白皮杉醇在制备用于预防和/或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用的制作方法

mg/kg/d。
12.进一步的，所述白皮杉醇抑制单纯疱疹病毒的半数抑制浓度ic
50
小于2 μm。
13.进一步的，所述白皮杉醇通过直接与单纯疱疹病毒颗粒相互作用达到抑制单纯疱疹病毒感染的作用。
14.进一步的，所述白皮杉醇显著抑制单纯疱疹病毒蛋白表达来达到抑制单纯疱疹病毒感染的作用。
15.进一步的，所述白皮杉醇对病毒的吸附或入侵产生影响来抑制单纯疱疹病毒的感染。
16.进一步的，所述白皮杉醇能够降低实验小鼠组织中的病毒载量，显著改善小鼠感染单纯疱疹病毒后的生存状况，提高小鼠生存率。
17.本发明还提供了一种用于预防和/或治疗单纯疱疹病毒感染的药物，所述药物以白皮杉醇及其药学上可接受的盐、立体异构体、晶体或衍生物为主要活性成分。
18.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明选取白皮杉醇为研究对象，通过体内和体外实验证实了白皮杉醇对单纯疱疹病毒具有明显的作用，即天然产物白皮杉醇对hsv
‑
1和hsv
‑
2感染具有较好的抑制作用，能抑制hsv
‑
1和hsv
‑
2的病毒蛋白表达，其直接作用于病毒颗粒来干扰病毒吸附或进入过程，且能杀灭病毒降低病毒滴度阻断hsv诱导的细胞融合，进而改善单纯疱疹病毒感染小鼠身体状况，从而发挥抑制hsv病毒作用。本发明首次确定白皮杉醇具有对hsv
‑
1和hsv
‑
2的抑制作用且毒性极低。因此，白皮杉醇有可能开发成新型抗hsv药物，具有良好的市场应用前景。
附图说明
19.图1是白皮杉醇对vero、hep
‑
2及hela三种细胞毒性作用检测的结果图。
20.图2是白皮杉醇抑制hsv
‑
1空斑形成的实验结果。
21.图3是白皮杉醇不同浓度下对hsv
‑
1 的icp27蛋白表达的抑制作用结果图。
22.图4是白皮杉醇对hsv不同作用方式的空斑滴度实验结果图。
23.图5是白皮杉醇在不同作用方式下对hsv
‑
1的icp27蛋白表达抑制作用结果图。
24.图6是白皮杉醇对hsv
‑
1诱导的膜融合的抑制作用结果图。
25.图7是白皮杉醇对hsv
‑
1病毒感染小鼠生存率的影响结果图。
26.图8是白皮杉醇降低hsv
‑
1病毒感染小鼠脊髓组织中的病毒载量结果图。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
28.本发明按照国际公认的方法，评价了白皮杉醇对单纯疱疹病毒的抑制作用及其机制。本发明白皮杉醇采用市面销售的产品即可。
29.实施例1：白皮杉醇在体外抑制单纯疱疹病毒的作用1. 实验方法1.1白皮杉醇的细胞毒性试验测定白皮杉醇在三类细胞株的细胞毒性，将vero、hela、hep
‑
2细胞分别接种于96
孔板中，24 h之后，吸弃原培养液，将梯度稀释的白皮杉醇（终浓度为400 μm、200 μm、100 μm、50 μm）加入96孔板，每个浓度三个复孔，同时设有空白对照组。细胞置于37℃，在含5% co2的恒温细胞培养箱中培养24h后，吸弃药物，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，吸弃，加入5%结晶紫室温染色15 min，清洗晾干后用酶标仪测定a
540nm
值。
30.细胞存活率＝试验组a
540nm
／阴性对照组a
540nm
×
100%。
31.1.2 细胞病变效应(cpe)检测白皮杉醇对病毒的抑制实验96孔板中的vero、hela、hep
‑
2细胞用感染复数(moi)为0.1的hsv
‑
1或hsv
‑
2感染。将白皮杉醇按照梯度稀释，对hsv
‑
1及hsv
‑
2感染的vero、hela、hep2细胞进行全过程给药（预处理细胞、预处理病毒、吸附时、吸附后四种方式）。预处理细胞（pre cell）：白皮杉醇于37 ℃作用细胞1h，吸弃，37℃吸附hsv（moi=0.1）1h，换成维持液；预处理病毒（pre virus）：白皮杉醇与hsv于37℃混合孵育1h后，加入吸弃原培养基的96孔板中，37℃作用1h，换成维持液；吸附时（adsorption）给药：白皮杉醇与hsv（moi=0.1）混合后加入96孔板中于37℃作用1h，换成维持液；吸附后（post
