一种具有降血压功能的发酵石榴汁及其制备方法与流程

1.本发明属于食品制造技术领域，具体属于一种具有降血压功能的发酵石榴汁及其制备方法。


背景技术：

2.高血压是常见的心血管疾病，严重危害人类健康，该病不可治愈，患者需终身服药。据世界卫生组织报道，全球1/3的成年人患有高血压。我国第五次高血压调查显示：中国成人高血压患病率为23.2％，患病人数达2.45亿，患病率随年龄增加而升高，且男性高于女性。血管紧张素转化酶(angiotensin
‑
converting enzyme，ace)作用于人体内的肾素
‑
血管紧张素
‑
醛固酮系统(renin
‑
angiotensin system，ras)，将血管紧张素i(ang i)转化为血管紧张素ii(ang ii)，使血管强烈收缩，血管压力增大。国外学者研究发现石榴汁可有效降低血液中ace表达水平。mohan发现给糖尿病高血压大鼠连续喂食石榴汁四周后，可显著降低血清ace水平。aviram研究发现高血压患者每天食用石榴果汁2周后，血清中ace活性降低36％，收缩压降低5％。研究发现石榴汁中酚类化合物(主要为黄酮类和酚酸类)能够和ace活性位点紧密结合，有效降低ace活性，但是石榴汁中多酚主要为结合态形式，在胃肠道中不易吸收，导致低价的生物可及度和生物利用度，体内降血压效果个体差异较大。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有降血压功能的发酵石榴汁及其制备方法，能够提供石榴中的多种营养物质和清香味，更兼具降低高血压的治疗效果，生产成本较低，不受资源限制，环境污染小，可大量生产且产品安全在食品行业具有广泛应用前景。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有降血压功能的发酵石榴汁的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
5.s1将石榴汁与辅料混合，加热溶解，均质，灭菌，冷却至室温得到混合液；
6.s2在混合液中接种植物乳杆菌，在37℃，100rpm条件下恒温震荡发酵24～28h，得到发酵石榴汁。
7.进一步的，步骤s2中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437活化后的发酵菌液。
8.进一步的，步骤s2中，所述植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437的发酵菌液活化后od
600
大于1。
9.进一步的，步骤s1中，所述石榴汁的浓度为45％(v/v)～65％(v/v)，所述辅料包括占石榴汁质量0.3～1.5％的酸味剂、占石榴汁质量5～10％的甜味剂，占石榴汁质量0.002％～0.10％稳定剂和占石榴汁质量5％(v/v)～20％(v/v)的纯净水。
10.进一步的，步骤s1中，所述石榴汁选择颜色鲜红、成熟无病斑的石榴制备，将石榴籽粒与饮用水按照质量比1:2混合后破碎，经胶体磨磨浆制成石榴汁果浆，过滤，得到石榴
原汁，稀释得到石榴汁。
11.进一步的，步骤s1中，所述石榴原汁制备过程中加入占石榴汁原汁0.4～0.8％(v/v)的果胶酶和占石榴汁原汁0.3～0.8％(v/v)的维生素c。
12.进一步的，步骤s1中，所述均质采用高压均质机在75℃～80℃,压力为20mpa～25mpa条件下进行均质。
13.进一步的，步骤s1中，所述灭菌为在灭菌锅中100℃～121℃条件下灭菌5min～10min。
14.进一步的，步骤s1中，所述酸味剂为柠檬酸、乳酸或苹果酸；所述甜味剂为葡萄糖、果糖或蔗糖；所述稳定剂为cmc
‑
na、黄原胶或瓜尔豆胶。
15.本发明还提供一种具有降血压功能的发酵石榴汁，根据上述制备方法制得，所述发酵石榴汁的体外ace抑制活性范围为63％～68.04％。
16.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
17.本发明提供一种具有降血压功能的发酵石榴汁及其制备方法，采用植物乳杆菌lactobacillus plantarum subsp.1.243发酵石榴汁，能够显著提高石榴汁中植物多酚生物转化，能够有效提升石榴汁的ace抑制活性降低，提高多酚生物利用度和生物可及度，同时兼具改善石榴汁口感香气，在胃肠道发挥益生菌整肠消化功能。
