一种恰玛古抗肿瘤成分的提取方法与流程

1.本发明涉及植物天然提取物技术领域，尤其涉及一种恰玛古抗肿瘤成分的提取方法。


背景技术：

2.恰玛古为十字花科芸苔属二年生草本植物，学名为芜菁(brassica rapa l.)。随着对恰玛古的研究不断深入，不同类别的化学成分被分离获得，对其药理作用的认识也不断提升。
3.恰玛古作为中国新疆常用的药食兼用植物，其硫代葡萄糖苷、黄酮类、挥发油和多糖等多种活性成分，可发挥抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降血糖等多种生物活性。现有技术多采用加热及超声醇提的方式对抗肿瘤活性成分进行提取，醇提的温度通常为80℃以上，且醇提后需要进行多步浓缩才能获得粗产物，整体提取步骤复杂，所需时间长，提取温度高。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种恰玛古抗肿瘤活性成分的提取方法。本发明提供的提取方法步骤简单，提取时间短，提取温度低，且提取的抗肿瘤成分活性高。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种恰玛古抗肿瘤成分的提取方法，包括以下步骤：
7.采用石油醚对恰玛古粉末进行超声提取和浸提，浸提后直接获得粗恰玛古抗肿瘤成分；
8.所述超声提取的时间≤20min，所述浸提的次数≤3次，单次所述浸提的时间≤2h；所述超声提取的温度≤60℃；所述浸提的温度为≤60℃
9.优选的，所述超声提取的时间为15～20min；所述浸提的次数为1～3次，单次所述浸提的时间为1～2h；所述超声提取的温度为50～60℃；所述浸提的温度为50～60℃。
10.优选的，所述恰玛古粉末和石油醚的料液比为1：5～10g/ml。
11.优选的，浸提后，还包括对所述粗恰玛古抗肿瘤成分进行层析分离。
12.优选的，所述层析分离的洗脱方式为梯度洗脱。
13.优选的，所述梯度洗脱包括：依次使用石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:0、9:1、8:2和7:3的溶剂进行洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比为8:2和7:3时的洗脱组分为恰玛古抗肿瘤成分。
14.优选的，所述梯度洗脱在硅胶柱中进行，所述硅胶的粒径为50～150μm，所述硅胶柱的柱体体积为20～100cm3。
15.优选的，所述粗恰玛古抗肿瘤成分与硅胶的质量比为1：1～6。
16.优选的，所述梯度洗脱中，每个梯度的洗脱量为1～2个硅胶柱的柱体体积。
17.优选的，所述恰玛古粉末为恰玛古地下部分的粉末，所述恰玛古粉末的粒径为250
～850μm。
18.本发明提供了一种恰玛古抗肿瘤成分的提取方法，包括以下步骤：采用石油醚对恰玛古粉末进行超声提取和浸提，获得粗恰玛古抗肿瘤成分；所述超声提取的时间≤20min，所述浸提的时间≤2h；所述超声提取的温度≤60℃；所述浸提的温度为≤60℃。本发明直接采用用极性小的剂石油醚作为提取溶剂一步提取粗恰玛古抗肿瘤成分，步骤简单，提取时间短，提取温度低。进一步地，本发明采用层析分离的方式对粗恰玛古抗肿瘤成分进行进一步提纯，得到活性更好的恰玛古抗肿瘤成分。本发明实施例表明，采用本发明提取方法得到的抗肿瘤成分能够有效抑制人肺癌a549细胞和小鼠肺癌llc细胞的活性。
附图说明
19.图1为粗恰玛古抗肿瘤成分以及恰玛古醇提石油醚萃取物对人肺癌a549细胞活性的抑制结果图；
20.图2为粗恰玛古抗肿瘤成分以及恰玛古醇提乙酸乙酯萃取物对人肺癌a549细胞活性的抑制结果图；
21.图3为粗恰玛古抗肿瘤成分硅胶柱层析分离tlc结果图；
22.图4为粗恰玛古抗肿瘤成分不同梯度洗脱组分对人肺癌a549细胞活性的抑制结果图；
23.图5为粗恰玛古抗肿瘤成分编号为23～25洗脱组分对人肺癌a549细胞形态改变的结果图；
24.图6为粗恰玛古抗肿瘤成分编号为23～25洗脱组分对人肺癌a549细胞和小鼠肺癌llc细胞活性的抑制结果图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
26.本发明提供了一种恰玛古抗肿瘤成分的提取方法，包括以下步骤：
27.采用石油醚对恰玛古粉末进行超声提取和浸提，浸提后直接获得粗恰玛古抗肿瘤成分；
28.所述超声提取的时间≤20min，所述浸提的次数≤3次，所述单次浸提的时间≤2h；所述超声提取的温度≤60℃；所述浸提的温度为≤60℃。
29.本发明采用石油醚对恰玛古粉末进行超声提取和浸提，浸提后直接获得粗恰玛古抗肿瘤成分。在本发明中，所述恰玛古粉末优选为恰玛古地下部分的粉末，所述恰玛古粉末的粒径优选为250～850μm，更优选为380～550μm。在本发明的实施例中，所述恰玛古粉末的制备方法优选为：将恰玛古地下部分依次进行洗净切片、晾干、粉碎，得到恰玛古粉粹物，将所述恰玛古粉碎物过40目(孔径为425μm)筛，取筛下物，得到恰玛古粉末。
