待细胞生长至80
‑
90％细胞密度时消化细胞，接种到t
‑
25cm2细胞培养瓶中继续培养；
53.(7)连续传代2
‑
3代获得混合克隆稳转细胞系对照组为
54.利用荧光显微镜观察感染后的稳转细胞株，如图2所示，视野内有大量表达绿色荧光蛋白的细胞；如图3和图4所示，经过qpcr和wb验证细胞中tgmif的表达。
55.3、流式细胞术检测表型
56.用流式细胞术检测巨噬细胞表面分子f4
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80、cd206、cd86的表达，分别标记巨噬细胞标记物f4
‑
80、m2型标记物cd206、m1型标记物cd86。如图5所示，结果显示较对照组高表达m1型标记cd86，说明稳定表达tgmif的巨噬细胞向m1方向极化。如图6所示，wb检测细胞上清显示较对照组分泌较多溶解胶原的mmp9蛋白，证明分泌mmp9蛋白。
57.4、具有肝纤维化治疗作用
58.(1)用四氯化碳建立小鼠(spf级c57雄性小鼠，购自安徽医科大学实验动物中心)肝纤维化模型，经尾静脉输注细胞，荧光显微镜下观察尾静脉输注细胞后的小鼠，如图7所示，其1天、3天、5天、7天肝脏冰冻切片，均显示肝脏含有表达绿色荧光蛋白的细胞。表明细胞通过尾静脉高压输注小鼠体内后通过血液循环进入
到肝脏并且在肝脏至少存活7天。
59.(2)用生化分析仪检测肝纤维化小鼠血清ast、alt水平，如图8所示，可显著降低肝纤维化小鼠血清ast、alt水平，提示具有肝脏保护作用。如图9所示，大体解剖显示可以缩小肝纤维化肝脏体积，减少表面颗粒度。肝脏he染色、天狼星红染色和masson染色均表明，可明显减少肝纤维化面积，显示出良好的抗肝纤维化作用。
60.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护范围之内。