芦丁在制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药工业领域，涉及芦丁的药物用途，具体涉及芦丁治疗糖尿病诱导的结肠损伤药物中的应用。


背景技术：

2.随着社会的发展，糖尿病患病率显著增加，已成为影响人类健康的流行性疾病。糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢疾病。高血糖是由胰岛素绝对或相对分泌不足而导致引起。在全球范围内糖尿病的发病率呈逐年升高趋势，已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三重大疾病。长期存在的高血糖会导致许多并发症，特别是糖尿病诱导的结肠损伤。
3.结肠是腹内第二个最常受损伤的器官，也是腹外伤死亡率较高的脏器之一。结肠是最大的细菌储藏器，当结肠因创伤或疾病而被打开时，就存在腹膜炎、创口感染或其他细菌性并发症的可能。结肠损伤约占腹部创伤的10～22％，多伴有腹部多脏器伤或全身多发性损伤。早期多不立即危及生命，后期因感染使死亡率增高，即是幸存者也有较多并发症发生。
4.由于结肠内含有大量细菌的粪便，加上结肠壁薄，血液供应和组织愈合能力相对较差，以及肠腔内细菌分解产气等原因，所以结肠损伤不同与其它的脏器损伤的处理方法。
5.在糖尿病诱导的结肠损伤处理过程中，药物治疗很少，手术是治疗的根本原则，但因手术是在血液循环较差，细菌繁殖较多的结肠进行，再加结肠内压力较高，做修补或肠吻合术极易形成结肠瘘或腹腔残余感染等并发症，包括切口感染、切口裂开、腹腔脓肿、粘连性肠梗阻等，而且在手术过程中，为了有效预防手术过程中腹腔感染以及切口的细菌感染，手术过程中使用了大量的抗生素，会对人体的肝功能、肾功能等造成损害。
6.鉴于上述原因，亟需对糖尿病诱导的结肠损伤进行探究，研究一种能安全、无副作用的治疗糖尿病诱导的结肠损伤的药物。


技术实现要素：

7.为了克服上述问题，本发明人对糖尿病诱导的结肠损伤进行了锐意研究，以小鼠为试验对象，对小鼠使用芦丁治疗糖尿病诱导的结肠损伤，意外发现了芦丁在制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤药物的新用途，具体地：通过醇浸提及树脂纯化过程，从苦荞粉中提取并纯化芦丁，将提纯的芦丁用于制备预防、治疗或改善糖尿病诱导的结肠损伤的药物。本发明中芦丁的提纯方法简单，提取物中芦丁纯度可达90％以上；利用芦丁制备的药物具有原料来源广泛、成本低、疗效好、长期应用毒副作用低的优点，从而完成了本发明。
8.具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
9.第一方面，提供芦丁，所述芦丁的提取率为80％以上，芦丁的纯度为88％以上。
10.第二方面，提供芦丁的提纯方法，用浸提液浸提苦荞粉，获得芦丁粗产物，并纯化芦丁粗产物。
11.其中，所述浸提液为极性较强的有机溶剂，包括醇类化合物、酮类化合物、酯类化合物，优选醇类化合物，例如甲醇、乙醇、丙醇等，更优选乙醇。
12.其中，所述纯化包括树脂吸附和洗脱剂洗脱。
13.其中，所述树脂为对芦丁吸附能力和解吸能力强的大孔吸附树脂，包括苯乙烯类大孔树脂、甲基丙烯酸酯类；
14.所述洗脱剂为极性大于树脂极性的有机溶剂，优选选自甲醇、乙醇、甲酸乙酯、水中的任意一种或几种，更优选为乙醇。
15.第三方面，提供芦丁在制备治疗结肠损伤药物中的用途。
16.进一步地，芦丁在制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤药物中的用途。
17.进一步地，所述糖尿病诱导的结肠损伤包括升结肠损伤、横结肠损伤、降结肠损伤和乙状结肠损伤。
18.其中，所述芦丁的纯度为88％以上，由第二方面所述方法制备。
19.本发明所具有的有益效果包括：
20.(1)本发明提供的芦丁的提纯方法简单，其中，在苦荞粉中通过醇浸提、树脂纯化的方法制得的芦丁的纯度非常高，可以达到90％以上。
21.(2)本发明提供的芦丁对于糖尿病诱导的结肠损伤，起到治疗、改善或预防的作用。
