蟛蜞菊内酯在制备用于预防和/或治疗疱疹病毒感染的药物和保健品中的应用的制作方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及蟛蜞菊内酯在制备用于预防和/或治疗疱疹病毒感染的药物和保健品中的应用。


背景技术：

2.疱疹病毒是一种包膜双链dna病毒，属于疱疹病毒科，最典型的是单纯疱疹病毒，主要分为 1型（hsv
‑
1）和2型（hsv
‑
2）。人群中感染极为普遍，初次感染中的80%—90%为隐性感染，大多无明显症状，其中hsv
‑
1感染导致皮肤损伤，通常局限于口腔，鼻腔和眼部水平，而对于hsv
‑
2，感染最常见于生殖器皮肤和粘膜等部位。目前fda批准的用于疱疹病毒的抗病毒剂主要涉及核苷类似物，例如阿昔洛韦（acv）和喷昔洛韦，其主要抑制病毒基因组复制。尽管取得了这些成功，但抗药性和副作用仍未解决hsv感染的问题。因此，具有不同于核苷类似物的作用机制的新型抗hsv制剂的开发具有重要临床意义。
3.蟛蜞菊内酯（wedelolactone，c
16
h
10
o7）是从蟛蜞菊（wedelia chinensis）、墨旱莲（eclipta prostrata l.）中提取的香豆素类化合物。蟛蜞菊内酯具有许多不同的生物活性，有保肝、抗免疫抑制、抗炎症、促骨分化、抗癌等药理作用。然而，蟛蜞菊内酯对单纯病毒感染的作用尚未报道。


技术实现要素：

4.本发明提供了蟛蜞菊内酯在制备用于预防和/或治疗疱疹病毒感染的药物和保健品中的应用。本发明首次经实验验证，蟛蜞菊内酯具有对hsv
‑
1和hsv
‑
2的抑制作用且毒性极低，具有开发成新型抗hsv药物和保健品的潜力。
5.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：本发明提供了蟛蜞菊内酯在制备用于预防和/或治疗疱疹病毒感染的药物和保健品中的应用。
6.进一步的，所述疱疹病毒为单纯疱疹病毒，具体为hsv
‑
1病毒和hsv
‑
2病毒。
7.进一步的，所述蟛蜞菊内酯的使用浓度为0.1 μm ~50 μm。
8.进一步的，所述蟛蜞菊内酯有效抑制hsv
‑
2病毒的使用浓度为0.25 μm~2 μm。
9.优选的，所述蟛蜞菊内酯有效抑制hsv
‑
2病毒的使用浓度为0.5 μm~2 μm。
10.进一步的，所述蟛蜞菊内酯有效抑制hsv
‑
1病毒的使用浓度为1.25 μm~10 μm。
11.优选的，所述蟛蜞菊内酯有效抑制hsv
‑
1病毒的使用浓度为5 μm~10 μm。
12.进一步的，所述蟛蜞菊内酯抗疱疹病毒效果最好的使用浓度为10 μm。
13.进一步的，所述药物和保健品是以蟛蜞菊内酯及其药学上可接受的盐、立体异构体、晶体或衍生物为主要活性组分，与药学上的辅助性成分共同制备而成的。
14.进一步的，所述药物和保健品的使用时间为疱疹病毒感染后的2~6 h内。
15.优选的，所述药物和保健品的使用时间为疱疹病毒感染后的2~4 h内。
16.进一步的，所述药物和保健品中含有主要活性组分蟛蜞菊内酯的剂量为2.5 mg/kg/d ~ 5 mg/kg/d。
17.优选的，所述药物和保健品中含有主要活性组分蟛蜞菊内酯的剂量为5 mg/kg/d。
18.进一步的，所述药物和保健品通过其中所含的蟛蜞菊内酯与疱疹病毒直接作用，而到达阻断疱疹病毒感染的作用。
19.本发明还提供了一种用于预防和/或治疗疱疹病毒感染的药物，所述药物以蟛蜞菊内酯及其药学上可接受的盐、立体异构体、晶体或衍生物为主要活性成分。
20.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明选取蟛蜞菊内酯为研究对象，在体内和体外水平上揭示其抑制单纯疱疹病毒作用。本发明经实验证实天然产物蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1和hsv
‑
2感染具有较好的抑制作用，能抑制hsv
‑
1和hsv
‑
2的相关蛋白质和mrna表达。蟛蜞菊内酯可干扰病毒吸附，改善单纯疱疹病毒感染小鼠身体状况，抑制其体内病毒增殖。本发明首次确定蟛蜞菊内酯具有对hsv
‑
1和hsv
‑