‑
adsorption）给药：hsv于37℃吸附细胞1h，换成含有白皮杉醇的维持液。每个浓度设有3个复孔，同时设有病毒对照组和空白对照组。30h后按“1.1”方法检测a
540nm
。
32.细胞存活率＝（试验组a
540nm
－病毒对照组a
540nm
）／（空白对照组a
540nm
－病毒对照组a
540nm
）
×
100%。
33.1.3 空斑减少试验检测白皮杉醇对病毒的直接抑制作用接种vero细胞于12孔板中，至其长满单层。梯度稀释的白皮杉醇（10 μm、5 μm、2.5 μm、1.25 μm、0.625 μm）与hsv
‑
1于37 ℃混合处理1 h后，加入吸弃原培养基的12孔板中，37 ℃作用1 h，吸弃，加入配制好的overlay培养基，待其冷却凝固后，倒置于37 ℃培养箱中。至其出斑后，固定染色，进行空斑计数。
34.2．实验结果2.1白皮杉醇对不同细胞的细胞毒检测实验结果如图1所示，白皮杉醇在hep
‑
2细胞的毒性最小，即使浓度高达400 μm，细胞活力仍维持在60%以上。在hela细胞中白皮杉醇浓度为200 μm时，细胞活力就降到了50%。在vero细胞中，皮杉醇浓度为100 μm时，细胞活力就降到了50%。由此可见白皮杉醇对细胞产生的细胞毒性一般，存在细胞特异性。
35.2.2 cpe抑制实验评价不同细胞中白皮杉醇抗hsv病毒活性利用cpe实验测定白皮杉醇在在vero、hep
‑
2和hela三种不同的细胞中测定抗hsv
‑
1和hsv
‑
2的活性，并计算ic
50
值，以探究其抗hsv的作用是否具有细胞选择性。结果如表1所示，白皮杉醇在三种细胞中具有极强的抗hsv的活性，ic
50
均小于2 μm，且不存在细胞特异性，且都具有一定的剂量依赖性。表1 白皮杉醇在不同细胞中的细胞毒性和抗病毒作用
根据实验结果计算出cc
50
与i
c50
值，计算其选择指数（si），与阳性药阿昔洛韦（acv）的si比较，进而评价其抗hsv作用。结果表明，白皮杉醇在hep
‑
2和hela两种细胞中的si值均优于阳性药阿昔洛韦，白皮杉醇在hep
‑
2细胞上抗病毒活性最好，si值分别为413.7和587.9，分别是阿昔洛韦si值的8.9倍和18.6倍。实验结果更加直观的表明，白皮杉醇有成为一种高效低毒的抗hsv病毒药物的潜力，且存在一定的细胞特异性。
36.2.3空斑减少试验评价白皮杉醇对于hsv的直接灭活作用利用病毒空斑减少试验来评价白皮杉醇对hsv病毒是否有直接灭活作用。实验结果如图2所示，在最低浓度0.3125 μm时，白皮杉醇对hsv
‑
1的病毒空斑形成的抑制率在50%以上，而在最高浓度5 μm时则将hsv
‑
1病毒完全灭活，没有病毒空斑形成。这表明白皮杉醇发挥抗病毒作用可能是由于与病毒颗粒直接作用导致的。
37.2.4 白皮杉醇对hsv病毒蛋白表达的抑制作用利用western blot实验检测白皮杉醇对hsv病毒蛋白表达的影响，选用了hsv
‑
1的icp
‑
27蛋白进行检测，并进行定量分析。由实验结果图3可以观察到在浓度10 μm、5 μm时，icp
‑
27蛋白条带几乎检测不到。而灰度分析则定量分析了经白皮杉醇处理后hsv
‑
1病毒蛋白表达的抑制作用，在2.5~10 μm时，白皮杉醇对hsv
‑
1的icp
‑
27蛋白表达有极显著的抑制作用，减少了hsv
‑
1 icp27蛋白80%以上的表达量。
38.实施例2：白皮杉醇抑制hsv病毒的作用机制1. 实验方法1.1 空斑形成实验接种vero细胞于12孔板中，至其长满单层。按照1.2的实验方法中4种不同的给药方式分别加入蟛蜞菊内酯（终浓度10 μm），24h后收取上清，同时设置病毒对照组。收取的上清稀释10
‑1~10
‑3倍，于37 ℃吸附细胞1 h，吸弃，加入配制好的overlay培养基，待其冷却凝固后，倒置于37℃培养箱中。至其出斑后，固定染色，进行空斑计数。
39.1.2 western blot 试验接种vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，梯度稀释的白皮杉醇与hsv
‑
1及hsv
‑
2于37℃混合预处理1 h后，加入6孔板中，37℃ 1 h，吸弃，换成维持液，同时设有病毒对照组
