一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.肝素前体(heparosan)是一种酸性天然产物多糖，是肝素和乙酰肝素的生物合成的前体多糖。肝素前体的骨架是由d
‑
葡萄糖醛酸(glca)和n
‑
乙酰
‑
α
‑
d
‑
氨基葡萄糖(glcnac)通过α
‑
1,4和β
‑
1,4糖苷键交替连接而成的重复双糖单元组成线性多糖。肝素前体在大肠杆菌k5和多杀性巴氏杆菌等细菌中被生物合成为多糖胶囊。在真核生物中，肝素前体是肝素和硫酸乙酰肝素生物合成的前体，这两种生物分子参与抗凝血，抵抗细菌和病毒的进入，并在血管生成，炎症和癌症的发展中发挥着重要作用，因此生产肝素前体是制备生物工程肝素的第一步。
3.肝素首先从动物肝脏中而得名，主要从牛肺和猪小肠中提取。2008年美国发生的肝素钠污染事件使得肝素的安全生产备受关注。化学酶法合成肝素是利用肝素前体制备有活性的肝素。目前大肠杆菌k5、d型多杀型巴斯德杆菌和副鸡禽杆菌等的荚膜中被发现，大肠杆菌k5是一株致病菌，在生产使用过程中存在风险。大肠杆菌nissle 1917(ecn)是一株益生菌，其血清型为o6:k5:h1，是一株天然产肝素前体又是无毒性安全菌株。
4.因此有必要探索、构建安全高效的微生物细胞工厂，提高肝素前体的产量和质量。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了提高肝素前体的产量和质量，从而探索并构建一株高效的菌株用于肝素前体的生产。
6.为解决上述问题，本发明对工业安全菌株大肠杆菌ecn(eshcherichia coli nissle 1917)进行改造，进一步将肝素前体合成途径中的关键基因galu、ugd和glms、glmm以及glmu进行组合优化，促进肝素前体在重组ecn中的积累表达。大幅度提高了肝素前体的产量。
7.本发明提供了重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌表达葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶galu、udp
‑
葡萄糖脱氢酶ugd、谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶glms、磷酸葡萄糖变位酶glmm和udp
‑
n
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶glmu中的一个或多个，并同时表达β
‑
udp
‑
葡萄糖醛酸糖基转移酶kfic和α
‑
udp
‑
n
‑
乙酰葡萄糖胺糖基转移酶kfia。
8.在一种实施方式中，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶galu来源于枯草芽孢杆菌、兽疫链球菌和/或谷氨酸棒杆菌。
9.在一种实施方式中，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶galu来源于bacillus subtilis 168、streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246和/或corynebacterium glutamicum atcc13032。
10.在一种实施方式中，来源于bacillus subtilis 168的galu的gene id:936797；来
glutamicum atcc13032的glmu的ncbi登录号为np_600171.1；escherichia coli k
‑
12mg1655来源的glmm的gene id:947692。
25.在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以eshcherichia coli nissle 1917为出发菌株。
26.一种生产肝素前体的方法，利用所述重组大肠杆菌转化硫胺素生产肝素前体。
27.在一种实施方式中，将所述重组菌的细胞加入反应体系中，待od
600
＝15
‑
20加入iptg诱导，待反应体系中葡萄糖浓度在4
‑
6g/l时，补加葡萄糖。
28.在一种实施方式中，在35
‑
40℃下培养至反应体系中葡萄糖消耗完结束发酵。
29.本发明提供了所述重组大肠杆菌在制备肝素前体中的应用。
30.本发明的有益效果：
31.(1)本发明的工程菌为天然产肝素前体的益生菌ecn，并且能够合成肝素前体。
32.(2)本发明通过筛选不同来源肝素前体途径基因，通过组合优化能够是肝素前体产量摇瓶水平达到0.8g/l。
33.(3)本发明过表达合酶基因，肝素前体产量在摇瓶水平上达到1.29g/l，上罐发酵优化肝素前体产量达到10g/l。
附图说明
34.图1是重组ecn生产肝素前体代谢途径及相关基因示意图。
35.图2是重组大肠杆菌ecn产肝素前体产量图，不同来源肝素前体途径基因过表达与筛选。
36.图3是重组大肠杆菌ecn产肝素前体产量图，在图2的基础上进行组合筛选，其中glms来源是兽疫链球菌，galu来源是枯草芽孢杆菌，ugd和glmm来源是大肠杆菌k12。