2的抑制作用且毒性极低。因此，蟛蜞菊内酯有可能开发成新型抗hsv药物，具有良好的市场应用前景。
附图说明
21.图1是蟛蜞菊内酯对vero，hep
‑
2及hela三种细胞细胞毒性作用检测的结果图。
22.图2是蟛蜞菊内酯以不同作用方式进入vero细胞抑制hsv
‑
1和hsv
‑
2病毒的空斑实验结果。
23.图3是蟛蜞菊内酯对hsv直接灭活作用的空斑减少实验结果图。
24.图4是蟛蜞菊内酯在不同作用时间下对hsv的抑制作用结果图。
25.图5是蟛蜞菊内酯不同浓度对hsv
‑
1病毒的icp27蛋白表达的抑制作用结果图。
26.图6是蟛蜞菊内酯不同浓度对hsv
‑
2病毒的gb蛋白表达的抑制作用结果图。
27.图7是蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1的gd蛋白mrna表达的抑制作用结果图。
28.图8是蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1感染小鼠体重的影响结果图。
29.图9是蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1感染小鼠生存率的影响结果图。
30.图10是蟛蜞菊内酯降低hsv
‑
1感染小鼠脊髓组织中的病毒载量结果图。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
32.本发明按照国际公认的方法，评价了蟛蜞菊内酯对单纯疱疹病毒的抑制作用及其机制。本发明的蟛蜞菊内酯采用市面销售的产品即可。
33.实施例1：蟛蜞菊内酯在体外抑制单纯疱疹病毒的作用1. 实验方法1.1蟛蜞菊内酯的细胞毒性试验测定蟛蜞菊内酯在三种不同细胞上的细胞毒性。将vero、hela、hep
‑
2三种细胞分别接种于96孔板中，至其长满单层，吸弃原培养液后，将梯度稀释的蟛蜞菊内酯（终浓度为400μm、200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm或300μm、150μm、175μm、37.5μm、18.75μm）加入96孔板，每个浓度三个复孔，同时设有空白对照组。细胞置于37℃，在含5% co2的恒温细胞培养
箱中培养24h后，吸弃药物，加入4%多聚甲醛室温固定15min，吸弃，加入5%结晶紫室温染色15min，清洗晾干后用酶标仪测定a
540nm
值。
34.细胞存活率＝试验组a
540nm
／阴性对照组a
540nm
×
100%。
35.1.2细胞病变效应(cpe)检测蟛蜞菊内酯对病毒的抑制实验96孔板中的vero、hela、hep
‑
2细胞用感染复数(moi)为0.1的hsv
‑
1或hsv
‑
2感染。将蟛蜞菊内酯按照梯度稀释，对hsv
‑
1及hsv
‑
2感染的vero、hela、hep2细胞进行全过程给药（预处理细胞、预处理病毒、吸附时、吸附后四种方式）。预处理细胞（预给药 细胞）：蟛蜞菊内酯于37℃作用细胞1h，吸弃，37℃吸附hsv（moi=0.1）1h，换成维持液；预处理病毒（预给药 hsv）：蟛蜞菊内酯与hsv于37℃混合孵育1h后，加入吸弃原培养基的96孔板中，37℃作用1h，换成维持液；吸附时给药（吸附加药）：蟛蜞菊内酯与hsv（moi=0.1）混合后加入96孔板中于37℃作用1h，换成维持液；吸附后给药（吸附后加药）：hsv于37℃吸附细胞1h，换成含有蟛蜞菊内酯的维持液。每个浓度设有3个复孔，同时设有病毒对照组和空白对照组。30h后按1.1的实验方法检测a
540nm
。
36.细胞存活率＝（试验组a
540nm
－病毒对照组a
540nm
）／（空白对照组a
540nm
－病毒对照组a
540nm
）
×
100%。
37.1.3 空斑滴度试验检测蟛蜞菊内酯对病毒的抑制作用接种vero细胞于12孔板中，至其长满单层。按照1.2的实验方法中4种不同的给药方式分别加入蟛蜞菊内酯（终浓度10μm），24h后收取上清，同时设置病毒对照组。收取的上清稀释10
‑1~10
‑3倍，于37℃吸附细胞1h，吸弃，加入配制好的overlay培养基，待其冷却凝固后，倒置于37℃培养箱中。至其出斑后，固定染色，进行空斑计数。