22.(3)本发明提供的芦丁用于制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤的药物，所述芦丁从天然产物中提取，使用安全、无毒副作用，可操作性强，治疗糖尿病诱导的结肠损伤效果显著，成本低，可降低患者及医疗机构的诊疗费用。
23.(4)本发明提供的芦丁用于制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤的药物，所述芦丁具有原料来源广泛、疗效好、长期应用毒副作用低的特点。
24.(5)本发明提供的芦丁用于制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤的药物，芦丁单独使用或与传统药物联合用药用于治疗糖尿病诱导的结肠损伤具有潜在的临床价值。
附图说明
25.图1
‑
a示出实验例1中1型糖尿病小鼠结肠苏木精
‑
伊红染色图；
26.图1
‑
b示出实验例2中2型糖尿病小鼠结肠苏木精
‑
伊红染色图；
27.图2
‑
a示出实验例1中1型糖尿病小鼠结肠组织病理学评分；
28.图2
‑
b示出实验例2中2型糖尿病小鼠结肠组织病理学评分。
具体实施方式
29.下面通过附图和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
30.在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
31.本发明的第一方面，目的在于提供一种芦丁，所述芦丁的提取率为80％以上，优选为82％以上，更优选为84％以上，所述芦丁的纯度为88％以上，优选90％以上，更优选为
92％以上。
32.本发明的第二方面，目的在于提供一种芦丁的提纯方法，用浸提液浸提苦荞粉，获得芦丁粗产物，并纯化芦丁粗产物。
33.其中，所述苦荞粉粒度为20～140目，优选40～120目，更优选60～100目，例如80目。
34.在本发明中，浸提液从苦荞粉外部扩散进入颗粒内部溶解芦丁，苦荞粉粒度过细，溶解的物质与苦荞粉容易黏结在一起，不利于浸提液的进入；粒度过大，降低浸提液与苦荞粉可溶性成分的接触面积，从而使提取率降低，当苦荞粉粒度为20～140目时，芦丁提取率达到最佳。
35.进一步地，浸提液为极性较强的有机溶剂，包括醇类化合物、酮类化合物、酯类化合物，优选醇类化合物，例如甲醇、乙醇、丙醇等，更优选乙醇。
36.根据本发明，浸提液既要有较强的极性，使得溶剂分子可以渗透浸入苦荞粉内部，使更多的成分溶解，又要满足低毒性，乙醇是一种安全无毒可回收的有机溶剂，具有较强的渗透性和选择性，适用于苦荞粉的浸提。
37.根据本发明，随着乙醇浓度的增加，有利于芦丁的提取，过高的浓度导致溶解的杂质增多，当乙醇的浓度为50～90％时，芦丁的提取率最高。
38.其中，所述乙醇的浓度优选为50～80％，更优选为60～75％，例如65％。
39.根据本发明，所述苦荞粉与浸提液的重量比为1：(10～50)，优选为1：(20～40)，更优选为1：(28～30)。
40.在本发明中，所述浸提液的体积越大，浸提液与苦荞粉之间的接触面积越大，单位时间内获得的芦丁越多，当物料比大于1：(10～50)时，芦丁的提取率增加不明显，而浸提液的增多，溶解的杂质随之增多，为后续纯化工艺造成困难。
41.根据本发明，所述浸提的温度为40～80℃，优选为50～70℃，更优选为60℃。
42.在本发明中，随着温度的升高，分子热运动加快，分子间相互碰撞几率增加，从而使浸提液溶解能力增大，而且温度上升，也使得浸提液的黏度下降，传质系数增加，有利于芦丁的提取。但温度过高又会导致芦丁中的热敏性物质受热降解，影响芦丁的收率。
43.根据本发明，所述浸提的时间为1～15h，优选为3～10h，更优选为5～6h。
44.根据本发明，浸提时间越长，芦丁提取率越高，其原因可能是因为时间越长，越有利于苦荞粉中活性成分的溶出，进而导致提取效果越好，为缩短反应时间，优选浸提的时间为0.5～3h。
45.在本发明中，为了从苦荞粉中溶出更多的活性成分，优选对苦荞粉和浸提液经浸提后的混合物超声处理，所述超声功率为10～50hz，优选为15～30hz，更优选为25hz；所述超声时间为0.1～5h，优选为0.5～2h，更优选为1h。
46.在本发明中，浸提结束后，分离得到上层清液，经浓缩、溶解得到芦丁粗产物。
47.根据本发明，所述浓缩优选采用旋转蒸发的方式实现。当上层清液中没有液体时，浓缩过程结束。