和空白对照组。vero细胞接种于12孔板中，hsv
‑
1（moi=0.1）于37 ℃吸附细胞1 h，于吸附后不同时间段（0
‑
2 h、2
‑
4 h、4
‑
6 h、6
‑
8 h、8
‑
10 h、10
‑
12 h、0
‑
6 h、0
‑
12 h）加入白皮杉醇（终浓度40 μm）。
40.16 h后收样，每孔加入100 μl细胞裂解液（800 μl ripa，200 μl 5
×
蛋白上样缓冲液，10 μl pmsf），冰上裂解17 min，将裂解液刮下后转移到ep管中，100℃煮样20 min，放在
‑
20℃冰箱备用。用bca试剂盒测定提取的蛋白浓度后进行sds
‑
page电泳，将电泳胶通过半干法转移到nc膜上，将nc膜用5%的奶粉于4 ℃封闭过夜，1
×
tbst洗涤3次，用hsv
‑
1/hsv
‑
2 的icp27、gb的抗体稀释液（1:1000稀释）于37 ℃孵育2 h，继续洗涤3次，然后用二抗稀释液（1：5000稀释）于37℃孵育2 h。用碱性磷酸酶检测试剂盒显色，拍照后用image j处理图像。
41.1.3 膜融合抑制试验vero细胞铺于6孔板中，待细胞长满单层。将6孔板中的培养基吸弃，pbs洗一次，加入hsv
‑
1稀释液（moi=3.0），37℃吸附1 h，吸弃，加入维持液培养。在0 h加入1.25，2.5，5 或10
ꢀµ
m的白皮杉醇处理细胞14 h；或者在培养箱中培养5 h后加入1.25，2.5，5 或10
ꢀµ
m的白皮杉醇处理细胞2 h，同时设有空白组和病毒对照组，每组两个复孔。然后分别在病毒感染后的第7 h或14 h的时刻，吸弃培养板中的培养液，用4%的多聚甲醛溶液固定10 min，pbs洗涤2次，每次2 min。用0.25% (v/v) triton x
‑
100通透10 min，pbs洗涤5 min；吸弃，苏木素染色液染色10 min，浸入自来水中洗去多余的染色液，约10 min。蒸馏水再洗涤一次，加入95%的乙醇溶液10 s，双蒸水洗10 min。伊红染色液染色2 min，用70%的乙醇溶液洗涤两次，在显微镜下观察并拍照。
42.1.4统计分析所有数据均代表至少三次独立实验。数据表示为平均值
±
标准偏差（sd）。统计显著性在graphpad prism 7软件中使用one way
‑
anova测试。p <0.05被认为具有统计学意义。
43.2．实验结果2.1通过空斑形成实验评价白皮杉醇的作用方式明确药物发挥抗病毒作用的作用方式，对寻找药物作用靶点和探究药物具体作用机制至关重要。药物对hsv病毒的四种作用方式分别是：预处理病毒，预处理细胞，吸附时给药和吸附后给药，实验结果如图4所示。白皮杉醇预处理病毒1 h对病毒增殖达到了较显著的抑制作用，使hsv
‑
1的病毒滴度下降了约1个log
10 (pfu/ml)。吸附后给药虽有一定的抑制作用但不显著。实验结果，证明白皮杉醇发挥抗hsv作用的主要作用方式是预处理病毒，表明白皮杉醇与hsv病毒颗粒有直接相互作用，且对病毒的吸附或入侵产生影响，从而使得进入vero细胞的病毒颗粒减少。
44.2.2 通过western blot实验进一步评价白皮杉醇的作用方式采用western blot试验进一步探索白皮杉醇不同作用方式下对于hsv
‑
1病毒蛋白icp27表达的影响，并进行定量分析。由实验结果图5可以观察到用10 μm白皮杉醇预处理病毒后，icp27蛋白条带几乎检测不到。而灰度分析表明在预处理病毒时，白皮杉醇对hsv
‑
1的icp
‑
27蛋白表达有极显著的抑制作用；而吸附后加药也能够显著降低icp27蛋白的表达。这说明白皮杉醇主要通过作用于hsv病毒本身来干扰病毒的早期感染过程。
45.2.3白皮杉醇对hsv诱导的膜融合的抑制作用hsv
‑
1和hsv
‑
2病毒感染后能够诱导细胞膜融合现象，导致多核细胞合胞体的形成，而细胞融合现象也是病毒扩散所必需的步骤。由于白皮杉醇可能阻断hsv的早期感染过程，因此我们探究白皮杉醇是否能抑制病毒诱导的膜融合过程。如图6所示，在hsv
‑
1（moi=3.0）感染的vero细胞中，未经处理的病毒对照组（hsv
‑