38.1.4空斑减少试验检测蟛蜞菊内酯对病毒的直接抑制作用接种vero细胞于12孔板中，至其长满单层。梯度稀释的蟛蜞菊内酯（10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm）与hsv
‑
1于37℃混合处理1h后，加入吸弃原培养基的12孔板中，37℃作用1h，吸弃，加入配制好的overlay培养基，待其冷却凝固后，倒置于37℃培养箱中。至其出斑后，固定染色，进行空斑计数。
39.2．实验结果2.1蟛蜞菊内酯的细胞毒性试验实验结果如图1所示，可以看出蟛蜞菊内酯浓度为50 μm时，vero的细胞存活率接近80%；浓度为75 μm时，hela的细胞存活率接近80%，浓度为150μm时，hep
‑
2的细胞存活率接近80%。随着蟛蜞菊内酯浓度逐渐增大，细胞存活率逐渐下降。在vero细胞中的cc
50
为175.6 μm，在hela细胞中的cc
50
为227.4 μm，在hep
‑
2细胞中的cc
50
为250.0 μm。
40.2.2 cpe抑制实验评价不同细胞中蟛蜞菊内酯抗hsv病毒活性cpe抑制实验评价蟛蜞菊内酯在vero、hela、hep
‑
2三种细胞中抗hsv
‑
1及hsv
‑
2的活性，通过全过程给药计算半数抑制浓度（ic
50
），并计算出治疗指数（si=cc
50
/ic
50
）。如表1所示，蟛蜞菊内酯在三种细胞上均有很好的抗hsv作用，其ic
50
值均小于5 μm，且具有一定的剂量依赖性。经过对比发现，蟛蜞菊内酯的抑制效果存在一定的细胞特异性，其在vero细胞上抗hsv
‑
2的作用效果尤为显著。
41.表1 蟛蜞菊内酯在不同细胞中的细胞毒性和抗病毒作用
2.3空斑形成实验评价蟛蜞菊内酯对hsv产生抑制效果的作用方式如图2所示，蟛蜞菊内酯通过预处理细胞、预处理病毒、吸附时给药、吸附后给药四种方式作用于vero细胞。与hsv
‑
1病毒组相比，病毒滴度分别下降了0.88、5.9、0.24、1.24个log
10 (pfu/ml)；与hsv
‑
2病毒组相比，病毒滴度分别下降了0.12、3.09、0.13、1.91个log
10 (pfu/ml)。
42.2.4 空斑减少试验评价蟛蜞菊内酯对hsv的直接灭活作用上述实验表明蟛蜞菊内酯可能通过直接与hsv相互作用，从而降低病毒滴度，于是我们利用空斑减少试验，进一步验证蟛蜞菊内酯是否可通过与病毒直接作用使其灭活。如图3所示，空斑减少试验更加直观的表明，蟛蜞菊内酯对hsv具有直接灭活作用，在0.625 μm以上浓度都能明显抑制hsv病毒的空斑形成。
43.实施例2：蟛蜞菊内酯抗hsv的作用机制1. 实验方法1.1间接免疫荧光试验接种vero细胞于3.5 cm玻底皿，待细胞长至密度30%~40%时，用蟛蜞菊内酯（终浓度10μm）按照实施例1中1.2中4种不同作用方式处理hsv
‑
1（moi=1），置于37℃培养箱中培养8h；然后用pbs清洗细胞，4%多聚甲醛室温固定15min，pbs清洗2min，0.25% triton x
‑
100通透10min，pbs清洗2min，2% bsa于37℃封闭1h，pbs清洗三次，加入icp5的抗体（1：100稀释）于4℃孵育16h，清洗后加入fitc偶联二抗于4℃孵育4h，清洗三次，dapi处理10min，清洗后进行共聚焦成像，并使用image j(nih)进行分析。
44.1.2 western blot 试验接种vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，梯度稀释的蟛蜞菊内酯与hsv
‑
1及hsv
‑
2于37℃混合预处理1h后，加入6孔板中，37℃吸附细胞1h，吸弃，换成维持液，同时设有病毒对照组和空白对照组。vero细胞接种于12孔板中，hsv
‑
1（moi=0.1）于37℃吸附细胞1h，于吸附后不同时间段（0
‑
2h、2
‑
4h、4
‑
6h、6
‑
8h、8
‑
10h、10
‑
12h、0
‑
6h、0
‑
12h）加入蟛蜞菊内酯（终浓度40μm）。
45.16h后收样，每孔加入100μl细胞裂解液（800μl ripa，200μl 5