18.本发明通过质谱技术明确了植物乳杆菌发酵石榴汁后多酚组分，采用分子对接技术明确这些化合物可以与ace活性位点结合，导致ace失活，最终实现降低血压的目的。同时本发明的体外试验采用日本ace
‑
kit
‑
wst试剂盒验证了发酵石榴汁和其中活性组分对的ace抑制活性为63％～68.04％，本发明得到石榴汁有较好的降血压的功效。
附图说明
19.图1石榴汁多酚化合物与ace互作机制图；
20.图2石榴汁发酵前后hplc图，
21.发酵前石榴汁hplc图谱中1.没食子酸；2.α
‑
安石榴苷；3.β
‑
安石榴苷；4.儿茶素；5.绿原酸；6.咖啡酸；7.表儿茶素；8.阿魏酸；9.鞣花酸；
22.发酵后石榴汁hplc图谱中1.没食子酸；2.α
‑
安石榴苷；3.β
‑
安石榴苷；4.儿茶素；5.绿原酸；6.咖啡酸；7.表儿茶素；8.阿魏酸；9.鞣花酸；
23.图3石榴汁主成分的ace抑制活性；
24.图4石榴汁活性成分与ace分子对接图，其中，a)为没食子酸与ace的活性位点结合；b)为咖啡酸与ace的活性位点结合；图4c)为表儿茶素与ace的的活性位点结合；
25.图5石榴汁发酵前后的ace抑制活性；
26.图6石榴汁发酵前后感官分析；
27.图7石榴汁发酵前后胃肠道ace抑制活性；
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
29.本发明提供一种具有降血压功能的发酵石榴汁制备方法，包括如下步骤，
30.步骤1石榴汁原汁制备：选择颜色鲜红、成熟无病斑的石榴(陕西临潼净皮甜石
榴)，清洗去皮，除隔膜,取籽粒与饮用水按照质量比1:2混合后破碎，经胶体磨磨浆制成石榴汁果浆，过滤，得到石榴汁原汁；
31.制备石榴汁原汁的过程中加入占石榴汁原汁0.4～0.8％(v/v)的果胶酶以提高石榴的出汁率和澄清度，同时再加入占石榴汁原汁0.3～0.8％(v/v)的vc护色。
32.步骤2调配：将石榴汁原汁加纯净水稀释得到浓度为45～65％(v/v)的石榴汁，在石榴汁中加入占石榴汁质量0.3～1.5％的酸味剂、5～10％甜味剂，0.002％～0.10％的稳定剂混合后，加入占石榴汁质量5％(v/v)～20％(v/v)的纯净水，在40～55℃水浴加热3分钟促进溶解得到混合液。
33.优选的，酸味剂为柠檬酸、乳酸或苹果酸；
34.优选的，甜味剂为葡萄糖、果糖或蔗糖；
35.优选的，稳定剂为cmc
‑
na、黄原胶或瓜尔豆胶。
36.步骤3均质：将混合液通过高压均质机在75～80℃,压力20～25mpa条件下进行均质。
37.步骤4灭菌：石榴汁在灭菌锅中100～121℃条件下灭菌5～10min，灭菌后自然冷却到室温待用。
38.步骤5发酵：在发酵罐中以1～3％的比例接种od
600
大于1的植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437活化后的发酵菌液，接种后在恒温振荡培养箱中37℃，100rpm发酵24～28h，得到发酵石榴汁，采用日本ace
‑
kit
‑
wst试剂盒测定发酵石榴汁和其中活性组分的ace抑制活性，得到的体外ace抑制活性范围为63％～68.04％。
39.步骤6后处理：将发酵完成的石榴汁进行过滤、均质、灌装、包装，其成品放入4℃的冷库冷藏。
40.实施例1
41.步骤1原料处理：选择颜色鲜红、成熟无病斑的石榴，清洗去皮，除隔膜,取籽粒与饮用水按照质量比1:2混合后破碎，经胶体磨磨浆制成石榴汁果浆，过滤，过程中加入0.6％的果胶酶以提高石榴的出汁率和澄清度，同时再加入0.5％的vc护色。
42.步骤2调配：在石榴汁中按比例加入辅料，并按质量配比混合:石榴汁原汁加纯净水稀释至浓度为45％(v/v)，酸味剂(柠檬酸)0.3％，甜味剂(葡萄糖)5％，稳定剂(cmc
‑
na 0.10％)，加入纯净水20％(v/v)，45℃水浴加热3分钟促进溶解，以达到适宜口感。
43.步骤3均质：将混合液通过高压均质机在75℃,压力20mpa条件下进行均质。
44.步骤4灭菌：石榴汁在灭菌锅中100℃条件下灭菌10分钟，灭菌后自然冷却到室温待用。
45.步骤5发酵：在发酵罐中以1％的比例接种充分活化后的植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437菌液(od