1）在7 h时观察到明显的多核细胞合胞体。在5~7 h期间用白皮杉醇（10 μm，5 μm，2.5 μm，1.25 μm）处理后没有明显抑制合胞体的形成。此外，我们先用白皮杉醇预处理病毒后感染vero细胞，如图6所示，未经处理的病毒对照组（hsv
‑
1）在14 h时观察到明显的多核细胞合胞体。而用白皮杉醇预处理后明显地阻断了合胞体的形成，特别是在10 μm白皮杉醇预处理病毒后，没有形成多核细胞的合胞体。因此，白皮杉醇主要是通过直接作用于病毒本身来阻断病毒的早期感染进而抑制hsv诱导的细胞膜融合，并不是通过直接抑制病毒表面糖蛋白的功能来抑制膜融合。
46.综上所述，本实验结果表明白皮杉醇具有针对hsv
‑
1和hsv
‑
2的有效抑制活性，毒性较低。白皮杉醇可通过与病毒颗粒的直接作用阻断hsv感染，其最佳作用方式是预处理病毒，从而干扰病毒的早期感染过程。白皮杉醇作用机制与目前抗hsv的核苷类药物不同。因此，来自植物来源的天然产物白皮杉醇在未来作为一种新型抗hsv制剂值得进一步研究。
47.实施例3：白皮杉醇治疗hsv感染小鼠的作用1. 实验方法1.1实验造模本案所有使用的小鼠均符合中国科学技术部实验动物的人道待遇指(vgkfcz
‑
2006
‑
398)。使用三周龄的，体重10~12 g的babl/c雌性小鼠，随机分为正常对照组、病毒对照组、阳性药阿昔洛韦组(10 mg/kg/天)、白皮杉醇高剂量组(5 mg/kg/天)、白皮杉醇低剂量组(2.5 mg/kg/天)，共5组。使用20%的乌来糖麻醉小鼠，通过滴鼻接毒鼻的方式对小鼠进行感染，向每只小鼠的鼻腔滴加50 μl的病毒。正常对照组滴加等量的生理盐水。
48.1.2 给药方式及临床观察病毒感染后4 h后开始以腹腔注射的方式给药，阿昔洛韦以10 mg/kg/天剂量给药，白皮杉醇以5 mg/kg/天和2.5 mg/kg/天，两种剂量给药，空白对照组注射相对体积的生理盐水，每天一次，连续给药五天，注意每天相同时间给药。以接毒日期为起始时间，连续观察小鼠临床症状14天，并记录每天小鼠体重变化以及死亡情况。
49.1.3 小鼠组织中的病毒载量在接毒的72 h后，每组随机选取3只小鼠断颈处死并进行解剖，取每只小鼠的肺部组织，脑部组织以及脊髓组织，用生理盐水洗去血液及其他杂质，用滤纸吸去多余水分称重。
50.肺部组织按照0.1 g组织加0.7 ml pbs的比例加入pbs，然后加入磁珠，用匀浆机进行匀浆，在离心机中以4℃ 10000 rpm/min的转速离心10 min，取上清，按照10倍梯度稀释，加入12孔板中，37℃吸附1 h，吸弃，倒入温度适宜的overlay，待其凝固后，倒扣于培养箱中，出现空斑后，4%多聚甲醛固定20 min，去除overlay，结晶紫染色15 min，用自来水冲洗，空斑计数。
51.脊髓组织加入350 μl的裂解液以及磁珠，用匀浆机匀浆，然后按照说明书步骤提取组织中的总rna，测定浓度，用hsv
‑
1的gd引物，按照试剂盒步骤进行rt
‑
pcr试验。
52.2. 实验结果2.1 小鼠的临床现象、体重变化及生存率情况小鼠在感染hsv
‑
1病毒72 h后，可以观察到病毒组小鼠中的几只出现了明显的倒毛，弓背成团的现象，而空白组及其它给药组并没有出现这种现象，并且病毒组小鼠在接毒后期倒毛弓背现象越发明显，且伴有食欲下降，行动迟缓的现象。各组小鼠为期14 天的生存率变化如图7所示。病毒组小鼠在接毒后的第二天开始出现死亡，并且在14天时，生存率只有20%。与空白组相比，阳性药组生存率有70%，证明阳性药组（10 mg/kg/天）能提高小鼠生存率；白皮杉醇组的高剂量组（5 mg/kg/天）生存率有50%，而低剂量组（2.5 mg/kg/天）生存率为40%。说明白皮杉醇能够显著提高hsv感染小鼠的生存率。
53.2.2小鼠脊髓组织中的病毒载量小鼠组织中的病毒载量是分析病毒感染的重要指标。实验结果如图8所示，与病毒组相比，阳性药组（10 mg/kg/天）降低了约90%的病毒载量，白皮杉醇高剂量组（5 mg/kg/天）则降低了约95%的病毒载量，而白皮杉醇低剂量组也降低了约70%的病毒载量。上述结果表明，白皮杉醇确实能在动物水平上，降低小鼠组织中的病毒载量，证明白皮杉醇在动物体内仍能发挥抗hsv病毒作用。
54.以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。