48.根据优选实施方式，所述浓缩时间低于1小时，优选不超过45min，例如20min；为了节省浓缩时间，可在浓缩过程中对其加热，浓缩温度为30～60℃，优选为35～40℃，例如37℃。
49.根据本发明，所述溶解的溶剂包括醇类化合物、酮类化合物、酯类化合物等有机溶剂，优选醇类化合物，例如甲醇、乙醇、丙醇等，为避免引入杂质而增加纯化工艺，所述溶解的溶剂更优选与浸提液种类相同，例如乙醇。
50.根据本发明，使用乙醇溶解提取液时，乙醇的浓度只需满足能将提取液溶解即可，所述乙醇的浓度为10％～60％，优选为20～50％，更优选为25～40％，例如30％。
51.根据本发明，所述纯化包括树脂吸附和洗脱剂洗脱。
52.根据优选实施方式，所述树脂为对芦丁吸附能力和解吸能力强的大孔吸附树脂，包括苯乙烯类大孔树脂、甲基丙烯酸酯类大孔树脂，优选为苯乙烯类大孔树脂，例如ab
‑
8大孔吸附树脂。
53.在本发明中，苯乙烯类大孔树脂理化性质稳定，不受无机盐类及小分子化合物的影响，特别是ab
‑
8大孔吸附树脂，比表面积和孔径较大，吸附量较大，洗脱容易，吸附动力学性能良好，性质稳定，对无机类化合物及小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将待提纯物质芦丁与这些物质分离，更重要的是，ab
‑
8大孔吸附树脂对芦丁具有优良的选择性。
54.根据本发明，未经处理的树脂孔道中会残留有惰性溶剂，优选将树脂在乙醇中浸泡24～48h后用水冲洗，去除树脂孔道中的杂质。
55.根据本发明，所述洗脱剂为极性大于树脂极性的有机溶剂，便于芦丁的解吸，优选选自甲醇、乙醇、甲酸乙酯、水中的任意一种或几种，更优选乙醇。
56.在本发明中，所述乙醇的浓度为30％～80％，优选为50％～75％，更优选为70％。
57.本发明人发现，随着乙醇浓度不断增大，芦丁的解吸率不断增加，当乙醇浓度达到80％时，洗脱剂的解析效果最好，当乙醇浓度大于80％时，解吸率有下降趋势，也会导致溶于乙醇的杂质随之增加，因此，当乙醇的浓度为30％～80％时，既可保证芦丁的充分洗脱，又可避免杂质的掺杂。
58.根据优选实施方式，为了减少小分子亲水性有机物对芦丁纯度的影响，优选洗脱剂洗脱前，对吸附有芦丁的树脂使用自来水冲洗，然后洗脱。
59.根据本发明，洗脱结束对芦丁液体浓缩、干燥得到芦丁。
60.任选地，回收洗脱液和浸提液如乙醇。
61.本发明的第三方面，目的在于提供芦丁在制备治疗结肠损伤药物中的用途，所述芦丁为第一方面所述的芦丁或采用第二方面所述的方法制备得到。
62.本发明人发现，芦丁对改善、预防或治疗结肠损伤有优良的效果，能显著恢复结肠绒毛，减少结肠组织的液泡和隐窝损伤。
63.进一步地，芦丁在制备治疗糖尿病诱导的结肠损伤药物中的用途。
64.更进一步地，所述糖尿病诱导的结肠损伤包括升结肠损伤、横结肠损伤、降结肠损伤和乙状结肠损伤。
65.根据本发明，通过体内研究发现，链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的结肠损伤在苏木素
‑
伊红染色中显著可见损伤性病理改变，当给予芦丁治疗后，能够显著抑制糖尿病所诱导的结肠病理损伤性改变。因此，芦丁作为药物能够在糖尿病诱导的结肠损伤治疗中发挥作用，并带来明显的治疗效果。
66.另外，通过苏木素
‑
伊红染色还发现，芦丁能显著恢复结肠损伤的肠绒毛、减少液泡。
67.可见，芦丁能降低糖尿病诱导的结肠损伤，特别是在糖尿病诱导的结肠损伤方面存在显著的治疗效果。
68.根据本发明，所述芦丁的纯度为88％以上，优选90％以上，更优选为92％以上。
69.根据本发明，所述芦丁的使用剂量为50～300mg/kg，优选为80～260mg/kg，更优选为100～200mg/kg，最优选为200mg/kg。
70.本发明中，芦丁安全性高，可单独使用或与传统药物联合用药治疗糖尿病诱导的结肠损伤。
71.进一步地，芦丁单独使用或与传统药物联合用药时，口服使用，或者注射使用，优选口服使用。
72.在本发明中，所述芦丁以溶于溶剂的溶液使用或以固体的形式使用，所述溶剂可以为生理盐水。
73.根据本发明，所述芦丁以固体形式使用时，可以制备为片剂、胶囊剂、固体分散体或颗粒剂后使用。