×
蛋白上样缓冲液，10μl pmsf），冰上裂解17min，将裂解液刮下后转移到ep管中，100℃煮样20min，放在
‑
20℃冰箱备用。用bca试剂盒测定提取的蛋白浓度后进行sds
‑
page电泳，将电泳胶通过半干法转移到nc膜上，将nc膜用5%的奶粉于4℃封闭过夜，1
×
tbst洗涤3次，用hsv
‑
1/hsv
‑
2 icp27、gb的抗体稀释液（1:1000稀释）于37℃孵育2h，继续洗涤3次，然后用二抗稀释液（1：5000稀释）于37℃孵育2h。用碱性磷酸酶检测试剂盒显色，拍照后用image j处理图像。
46.1.3实时荧光定量pcr（rt
‑
pcr）接种vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，用hsv（moi=0.1）于37℃感染细胞1h，
然后将含有不同浓度蟛蜞菊内酯的维持液加入相应孔中，同时设有病毒对照组和空白对照组。16h后用rna提取试剂盒提取总rna。对提取的rna进行浓度检测后，利用applied biosystems 7500 fast real time pcr system，按照one step tb green
® primescript
tm rt
‑
pcr kit
ꢀⅱ
试剂盒的说明书进行操作。
47.扩增引物序列如下：hsv
‑
1 (gd) mrna forward primer：5
’‑
agcaggggttagggagttg
ꢀ‑3’
；hsv
‑
1 (gd) mrna reverse primer：5
’‑
ccatcttgagagaggcatc
ꢀ‑3’
；actin mrna forward primer：5
’‑ꢀ
ctccatcctggcctcgctgt
ꢀ‑3’
；actin mrna reverse primer：5
’‑
gctgtcaccttcaccgttcc
ꢀ‑3’
。
48.1.4 统计分析所有数据均代表至少三次独立实验。数据表示为平均值
±
标准偏差（sd）。统计显著性在graphpad prism 7软件中使用one way
‑
anova测试。p <0.05被认为具有统计学意义。
49.2．实验结果2.1蟛蜞菊内酯在吸附后不同作用时间段对hsv的抑制作用通过上述实验可以看出蟛蜞菊内酯可在吸附后阶段对hsv感染产生抑制作用，于是我们利用western blot试验对蟛蜞菊内酯在hsv感染后不同时间阶段给药的抑制活性进行了评价。如图4所示，蟛蜞菊内酯在吸附后2
‑
4 h给药可极显著降低病毒滴度，4
‑
6 h对病毒增殖的抑制效果也很显著。在6
‑
8 h、8
‑
10 h、10
‑
12 h几乎没有抑制作用。另外，在0
‑
6 h或0
‑
12 h用蟛蜞菊内酯处理对病毒增殖的抑制作用同样显著。因此，蟛蜞菊内酯在hsv感染后的早期阶段，即2
‑
4 h作用效果最好。
50.2.2 western blot试验评价蟛蜞菊内酯对病毒蛋白表达的抑制作用采用western blot试验检测蟛蜞菊内酯对hsv病毒蛋白表达的影响，选用了hsv
‑
1的icp27蛋白和hsv
‑
2的gb蛋白进行检测，并进行定量分析。实验结果见图5和图6。结果表明在蟛蜞菊内酯浓度为5~10 μm时，hsv
‑
1的icp27蛋白几乎检测不到或只能检测到很浅的蛋白条带。同时经过灰度分析定量后可以看出在1.25~2.5 μm时，蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1 icp27蛋白的表达也具有显著的抑制作用，减少了hsv
‑
1的icp27蛋白40~50%的表达量；在5~10 μm时，对icp27蛋白表达的抑制作用极显著，减少了hsv
‑
1的icp27蛋白80~90%的表达量。
51.此外，图6结果表明在药物浓度为1~2 μm时，几乎检测不到hsv
‑
2的gb蛋白条带。经过灰度分析定量后可以看出在0.25 μm时，蟛蜞菊内酯对hsv
‑
2 gb蛋白的表达就具有显著的抑制作用；在0.5~2 μm时，对hsv
‑
2 gb蛋白表达的抑制作用极显著，减少了hsv
‑
