细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体、应用和载药体系的制作方法

1.本发明涉及超分子化学，超分子材料和细胞制剂技术领域，具体而言，涉及细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体、应用和载药体系。


背景技术：

2.近年来仿生纳米医学，特别是细胞载体这一新兴领域的快速发展，为改善人工合成制剂的生物兼容性提供了一个独特的应对策略。然而，目前细胞载体制剂的制备通常需先提取内源性细胞，其规模化制备受限于内源性细胞的提取量，然后在体外需要经过复杂的处理步骤，可能会影响细胞载体的活性和生理功能，且内源性载体细胞只对应于单一宿主个体，在应用于其他个体时仍会产生排异反应。因此，积极开发可特异性识别体内细胞并在体内原位构建细胞载体制剂是仿生纳米医学研究领域和临床应用上亟待解决的问题。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体、应用和载药体系。
5.本发明是这样实现的:
6.本发明提供一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，其包括第一部分和第二部分，且第一部分为细菌外膜囊泡包被的主体分子修饰的纳米粒，第二部分为细菌外膜囊泡包被的客体分子修饰的纳米粒，在被细胞吞噬后，细菌外膜囊泡发生降解，暴露出主体分子修饰的纳米粒和客体分子修饰的纳米粒，通过主客体作用在免疫胞内形成超分子纳米粒聚集体。
7.本发明还提供一种上述细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体的制备方法，其包括：将细菌外膜囊泡分别包被大环主体分子修饰的纳米粒和对应客体分子修饰的纳米粒，再将细菌外膜囊泡包被的修饰有主体分子的纳米粒子和细菌外膜囊泡包被的修饰有客体分子的纳米粒混合，即得。
8.本发明还提供一种上述细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体在制备靶向药物制剂中的应用。
9.本发明还提供一种载药体系，载体体系包括上述的细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体和药物，药物装载在纳米粒中。
10.本发明具有以下有益效果:
11.本发明提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体、应用和载药体系。基于细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，可特异性识别体内免疫细胞，并进一步在胞内构建主客体作用介导的胞内纳米粒聚集体。内源性免疫细胞载体可回应病灶组织(如肿瘤)的炎性特点，实现胞内纳米粒聚集体的搭便车式递送，并抑制免疫细胞的外排现象。本发明提供的主客体作用介导的体内超分子纳米粒组装体的制备方法具有制备工艺简单、快速和
普适性的优势，可克服细胞载体制剂的构建及体内递送过程所面临的挑战。此外，还提供了一种载药体系，可以实现靶向药物治疗的载药。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
13.图1为本发明实施例1的β
‑
环糊精修饰的金纳米粒的透射电镜图；
14.图2为本发明实施例1的大肠杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的金纳米粒的透射电镜图；
15.图3为本发明实施例1的金纳米粒在巨噬细胞内的超分子组装聚集透射电镜图。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
17.本发明的目的在于提供细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体、应用和载药体系，以解决上述技术问题。
18.本发明是这样实现的：
19.第一方面，本发明实施例提供一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，其包括第一部分和第二部分，且第一部分为细菌外膜囊泡包被的主体分子修饰的纳米粒，第二部分为细菌外膜囊泡包被的客体分子修饰的纳米粒，在被细胞吞噬后，细菌外膜囊泡发生降解，暴露出主体分子修饰的纳米粒和客体分子修饰的纳米粒，通过主客体作用在免疫胞内形成超分子纳米粒聚集体。
20.近年来仿生纳米医学，特别是细胞载体这一新兴领域的快速发展，为改善人工合成制剂的生物兼容性提供了一个独特的应对策略，它将天然生物材料(例如细胞)的独特生理功能和人工合成制剂的物理特性相结合，使其在体内伪装成“自我”成分，有利于逃逸网状内皮系统的识别和清除作用，从而提高药物利用率。同时，不同类型的细胞生理功能赋予了相应细胞不同的内在靶向驱动力，可根据疾病的病理特点选择合适类型的细胞作为靶向递送载体。然而，目前细胞载体制剂的制备通常需先提取内源性细胞，其规模化制备受限于内源性细胞的提取量，然后在体外需要经过复杂的处理步骤，可能会影响细胞载体的活性和生理功能，且内源性载体细胞只对应于单一宿主个体，在应用于其他个体时仍会产生排异反应。
21.发明人创造性的提出了体内自组装的搭便车式靶向给药策略，提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，用于体内免疫细胞特异性识别和胞内原位自组装，克服体外细胞载体制备策略的缺陷性，并抑制载体免疫细胞在递送过程中的外排作用。体内免疫细胞作为纳米粒聚集体的内应式载体，发挥“间谍”样作用，回应病灶组织(如肿瘤)的炎
性信号，实现胞内纳米粒聚集体的搭便车式靶向递送。本发明提供的纳米粒可以根据治疗需求进行自适应药物负载，其应用范围广。
22.经体内免疫细胞胞吞作用后，细菌外膜囊泡发生降解，暴露出大环主体分子修饰的纳米粒和客体分子修饰的纳米粒，通过主客体作用在免疫胞内形成超分子纳米粒聚集体。该细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体克服了现有技术需要在体外进行细胞载体制剂的构建及体内递送过程所面临的药物外排现象，细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体不会引发细胞毒性。