37.图4是重组大肠杆菌ecn产肝素前体产量图，途径基因组合的基础上过表达合酶基因kfiac，其中augm是途径基因galu，ugd和glmm以质粒percs表达；合酶基因kfiac以质粒petduet表达。
具体实施方式
38.材料：
39.1、escherichi coli nissle 1917，escherichia coli k
‑
12mg1655，bacillus subtilis 168，streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246，corynebacterium glutamicum atcc13032和pseudomonas putida kt2440为本实验室保存。
40.2、primestar dna聚合酶、磷酸化酶、dna marker等酶类试剂购自takara(大连)。
41.3、clonexpress一步法定向克隆试剂盒购自vazyme biotech(南京)。
42.4、胶回收试剂盒购自thermo fisher scientific公司。
43.5、质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
44.6、各种分析纯试剂购自国药集团。
45.7、lb固体培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
46.8、lb液体培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
47.9、摇瓶培养培养基(g/l)：kh2po
4 13.5，(nh4)2hpo
4 4.0，柠檬酸1.7，mgso
4 1.4，
thiamine0.1，cacl
2 2.0，znso4.7h2o 2.2，mnso4.4h2o 0.5，feso4·
7h2o 10.0，nab4o7.10h2o 0.02，cuso4.5h2o 1.0，(nh4)6mo7o
24
.4h2o 0.1，d
‑
glucose 20.0，调节ph为7.0
‑
7.2。
48.10、发酵培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，kh2po
4 13.5，(nh4)2hpo
4 4.0，柠檬酸1.7，mgso
4 1.4，thiamine(硫胺素)0.1，cacl
2 2.0，znso4.7h2o 2.2，mnso4.4h2o 0.5，feso4·
7h2o10.0，nab4o7.10h2o 0.02，cuso4.5h2o 1.0，(nh4)6mo7o
24
.4h2o 0.1，d
‑
glucose(d
‑
葡萄糖)20.0，调节ph为7.0
‑
7.2。
49.11、肝素前体产量测量：向50ml玻璃试管中加入1ml硫酸硼砂(4.77g硼砂溶解于500ml浓h2s04)置于冰上，向玻璃试管中加入适当稀释后的样品200μl混匀后在沸水浴15min，置于冰上冷却至室温后加入50μl咔唑试剂(0.625g咔唑溶于500ml无水乙醇)，混匀后煮沸15min.测定530nm波长处的吸光值，用不同浓度(10、20、30、40、50μg ml
‑1)d
‑
葡萄糖醛酸标准品进行相同反应，绘制标准曲线。标准曲线方程：y＝133.41x
‑
6.9236，r2＝0.9971(x，吸光度a
530
；y，样品中葡萄糖醛酸含量(μg ml
‑1))。
50.肝素前体产量计算公式：肝素前体产量(g/l)＝(标准曲线测出的浓度*稀释倍数*2.067)/1000。
51.12、e.coli nissle 1917感受态的制备：
52.(1)配制cacl2溶液：
53.(2)从lb平板上挑取e.coli nissle 1917单菌落，接种于5ml lb液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
54.(3)将菌液按2％转接至含50ml lb液体培养基的250ml摇瓶中，37℃，220rpm培养至od
600
＝0.4
‑
0.6；
55.(4)冰上放置15min，然后离心收集菌体(4000rpm，4℃，10min)；
56.(5)将菌体重悬至冰浴后的cacl2溶液，静置30min后离心(4000rpm，4℃，10min)；
57.(6)弃上清，重新加入1
‑
2ml cacl2溶液，混匀，每管50
‑
100μl分装至1.5ml灭菌离心管中，置于
‑
80摄氏度保存或进行转化。
58.表1实施例中所用引物序列表
59.60.61.[0062][0063]
实施例1：肝素前体合成途径中的关键基因的筛选
[0064]
(1)提取escherichia coli k
‑
12mg1655，bacillus subtilis 168，streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246，corynebacterium glutamicum atcc13032和pseudomonas putida kt2440的基因组，设计引物进行扩增。
[0065]
使用引物ecgalu
‑
f/ecgalu
‑
r，ecugd
‑
f/ecugd
‑
r，ecglms
‑
f/ecglms
‑
r，ecglmm
‑
f/ecglmm
‑