2 gb蛋白80~90%的表达量。上述结果表明，蟛蜞菊内酯能显著降低hsv病毒蛋白的表达水平，且这种抑制作用具有明显的剂量依赖性。
52.2.3 蟛蜞菊内酯对hsv gd蛋白mrna表达的抑制作用经蟛蜞菊内酯处理后，vero细胞感染hsv
‑
1后16 h提取rna，应用rt
‑
pcr 的方法检测病毒gd蛋白的mrna 的表达水平，并用2
‑
δδct
法处理实验结果，结果如图7所示。经hsv
‑
1感染后，在药物浓度为1.25 μm时，蟛蜞菊内酯对hsv
‑
1病毒蛋白gd的mrna 的表达有显著抑制作用，在2.5 μm以上浓度时，则有极显著的抑制作用。实验结果与病毒蛋白检测结果基本一致，且都呈现明显的剂量依赖性，说明蟛蜞菊内酯能抑制病毒吸附后的复制过程，这可能与
其抑制病毒进入和早期复制过程有关。
53.综上所述，上述结果表明蟛蜞菊内酯具有针对hsv
‑
1和hsv
‑
2的有效抑制活性，毒性非常低。蟛蜞菊内酯可通过与病毒颗粒的直接作用阻断hsv感染，从而干扰病毒吸附和早期复制过程。蟛蜞菊内酯作用机制与目前抗hsv的核苷类药物不同。因此，来自植物来源的天然产物蟛蜞菊内酯在未来作为一种新型抗hsv制剂值得进一步研究。
54.实施例3：蟛蜞菊内酯治疗hsv感染小鼠的作用1. 实验方法1.1实验造模本发明所有使用的小鼠均符合中国科学技术部实验动物的人道待遇指导(vgkfcz
‑
2006
‑
398)。使用3~4周龄的balb/c雌鼠，体重14~15g，随机分为5组：空白对照组，病毒对照组，阳性药（阿昔洛韦10 mg/kg/天）组，蟛蜞菊内酯高剂量（5 mg/kg/天）组，蟛蜞菊内酯低剂量（2.5 mg/kg/天）组。采用滴鼻方式接毒，接毒后4 h给药，连续给药5天。
55.1.2小鼠检测接毒后72 h解剖，取小鼠的肺及脊髓，通过空斑试验及实时荧光定量rt
‑
pcr验证药物在体内抗hsv
‑
1的作用效果。以接毒日为起始日，连续14天观察小鼠临床症状，每天记录小鼠体重变化及生存情况。
56.2. 实验结果2.1 hsv
‑
1感染后小鼠的体重变化图8为小鼠的体重变化情况。结果表明空白组体重在前3天出现轻微下降现象，可能与环境因素有关，但整体呈平稳上升趋势。与空白组相比，病毒组体重在前6天持续下降，第6天后开始缓慢回升，有轻微波动，但仍轻于原始体重。阳性药组（10 mg
·
kg
‑1）同样在前3天体重缓慢下降，之后开始缓慢回升；蟛蜞菊内酯处理组（5 mg
·
kg
‑1或2.5 mg
·
kg
‑1）前3天体重略有下降，随后开始缓慢回升，虽然有轻微波动，但仍略高于阳性药组体重。
57.2.2小鼠生存率情况图9为小鼠的生存率情况。结果表明病毒组在接毒后第2天开始出现死亡，并且在第13天时生存率降至10%；阳性药组（10 mg
·
kg
‑1）在接毒后第3天开始出现死亡，第9天时生存率降至60%；蟛蜞菊内酯高剂量组（5 mg
·
kg
‑1）在接毒后第5天开始出现死亡现象，在第7天时生存率降低至80%；蟛蜞菊内酯低剂量组（2.5 mg
·
kg
‑1）在接毒后第4天开始出现死亡现象，在第10天时生存率降低至60%。与病毒组相比，蟛蜞菊内酯高剂量组生存率（80%）明显提高，且优于阳性药组（60%）。这表明蟛蜞菊内酯能够显著改善小鼠感染hsv
‑
1病毒后的生存状况，提高小鼠生存率。
58.2.3小鼠脊髓组织中的病毒载量变化小鼠组织中的病毒载量是分析病毒感染的重要指标，由于hsv可以在神经组织中建立潜伏性感染，利用rt
‑
pcr对小鼠脊髓组织中的病毒载量进行检测。结果如图10所示，与病毒组相比，阳性药组（10 mg
·
kg
‑1）降低了约90%的病毒载量，蟛蜞菊内酯高剂量组（5 mg
·
kg
‑1）则降低了近98%的病毒载量，效果略优于阳性药阿昔洛韦组；而蟛蜞菊内酯低剂量组（2.5 mg
·
kg
‑1）也降低了约80%的病毒载量。上述结果表明，蟛蜞菊内酯可在体内动物水平上显著降低hsv感染小鼠中的病毒载量，且高剂量组效果优于阳性药阿昔洛韦。综上所述，蟛蜞菊内酯还具有很好的体内抗hsv感染作用。
59.以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。