30.在本发明中，所述恰玛古粉末和石油醚的料液比优选为1：5～10g/ml，更优选为1：7～10g/ml，进一步优选为1:10g/ml。
31.在本发明中，所述超声的功率优选为280～320w，更优选为300w；所述超声提取的时间优选为≤20min，更优选为15～20min，进一步优选为20min，超声提取的温度优选为50～60℃，更优选为50～55℃，进一步优选为50℃。本发明采用上述超声时间和温度，有利于
抗肿瘤有效成分从恰玛古粉末中充分释放到溶剂中。
32.在本发明中，所述浸提优选在水浴条件下进行，所述浸提的次数≤3次，优选为1～3次，进一步优选为3次，单次所述浸提的时间≤2h，优选为1～2h，进一步优选为2h，所述浸提的温度≤60℃，优选为50～60℃，进一步优选为55～60℃，更优选为60℃。本发明优选采用上述浸提条件有利于对抗肿瘤有效成分进行充分提取。
33.得到粗恰玛古抗肿瘤成分后，本发明优选对所述粗恰玛古抗肿瘤进行层析分离以富集抗肿瘤成分。在本发明中，所述层析分离用装置优选为硅胶柱，所述硅胶柱中硅胶的粒径优选为50～150μm，更优选为75～150μm，进一步优选为75μm，所述硅胶柱的柱体体积优选为20～100cm3，更优选为50～80cm3，进一步优选为50cm3；所述层析分离的洗脱方法优选为梯度洗脱。在本发明中，在进行梯度洗脱前优选将粗恰玛古抗肿瘤成分用石油醚溶解，再与硅胶进行拌样混合。在本发明的实施例中，所述粗恰玛古抗肿瘤成分和石油醚的质量比优选为1:10，与硅胶拌样后，本发明优选将拌样后的硅胶在60℃水浴下蒸发掉石油醚，使粗恰玛古抗肿瘤成分完全被硅胶吸附。在本发明中，所述粗恰玛古抗肿瘤成分与硅胶的质量比优选为1：1～6，更优选为1：2～5，进一步优选为1:3，本发明优选将粗恰玛古抗肿瘤成分与硅胶的质量比控制在上述范围内有利于硅胶充分吸附石油醚中的抗肿瘤有效成分，且不会增加后续洗脱的工作量。
34.在本发明中，所述梯度洗脱优选包括：依次使用石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:0、9:1、8:2和7:3的溶剂进行洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比为8:2和7:3时的洗脱组分为恰玛古抗肿瘤成分。本发明优选采用上述梯度的溶剂进行洗脱有利于恰玛古抗肿瘤成分的富集，提高提取物的抗肿瘤活性。在本发明中，将所述梯度洗脱中，每个梯度的洗脱量优选为1～2个硅胶柱的柱体体积，进一步优选为1～1.5个硅胶柱的柱体体积，更优选为1.5个硅胶柱的柱体体积。在本发明的实施例中，优选每隔8ml收集一个样品。
35.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
36.实施例1
37.将恰玛古地下部分粉碎，过40目筛，收集筛下物，得到恰玛古粉末。将恰玛古粉末加入石油醚中，调整料液比为1:10g/ml，充分混匀后，在50℃下，以300w的功率进行超声提取，超声提取20min后，将含有恰玛古粉末的石油醚溶液置于60℃水浴锅中，恒温浸提3次，每次2h。每次浸提结束后，进行固液分离，收集上清液，将剩余的固体和石油醚按照之前的料液比继续混合在60℃的水浴条件下浸提2h，提取3次结束后，将上清液合并，旋蒸浓缩，冻干获得粗恰玛古抗肿瘤成分(brassica rapa l.petroleum ether extract，brpe)。
38.对比例1
39.将恰玛古粉末加入体积分数为80％乙醇水溶液中，调整料液比为1:10g/ml，充分混匀后，在50℃下，以300w的功率进行超声提取，超声提取20min后，将含有恰玛古粉末的乙醇溶液放置在60℃水浴锅中，恒温浸提3次，每次2h。每次浸提结束后，进行固液分离，收集上清液，将剩余的固体和体积分数为80％乙醇水溶液继续混合在60℃水浴锅中浸提2h，提取3从结束后，将上清液合并，旋蒸浓缩至无乙醇味，冻干获得恰玛古80％醇提物。使用蒸馏水溶解恰玛古80％醇提物，然后先用石油醚萃取醇提物，萃取3次后，收集石油醚的萃取物，将石油醚萃取剩余的溶液采用乙酸乙酯进行萃取，萃取3次后，收集乙酸乙酯的萃取物。将每种溶剂萃取得到的物质依次命名为石油醚萃取部位(bree
‑
pe)和乙酸乙酯萃取部位
(bree
‑
ea)。
40.采用mtt法同时比较brpe、bree
‑
pe和bree
‑
ea的抗肿瘤活性。具体为：选择对数生长期的肺癌细胞，按照每孔5
×
103个细胞加入96孔板。每孔加入不同浓度的brpe、bree
‑
pe和bree
‑
ea，每组设置6个重复孔，培养24h，离心后，弃去上清液，每孔添加100μl mtt(0.5mg/ml)，在37℃下避光孵育4h。离心后，弃去上清液，每孔加入200μl dmso，用微量振荡器在室温环境下振荡5～10min，然后使用酶标仪检测各重复孔在490nm处的od值。