r，ecglmu
‑
f/ecglmu
‑
r，分别扩增出escherichia coli k
‑
12mg1655中的目的基因片段ecgalu、ecugd、ecglms、ecglmm和ecglmu；使用引物bsgalu
‑
f/bsgalu
‑
r，bsugd
‑
f/bsugd
‑
r，bsglms
‑
f/bsglms
‑
r，bsglmm
‑
f/bsglmm
‑
r，bsglmu
‑
f/bsglmu
‑
r，分别扩增出bacillus subtilis 168中的目的基因片段bsgalu、bsugd、bsglms、bsglmm和bsglmu；使用引物segalu
‑
f/segalu
‑
r，seugd
‑
f/seugd
‑
r，seglms
‑
f/seglms
‑
r，seglmm
‑
f/seglmm
‑
r，seglmu
‑
f/seglmu
‑
r，分别扩增出streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246中的目的基因片段segalu、seugd、seglms、seglmm和seglmu；使用引物cggalu
‑
f/cggalu
‑
r，cgugd
‑
f/cgugd
‑
r，cgglms
‑
f/cgglms
‑
r，cgglmm
‑
f/cgglmm
‑
r，cgglmu
‑
f/cgglmu
‑
r，分别扩增出corynebacterium glutamicum atcc13032中的目的基因片段cggalu、cgugd、cgglms、cgglmm和cgglmu；使用引物ptgalu
‑
f/ptgalu
‑
r，ptugd
‑
f/ptugd
‑
r，ptglms
‑
f/ptglms
‑
r，ptglmm
‑
f/ptglmm
‑
r，ptglmu
‑
f/ptglmu
‑
r，分别扩增出pseudomonas putida kt2440中的目的基因片段ptgalu、ptugd、ptglms、ptglmm和ptglmu；
[0066]
(2)提取质粒percs，质粒的氨基酸序列如seq id no.1所示，以质粒为模板，使用引物ecgalu
‑
f/ecgalu
‑
r，ecugd
‑
f/ecugd
‑
r，ecglms
‑
f/ecglms
‑
r，ecglmm
‑
f/ecglmm
‑
r，ecglmu
‑
f/ecglmu
‑
r，bsgalu
‑
f/bsgalu
‑
r，bsugd
‑
f/bsugd
‑
r，bsglms
‑
f/bsglms
‑
r，bsglmm
‑
f/bsglmm
‑
r，bsglmu
‑
f/bsglmu
‑
r，segalu
‑
f/segalu
‑
r，seugd
‑
f/seugd
‑
r，seglms
‑
f/seglms
‑
r，seglmm
‑
f/seglmm
‑
r，seglmu
‑
f/seglmu
‑
r，cggalu
‑
f/cggalu
‑
r，cgugd
‑
f/cgugd
‑
r，cgglms
‑
f/cgglms
‑
r，cgglmm
‑
f/cgglmm
‑
r，cgglmu
‑
f/cgglmu
‑
r，ptgalu
‑
f/ptgalu
‑
r，ptugd
‑
f/ptugd
‑
r，ptglms
‑
f/ptglms
‑
r，ptglmm
‑
f/ptglmm
‑
r，ptglmu
‑
f/ptglmu
‑
r，进行pcr扩增，分别获得在trc启动子表达框处实现线性化的载体percs，能够使得步骤(1)中扩增得到的序列与相应的载体连接；
[0067]
(3)利用一步克隆酶将步骤(1)和(2)获得的片段进行连接，构建成重组质粒pe
‑
ecgalu、pe
‑
bsgalu、pe
‑
segalu、pe
‑
cggalu、pe
‑
ptgalu、pe
‑
ecugd、pe
‑
bsugd、pe
‑
seugd、pe
‑
cgugd、pe
‑
ptugd、pe
‑
ecglms、pe
‑
bsglms、pe
‑
seglms、pe
‑
cgglms、pe
‑
ptglms、pe
‑
ecglmm、pe
‑
bsglmm、pe
‑
seglmm、pe
‑
cgglmm、pe
‑
ptglmm、pe
‑
ecglmu、pe
‑
bsglmu、pe
‑
seglmu、pe
‑
cgglmu、pe
‑
ptglmu；
[0068]
(4)制备e.coli nissle 1917感受态细胞，将步骤(3)上述获得的质粒分别转化到感受态细胞中，通过卡那抗性平板筛选阳性克隆，分别得到含有不同来源的基因的e.coli nissle1917重组菌；
[0069]
(5)将步骤(4)获得的重组菌，分别进行摇瓶水平的培养、并筛选，选取肝素产量高的基因进行组合：将重组菌在lb培养基中培养10h，将菌液添加至发酵体系中使得体系的od
600
＝0.1，培养24h，用4倍体积的乙醇纯化发酵液上清后检测肝素前体产量。
[0070]
筛选结果显示galu(bacillus subtilis 168)，ugd(escherichia coli k
‑
12mg1655)，glms(streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246)，glmm(escherichia coli k