600
大于1)，在恒温振荡培养箱(37℃，100rpm)中发酵24h左右，得到发酵石榴汁。测得发酵石榴汁的ace抑制率为68.04％。
46.步骤6后处理：将发酵完成的石榴汁进行过滤、均质、灌装、包装，其成品放入4℃的冷库冷藏。
47.实施例2
48.步骤1原料处理：选择颜色鲜红、成熟无病斑的石榴，清洗去皮，除隔膜,取籽粒与饮用水按照质量比1:2混合后破碎，经胶体磨磨浆制成石榴汁果浆，过滤，过程中加入0.4％
的果胶酶以提高石榴的出汁率和澄清度，同时再加入0.8％的vc护色。
49.步骤2调配：在石榴汁中按比例加入辅料，并按质量配比混合:石榴汁原汁加纯净水稀释至浓度为55％(v/v)，酸味剂(乳酸)0.8％，甜味剂(果糖)7％，稳定剂(黄原胶0.08％)，加入纯净水10％(v/v)，40℃水浴加热3分钟促进溶解，以达到适宜口感。
50.步骤3均质：将混合液通过高压均质机在78℃,压力22mpa条件下进行均质。
51.步骤4灭菌：石榴汁在灭菌锅中110℃条件下灭菌8分钟，灭菌后自然冷却到室温待用。
52.步骤5发酵：在发酵罐中以2％的比例接种充分活化后的植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437菌液(od
600
大于1)搅拌混匀，在恒温振荡培养箱(37℃，100rpm)中发酵26h左右，得到发酵石榴汁。测得发酵石榴汁的ace抑制率为65.45％。
53.步骤6后处理：将发酵完成的石榴汁进行过滤、均质、灌装、包装，其成品放入4℃的冷库冷藏。
54.实施例3
55.步骤1原料处理：选择颜色鲜红、成熟无病斑的石榴，清洗去皮，除隔膜,取籽粒与饮用水按照质量比1:2混合后破碎，经胶体磨磨浆制成石榴汁果浆，过滤，过程中加入0.8％的果胶酶以提高石榴的出汁率和澄清度，同时再加入0.3％的vc护色。
56.步骤2调配：在石榴汁中按比例加入辅料，并按质量配比混合:石榴汁原汁加纯净水稀释至浓度为65％(v/v)，酸味剂(苹果酸)1.5％，甜味剂(蔗糖)10％，稳定剂(瓜尔豆胶0.002％)，加入纯净水5％(v/v)，55℃水浴加热3分钟促进溶解，以达到适宜口感。
57.步骤3均质：将混合液通过高压均质机在80℃,压力25mpa条件下进行均质。
58.步骤4灭菌：石榴汁在灭菌锅中121℃条件下灭菌5分钟，灭菌后自然冷却到室温待用。
59.步骤5发酵：在发酵罐中以3％的比例接种充分活化后的植物乳杆菌l.plantarum subsp.1.2437菌液(od
600
大于1)搅拌混匀，在恒温振荡培养箱(37℃，100rpm)中发酵28h左右，得到发酵石榴汁。测得发酵石榴汁的ace抑制率为63％。
60.步骤6后处理：将发酵完成的石榴汁进行过滤、均质、灌装、包装，其成品放入4℃的冷库冷藏。
61.图1为石榴汁多酚化合物与ace互作机制图，其中箭头所指为酚类化合物，s1，s2，s1’和s2’分别为ace活性位点。
62.图2为石榴汁发酵前后hplc图(多酚组分变化)
63.发酵前hplc分析其具体组成为：没食子酸1576.14ug/ml，安石榴苷6371.17ug/ml(包括安石榴苷
‑
α和安石措苷
‑
β)，儿茶素3532.77ug/ml，绿原酸876.11ug/ml，咖啡酸305.60ug/ml，表儿茶素575.77ug/ml，阿魏酸185.88ug/ml，鞣花酸33.10ug/ml。
64.发酵后hplc分析其具体组成为：没食子酸1515.40ug/ml，安石榴苷6198.38ug/ml(包括安石榴苷
‑
α和安石措苷
‑
β)，儿茶素3462.97ug/ml，咖啡酸306.67ug/ml，绿原酸930.15ug/ml，表儿茶素707.96ug/ml，阿魏酸184.61ug/ml，鞣花酸118.49ug/ml。经过对比发现，石榴汁发酵后绿原酸、咖啡酸含量略有提高，表儿茶素和鞣花酸含量显著提高，安石榴苷含量显著下降，分析其原因应是植物乳杆菌发酵产生的酶将其分解生成其他产物。
65.图3石榴汁主成分ace抑制活性，从图中可以看出ace抑制活性为ic
50
值(2.54ug/