41.细胞生存指数(cell viability)(％)＝(药物处理组od值/对照组od值)
×
100％
42.其中，空白对照组(以下简称control组)采用无药物培养基处理a549细胞。
43.检测结果见图1和图2。
44.图1为brpe和bree
‑
pe的对比结果，图2为brpe和bree
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ea的对比结果。其中，溶剂对照组(以下简称dsmo组)和阳性对照组(以下简称cisplatin组)分别采用0.6％的二甲基亚砜和40μg/ml的顺铂处理a549细胞。图1和图2的数据均采用单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，处理组与control组比较得出。从图1可以看出，brpe及bree
‑
pe在400、600μg/ml浓度下均可以显著抑制a549细胞的增殖。在400μg/ml浓度下，brpe对a549细胞的抑制活性比bree
‑
pe更好，从图2可以看出，brpe同bree
‑
ea相比，brpe的抗肺癌活性更好。图1和图2的结果均表明本发明采用石油醚可以直接从恰玛古中直接提取出抗癌活性较高的组分，有利于提取工艺的简化。
45.实施例2
46.采用硅胶柱层析的方法进一步分离及富集brpe抗肺癌活性成分。将实施例1制备得到的brpe采用石油醚在料液比为1:10的条件下溶解，将溶解后的混合物以brpe和硅胶的质量比为1:3的比例加入到200目的硅胶中进行拌样，拌样后在60℃的水浴条件下蒸干石油醚，得到完全吸附brpe的硅胶，将硅胶制备成硅胶柱，柱高为14cm，柱体积为50cm3。依次按照石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7和2:8的混合液进行洗脱。每个洗脱剂梯度洗脱1.5个硅胶柱的柱体体积，每隔8ml采用接样瓶收集一个样品，并依次对接样瓶进行编号，共收集72个样品，收集的样品结果见图3，从图3可以看出，设置上述洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯的比例以及洗脱顺序，可以将brpe抗肺癌活性成分有效地分离出来，便于进行富集。
47.将brpe以及编号为20～22、23～25、26～28、54～55、56～58的样品对应的洗脱组分分别配置成200ug/ml和400ug/ml的水溶液加入人肺癌a549细胞，处理24h。其中control组采用无药物培养基处理，dsmo组和cisplatin组分别采用0.8％的二甲基亚砜和40μg/ml的顺铂处理a549细胞。数据采用单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，处理组与control组比较得出。处理结果见图4。从图4可以看出，brpe和23～25的洗脱组分对于人肺癌细胞a549均有良好的抑制作用。其中，23～25的样品对应石油醚和乙酸乙酯的体积比为8:2和7:3时的洗脱组分。
48.将23～25的样品对应的洗脱组分分别配置成100、200和400ug/ml的溶液处理人肺癌细胞a549和小鼠肺癌细胞llc，处理24h后，dsmo组和cisplatin组分别采用0.8％的二甲基亚砜和40μg/ml的顺铂处理a549细胞。处理完毕后，采用荧光倒置显微镜的环状光阑phl搭配4倍低倍镜，将焦对准处理后的细胞，然后分别用环状光阑ph1搭配和物镜(10
×
10)观察肺癌细胞的细胞形态，人肺癌细胞a549和小鼠肺癌细胞llc被处理后的形态见图5，从图5
可以看出，与对照组相比，采用本发明抗癌活性组分溶液处理的a549和llc两种肺癌细胞，在形态上发生明显的变化，细胞出现皱缩且形态变圆，细胞的数量减少，表明23～25的样品对应的洗脱组分可以起到有效的抑制肺癌细胞活性的作用。
49.采用mtt法检测23～25的样品对a549和llc两种肺癌细胞的生长抑制作用。分别将50，100，200，400，600μg/ml 23～25的样品处理a549和llc细胞24h，48h和72h，设置无药物培养基处理为control组，实验结果见图6，其中图6左图为23～25的样品对a549细胞活性的抑制效果，右图为23～25的样品对llc细胞活性的抑制效果。图6的数据均采用单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，处理组与control组比较得出。从图6可以看出，23～25的样品对应的洗脱组分可以通过浓度依赖及时间依赖的方式显著抑制肺癌细胞的增殖。
50.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。