‑
12mg1655)和glmu(escherichia coli k
‑
12mg1655)来源肝素前体产量最高(表2)。
[0071]
表2重组菌的肝素产量
[0072][0073][0074]
实施例2：肝素前体合成途径中的关键基因的组合表达
[0075]
(一)两个基因组合表达菌株的构建
[0076]
根据表2中的结果，选取来源于escherichia coli k
‑
12mg1655的ugd、glmm、glmu；选取bacillus subtilis 168来源的galu(其编码的蛋白的gene id:936797)，来源于streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246的glms，构建质粒percs
‑
galu
‑
ugd，percs
‑
ugd
‑
glms，percs
‑
ugd
‑
glmm,percs
‑
glms
‑
glmm，percs
‑
glmm
‑
glmu。
[0077]
(1)设计引物galu
‑
ugd
‑
f/galu
‑
ugd
‑
r，ugd
‑
glms
‑
f/ugd
‑
glms
‑
r，ugd
‑
glmm
‑
f/ugd
‑
glmm
‑
r，glms
‑
glmm
‑
f/glms
‑
glmm
‑
r，glmm
‑
glmu
‑
f/glmm
‑
glmu
‑
r。以pe
‑
ugd，pe
‑
glms，pe
‑
glmm和pe
‑
glmm为模板扩增片段；
[0078]
(2)将质粒pe
‑
galu，pe
‑
ugd，pe
‑
glms，pe
‑
glmm线性化，利用一步克隆酶与(1)中的片段连接，构建成重组质粒pe
‑
galu
‑
ugd，pe
‑
ugd
‑
glms，pe
‑
ugd
‑
glmm，pe
‑
glms
‑
glmm，pe
‑
glmm
‑
glmu；
[0079]
(3)将步骤(2)构建得到的重组质粒分别转化至e.coli nissle 1917感受态细胞，构建得到重组菌；
[0080]
(4)按照实施例2中的摇瓶发酵方式，将步骤(3)得到的重组菌进行摇瓶发酵，结束后检测肝素前体产量，结果表明glms(streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246)
‑
glmm(escherichia coli k
‑
12 mg1655)产量最高为0.48
±
0.03g/l(表2)。
[0081]
表3两个基因组合重组菌的肝素产量
[0082]
来源基因产量b.subtilis,e.colibsgalu
‑
ecugd0.33
±
0.02g/le.coli,s.equi zooepidemicusecugd
‑
seglms0.24
±
0.05g/le.coliecugd
‑
ecglmm0.20
±
0.03g/ls.equi zooepidemicus,e.coliseglms
‑
ecglmm0.48
±
0.03g/le.coliecglmm
‑
ecglmu0.13
±
0.01g/l
[0083]
(二)三个基因组合表达菌株的构建
[0084]
根据表2中的结果，选取来源于escherichia coli k
‑
12mg1655的ugd、glmm、glmu；选取bacillus subtilis 168来源的galu(其编码的蛋白的gene id:936797)，来源于streptococcus equi zooepidemicus atcc 35246的glms，构建质粒percs
‑
galu
‑
ugd
‑
glms，percs
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm，percs
‑
ugd
‑
glms
‑
glmm，percs
‑
ugd
‑
glmm
‑
glmu和percs
‑
glms
‑
glmm
‑
glmu。
[0085]
(1)设计引物galu
‑
ugd
‑
glms
‑
f/galu
‑
ugd
‑
glms
‑
r，galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
f/galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
r，ugd
‑
glms
‑
glmm
‑
f/ugd
‑
glms
‑
glmm
‑
r，ugd
‑
glmm
‑
glmu
‑
f/ugd
‑
glmm
‑
glmu
‑
r，glms
‑
glmm
‑
glmu
‑
f/glms
‑
glmm
‑
glmu
‑
r，以质粒pe
‑
glms,pe
‑
glmm，pe
‑
glmu为模板扩增片段；
[0086]
(2)将质粒pe
‑
galu
‑
ugd，pe
‑
ugd
‑
glms,pe
‑
ugd
‑
glmm，pe
‑
glms
‑
glmm线性化，利用一步克隆酶与(1)中的片段连接，构建成重组质粒pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glms，pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm，pe