23.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细菌外膜囊泡来自为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的外膜囊泡，优选为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的外膜囊泡。
24.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细菌外膜囊泡的粒径为10nm
‑
1000nm。
25.在本发明应用较佳的实施方式中，上述主体分子为大环主体分子，大环主体分子为环糊精(cd)、葫芦脲(cb)、杯芳烃、柱芳烃或冠醚；冠醚可以是双环冠醚、三环冠醚、多环冠醚和杂冠醚中的任意一种。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述客体分子为金刚烷或二茂铁。
27.大环主体分子与客体分子相对应为：客体分子需与主体分子相匹配，即上述大环主体分子与客体分子之间有较高的结合常数，这样有助于提升主客体复合物在体内的稳定性。在其他实施方式中也可以根据需要对客体分子进行置换。
28.在本发明应用较佳的实施方式中，上述大环主体分子与客体分子的摩尔比为1
‑
10：1
‑
10；优选为1:1。大环主体分子与客体分子在上述摩尔比下可以简单快速的实现超分子细胞载体的制备。
29.在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米粒子为脂质体、胶束、纳米凝胶、无机纳米粒和纳米囊中的至少一种。
30.第二方面，本发明实施例提供一种上述细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体的制备方法，其包括：将细菌外膜囊泡分别包被大环主体分子修饰的纳米粒和对应客体分子修饰的纳米粒，再将细菌外膜囊泡包被的修饰有主体分子的纳米粒子和细菌外膜囊泡包被的修饰有客体分子的纳米粒混合，即得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。
31.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细菌外膜囊泡通过脂质体挤出仪或者超声处理包被在纳米粒表面。
32.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细菌外膜囊泡和纳米粒子的质量比为1
‑
10：1
‑
10。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细菌外膜囊泡包被的修饰有主体分子的纳米粒子和细菌外膜囊泡包被的修饰有客体分子的纳米粒的混合比例为1
‑
10：1
‑
10。
34.本发明提供的超分子细胞载体的制备方法，制备工艺简单、快速、具有普适性。
35.第三方面，本发明实施例还提供一种上述细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体在制备靶向药物制剂中的应用。
36.在本发明应用较佳的实施方式中，纳米粒在体内免疫细胞中的聚集方式如下：所述细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒经体内免疫细胞胞吞作用后，细菌外膜囊泡发生降解，暴露出主体分子修饰的纳米粒和客体分子修饰的纳米粒，通过主客体相互作用在免疫胞内形成超分子纳米粒聚集体。
37.第四方面，本发明实施例还提供一种载药体系，载体体系包括细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体和药物，药物装载在纳米粒中。
38.在本发明应用较佳的实施方式中，本发明提供的载药体系可以用于负载抗炎药物、抗生素、抗肿瘤癌症或神经系统疾病的治疗剂。
39.本发明提供的细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，可用于体内免疫细胞特异性识别和胞内原位自组装，实现纳米粒在体内免疫细胞中的聚集。药物可以装载在纳米粒中，也就是作为纳米药物被体内免疫细胞拉着靶向递送，其释放机制也主要涉及到纳米粒本身的性质。
40.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
41.本发明以下实施例中，原材料来源、组分、制备和实验方法与对比例相同。
42.实施例1
43.本实施例提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体及其制备方法，本实施例中，细菌为大肠杆菌，金纳米粒购自西安瑞禧生物科技有限公司，dmem培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，巯基
‑
β
‑
环糊精和金刚烷硫醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
44.将金纳米粒分别与巯基
‑
β
‑
环糊精和金刚烷硫醇反应，可制得β
‑
环糊精修饰的金纳米粒(如图1)和金刚烷修饰的金纳米粒。
45.收集大肠杆菌外膜囊泡，将大肠杆菌外膜囊泡与修饰β
‑
环糊精的金纳米粒或者修饰金刚烷的金纳米粒按质量比为1：1进行混合，采用超声法处理可制得大肠杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的金纳米粒(如图2)和大肠杆菌外膜囊泡包被修饰金刚烷的金纳米粒。
46.大肠杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的金纳米粒和大肠杆菌外膜囊泡包被修饰金刚烷的金纳米粒按照质量比1：1进行混合，制得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。
47.将细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体与巨噬细胞共孵育，采用透射电镜观察巨噬细胞内超分子金纳米粒聚集情况。巨噬细胞内超分子金纳米粒聚集体的透射电镜图参照图3所示。
48.实施例2
49.本实施例提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体及其制备方法，本实施例中，细菌为金黄色葡萄球菌，金纳米粒购自西安瑞禧生物科技有限公司，dmem培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，巯基
‑
β
‑
环糊和巯基二茂铁购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