ml)时石榴多酚中各单体的ace抑制活性如下：安石榴苷(41.53％)＞表儿茶素(35.59％)＞儿茶素(32.20％)＞绿原酸(31.36％)＞没食子酸(25.00％)＞鞣花酸(18.52％)。此前有研究发现羟基，羧基和丙烯酸基团在酚酸结构中的总体贡献是其抑制ace能力的关键决定因素。在绿原酸的结构中发现了丙烯酸基团，绿原酸因其结构中的羟基数量众多可能成为较为有效的ace抑制剂。没食子酸等能够通过它们的羧酸酯基团与活性部位的锌离子相互作用，此外没食子酸具有五个氢键受体基团，显示出较高的活性。表儿茶素能够通过7位的a环羟基与ace结合位点残基形成分子相互作用，是其具有较高ace抑制活性的重要因素。
66.图4石榴汁活性成分与ace分子对接图，通过分子对接技术发现图4a)为没食子酸与ace的zn
2
离子、s1(tyr523)和s2(his353,lys511)活性位点结合；图4b)为咖啡酸与ace的zn
2
离子、s1(ala354)和s2(his353)活性位点结合；图4c)为表儿茶素与ace的zn
2
离子和s2(his353)活性位点结合，ace属于二羧肽酶类，活性位点有s1(tyr523,ala354,glu384),s2(gln281,his353,lys511,tyr520),s1’(glu162)和zn
2
。经典ace抑制剂类药物卡托普利的脯氨酸结合s2，甲基结合s1’，巯基和zn
2
配位，使小分子卡托普利在狭窄的活性通道达成动态平衡并嵌入后不再脱离，抑制ace活性，如图4所示石榴汁中的主要多酚化合物都能和ace的活性位点结合发挥抑制作用。
67.图5石榴汁发酵前后ace抑制活性中可以看出，发酵1天的石榴汁的ace抑制活性最高，为68.05％，然后逐渐下降。
68.图6为石榴汁发酵前后感官分析主要包括香气和口感，其中：
69.发酵前后香气物质变化：
70.在发酵前石榴汁鉴定出来的31种挥发性成分中，含有9种醇类(1.67％)、4种烷烃类(80.15％)、4种醛类(3.25％)、4种酮类(0.95％)、4种有机酸类(10.54％)、3种酯类(1.88％)、1种酚类(0.66％)、2种烯烃类物质(0.91％)，其中3
‑
甲基辛烷、乙酸、甲氧基乙酸、辛醛、2
‑
乙基己醇乙酸酯的含量较高。在发酵后石榴汁鉴定出来的50种挥发性成分中，含有8种醇类(19.12％)、10种烷烃类(11.84％)、11种醛类(41.5％)、3种酮类(1.67％)、1种有机酸类(0.44％)、8种酯类(6.82％)、3种酚类(1.32％)、3种烯烃类(2.02％)、2种其它物质(14.84％)，其中甲氧基苯肟、壬醛、辛醛、异辛醇、庚醛的含量较高。从发酵前后香气物质种类变化表可以看出各类香气物质含量发生明显变化，其中醇类、醛类、酯类、烯烃类、酚类等物质种类及含量明显增高，烷烃类物质明显下降，其中共有成分为柠檬烯、辛醛2
‑
乙基己醇乙酸酯、2
‑
癸烯
‑1‑
醇、壬醛。
71.表1未发酵石榴汁挥发性香味成分表
72.73.[0074][0075]
表2发酵后石榴汁挥发性香味成分表
[0076]
[0077]
[0078][0079]
发酵前后口感变化:
[0080]
电子鼻对石榴汁气味分析显示其差异主要存在于甲烷类、硫化物、voc、酒精、有机溶剂、胺类等化合物上，第一主成分(pc1)和第二主成分(pc2)贡献率累计98.23％，样品判别指数为0.7301，主成分在不同领域分界明显，说明电子鼻能够区分发酵前后不同石榴汁样品。电子舌对发酵前后不同石榴汁滋味分析显示其差异主要存在于主成分分析累计79.44％，样品判别指数为0.9778，说明电子舌能准确区分发酵前后不同石榴汁样品。
[0081]
图7为石榴汁发酵前后胃肠道ace抑制活性，可以看出从石榴汁中分离出的酚类化合物已被证明是体外有效的ace抑制剂。尽管这些化合物的溶解度差，并且随后限制了其生物利用度，但对自发性高血压大鼠(shr)进行的不同实验证实，酚类化合物(例如槲皮素，阿魏酸和单宁酸)在体内具有降血压的作用。活性化合物在胃肠道消化后需要保持活性，并成功地通过肠壁运输到血液中以产生生理功能。酚类化合物的生物利用度以及摄入后改善其效力的可能策略是其在食品市场中发展为ace抑制剂的挑战。经过模拟胃肠液发现石榴汁
发酵24h后ace抑制活性由发酵前的43.86％提高到68.05％，提高了24.19％。模拟胃液消化后石榴汁ace活性由发酵前的53.98提高到65.34％，提高了11.36％，肠液消化后ace活性由发酵前的61.08％提高到73.01％，提高了11.93％。