‑
ugd
‑
glms
‑
glmm，pe
‑
ugd
‑
glmm
‑
glmu，pe
‑
glms
‑
glmm
‑
glmu；
[0087]
(3)将步骤(2)构建得到的重组质粒分别转化至e.coli nissle 1917化转感受态细胞，构建得到重组菌；
[0088]
(4)按照实施例2中的摇瓶发酵方式，将步骤(3)得到的重组菌进行摇瓶发酵，结束后检测肝素前体产量，结果表明galu(bacillus subtilis 168)
‑
ugd(escherichia coli k
‑
12mg1655)
‑
glmm(escherichia coli k
‑
12 mg1655)产量最高为0.80
±
0.04g/l(表4)。
[0089]
表4三个基因组合重组菌的肝素产量
[0090]
来源基因产量b.subtilis,e.coli,s.equi zooepidemicusbsgalu
‑
ecugd
‑
seglms0.35
±
0.05g/lb.subtilis,e.colibsgalu
‑
ecugd
‑
seglmm0.80
±
0.04g/le.coli,s.equi zooepidemicusecugd
‑
seglms
‑
ecglmm0.72
±
0.07g/le.coliecugd
‑
ecglmm
‑
ecglmu0.08
±
0.01g/ls.equi zooepidemicus,e.coliseglms
‑
ecglmm
‑
ecglmu0.22
±
0.05g/l
[0091]
实施例3：构建质粒pet
‑
kfia
‑
kfic，pcd
‑
kfia
‑
kfic和pac
‑
kfia
‑
kfic
[0092]
(1)提取escherichia coli nissle 1917(ecn)基因组，设计引物ecnkfiac
‑
f/ecnkfiac
‑
r(扩增得到的核苷酸序列编码的蛋白的genbank:cae55825.1)，以ecn基因组为模板使用引物进行pcr，扩增肝素前体合酶基因(扩增得到的核苷酸序列编码的蛋白的genbank:cae55821.1)；
[0093]
(2)以质粒petduet
‑
1，pcdfduet
‑
1和pacyduet
‑
1为模板，设计引物pet
‑
f/pet
‑
r，pcd
‑
f/pcd
‑
r和pac
‑
f/pac
‑
r，利用pcr将质粒petduet
‑
1，pcdfduet
‑
1和pacyduet
‑
1线性化。利用一步克隆酶将线性化质粒与步骤(1)中相应的片段链接，构建成重组质粒pet
‑
kfiac，pcd
‑
kfiac和pac
‑
kfiac；
[0094]
(3)制备ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm感受态，将上述获得的质粒pet
‑
kfiac，pcd
‑
kfiac和pac
‑
kfiac通过电转转化到ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm感受态中，获得以下工程菌：ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
pet
‑
kfiac，ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
pcd
‑
kfiac，ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
pac
‑
kfiac；
[0095]
(4)将上述三株工程菌通过摇瓶培养，测量肝素前体产量分别为：1.29
±
0.02g/l，0.75
±
0.01g/l，0.68
±
0.01g/l。
[0096]
实施例4：重组菌株ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
kfiac 3l罐发酵优化
[0097]
(1)从
‑
80℃冷冻冰箱里保存的甘油管中取100ul重组大肠杆菌ecn
‑
pe
‑
galu
‑
ugd
‑
glmm
‑
pet
‑
kfiac与50μl摇菌管中，37℃，220rpm培养8
‑
12h后，按照1％的接种量转接到250ml摇瓶中以相同的条件培养8
‑
12h；
[0098]
(2)将步骤(1)中种子转接到3l发酵罐中，待od
600
＝18时加入0.2mm iptg诱导，其间待发酵罐中剩余葡萄糖在3g/l左右时流加700g/l的葡萄糖作为补料，待菌体生长后期不再耗糖时停止流加，等发酵罐中的葡萄糖耗完后测得重组菌od
600
＝268，总共消耗葡萄糖443.69g；
[0099]
(3)随后将步骤(2)中的发酵液与4℃，7000rpm离心5min后取发酵液上清中加3倍体积的乙醇与4℃冰箱中过夜醇沉，随后通过7000rpm离心15min收取沉淀将乙醇晾晒挥发后加入相同体积的水混合均匀；
[0100]
(4)将(2)中的混合液与10000rpm离心15min，取上清通过硫酸咔唑法检测肝素前体产量为15g/l(图4)。
[0101]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。