50.将金纳米粒分别与巯基
‑
β
‑
环糊和巯基二茂铁反应，可制得β
‑
环糊精修饰的金纳米粒和二茂铁修饰的金纳米粒。
51.收集金黄色葡萄球菌外膜囊泡，将金黄色葡萄球菌外膜囊泡与修饰β
‑
环糊精的金纳米粒或者修饰二茂铁的金纳米粒按质量比为5：1进行混合，采用超声法处理可制得金黄色葡萄球菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的金纳米粒和金黄色葡萄球菌外膜囊泡包被修饰二茂铁的金纳米粒。
52.金黄色葡萄球菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的金纳米粒和金黄色葡萄球菌外膜囊泡包被修饰二茂铁的金纳米粒按照质量比1：5进行混合，制得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。
53.实施例3
54.本实施例提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体及其制备方法，本实施例中，细菌为双歧杆菌，硫化铜纳米粒购自西安瑞禧生物科技有限公司，dmem培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，巯基
‑
β
‑
环糊和巯基二茂铁购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
55.将硫化铜纳米粒分别与巯基
‑
β
‑
环糊和巯基二茂铁反应，可制得β
‑
环糊精修饰的硫化铜纳米粒和二茂铁修饰的硫化铜纳米粒。
56.收集双歧杆菌外膜囊泡，将双歧杆菌外膜囊泡与修饰β
‑
环糊精的金纳米粒或者修饰二茂铁的硫化铜纳米粒按质量比为1：8进行混合，采用超声法处理可制得双歧杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的硫化铜纳米粒和双歧杆菌外膜囊泡包被修饰二茂铁的硫化铜纳米粒。
57.双歧杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的硫化铜纳米粒和双歧杆菌外膜囊泡包被修饰二茂铁的硫化铜纳米粒按照质量比2：5进行混合，制得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。
58.实施例4
59.本实施例提供了一种细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体及其制备方法，本实施例中，细菌为乳酸杆菌，介孔二氧化锰纳米粒购自西安瑞禧生物科技有限公司，dmem培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，巯基
‑
β
‑
环糊和巯基金刚烷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
60.将介孔二氧化锰纳米粒分别与巯基
‑
β
‑
环糊和巯基金刚烷反应，可制得β
‑
环糊精修饰的介孔二氧化锰纳米粒和金刚烷修饰的介孔二氧化锰纳米粒。
61.收集乳酸杆菌外膜囊泡，将乳酸杆菌外膜囊泡与修饰β
‑
环糊精的介孔二氧化锰纳米粒或者修饰二茂铁的介孔二氧化锰纳米粒按质量比为1：5进行混合，采用超声法处理可制得乳酸杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的介孔二氧化锰纳米粒和乳酸杆菌外膜囊泡包被修饰金刚烷的介孔二氧化锰纳米粒。
62.乳酸杆菌外膜囊泡包被修饰β
‑
环糊精的介孔二氧化锰纳米粒和乳酸杆菌外膜囊泡包被修饰金刚烷的介孔二氧化锰纳米粒按照质量比3：7进行混合，制得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。
63.对比例1
64.与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：非细菌外膜囊泡包被，而是其他的物质包被，结果为其他的物质包被的金纳米粒前体在被细胞摄入后，该包被层无法降解，从而导致金纳米粒无法在细胞内进行超分子组装。
65.对比例2
66.与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：主客体分子的比例为100：1，结果为在被细胞摄入后，由于主客体分子比例过高，金纳米粒无法在细胞内进行充分的超分子组装，从而无法形成较大的金纳米粒聚集体。
67.对比例3
68.与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：主客体分子的比例为100：1，结果为在被细胞摄入后，由于主客体分子比例过高，硫化铜纳米粒无法在细胞内进行充分的超分子组
装，从而无法形成较大的硫化铜纳米粒聚集体。
69.对比例4
70.与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于主客体分子的比例为1：100：结果为在被细胞摄入后，由于主客体分子比例过高，介孔二氧化锰纳米粒无法在细胞内进行充分的超分子组装，从而无法形成较大的介孔二氧化锰纳米粒聚集体。
71.对本发明实施例和对比例的结果进行分析，可得到以下的结论：纳米粒包被材料会影响细胞摄入后在胞内的降解过程，如果纳米粒包被层不被细胞降解，则不能暴露出超分子纳米粒前体，从而无法形成超分子组装体。主客体分子的比例须在合理范围内(1
‑
10：1
‑
10)，过高或者过低的比例均会导致纳米粒无法在细胞内进行充分的超分子组装，从而无法形成较大的纳米粒聚集体。
72.综上，本发明实施例的细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体，可特异性识别体内免疫细胞，并进一步在胞内构建主客体作用介导的胞内纳米粒聚集体，可实现胞内纳米粒聚集体的搭便车式递送，并抑制免疫细胞的外排现象；该细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体是将细菌外膜囊泡分别包被大环主体分子修饰的纳米粒和对应客体分子修饰的纳米粒；将细菌外膜囊泡包被的修饰有主体分子的纳米粒子和细菌外膜囊泡包被的修饰有客体分子的纳米粒混合后即得细菌外膜囊泡包被的超分子纳米粒前体。制备工艺简单、快速和具有普适性，可克服细胞载体制剂的构建及体内递送过程所面临的挑战。
73.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。