74.在本发明中，使用芦丁治疗糖尿病诱导的结肠损伤，有助于延缓病情进展恶化，显著减少病死率和病残率，提高生存质量；治疗方法可操作性强，费用低，可以显著降低患者及医疗机构的诊疗费用。
75.实施例
76.以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
77.实施例1
78.从苦荞粉中提取芦丁。
79.将20g粒度为80目的苦荞粉在浓度为70％，体积为300ml、浓度为65％的乙醇中浸提5h，浸提温度为60℃，之后用超声机在25hz功率下超声1h，再在用循环水多用途真空泵过滤，收集上层清液，继续使用旋转蒸发器对超声后的上层清液浓缩，浓缩时间20min，温度37℃，再使用浓度为30％的乙醇溶解，得到芦丁粗产物。
80.室温条件下，将ab
‑
8大孔吸附树脂浸泡于浓度为98％的乙醇中，浸泡24h，使其溶胀，用水对溶胀的ab
‑
8大孔吸附树脂冲洗3次，将上述芦丁粗产物上柱，静置2h，然后用水缓缓洗脱，弃去水洗液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，最后干燥得到粉末状，即为提纯的芦丁。
81.经hplc分析，芦丁的提取率为84.33％，所得芦丁的纯度为92.2％。
82.实验例
83.实验例1
84.芦丁对缓解1型糖尿病小鼠诱导的结肠损伤。
85.雄性小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司获得。实验前，让所有小鼠在动物房内适应7天，控制动物房室内温度为23
±
2℃，湿度为55
±
5％；给实验小鼠提供充足的水和饲料。本实验相关操作的执行均以动物保护管理条例为标准。
86.将8
‑
10周龄、重量为18～22g的雄性小鼠随机分为6组：正常组1组(nd)、模型组1组(t1dm)、实验组2组(t1dm
‑
rutin100，t1dm
‑
rutin200)，每组6只。
87.其中，模型组和实验组小鼠为1型糖尿病小鼠，建立过程具体如下：在小鼠腹腔注
射链脲佐菌素(stz)45mg/kg/d，连续注射5天。
88.正常组(nd)小鼠，注射等量的柠檬酸缓冲液(ph 4.4，浓度0.1mol/l)。
89.正常组(nd)小鼠和1型糖尿病小鼠最后一次注射72小时后，测定小鼠的空腹血糖，其中，血糖值≥16.7mmol/l时认为1型糖尿病小鼠模型已建立。
90.各组小鼠治疗方法具体如下：
91.实验组小鼠分别灌胃给予芦丁200mg/kg(t1dm
‑
rutin200)治疗，其中，芦丁为实施例1制得。
92.模型组(t1dm)小鼠不进行给药治疗，灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水；
93.正常组(nd)灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水。
94.小鼠在上述条件下治疗或喂养，每周监测各组小鼠血糖和体重，4周后处死上述小鼠，取结肠，进行h&e(苏木精
‑
伊红染色法)染色(标尺:100μm)，结果如图1
‑
a所示，图中，红箭头代表空泡，黑色箭头代表绒毛，白色箭头代表地下室。用h&e染色对各组小鼠的结肠进行组织病理学评分，结果如图2
‑
a所示，其中，平均值
±
平均值的标准误差:*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
95.实验例2
96.芦丁对缓解2型糖尿病小鼠诱导的结肠损伤。
97.本实施例与实施例1小鼠来源相同，实验前对小鼠的喂养条件与实施例1完全相同。
98.将8
‑
10周龄、重量为18～22g的雄性小鼠随机分为4组：正常组1组(nd)、模型组1组(t2dm)、实验组2组(t2dm
‑
rutin100，t2dm
‑
rutin200)，每组5只。
99.其中，模型组和实验组小鼠为2型糖尿病小鼠，建立过程具体如下：小鼠被喂养高脂饲料(hfd)，其中，脂质含量为45％，蛋白质含量为19％，碳水化合物含量为36％；
100.以此同时，正常组(nd)小鼠被喂养正常饲料，其中，脂质含量为10％，蛋白质含量为19％，碳水化合物含量为71％。
101.小鼠在上述条件下喂养8周，8周后隔夜禁食12小时，对正常组小鼠注射柠檬酸缓冲液(ph 4.4，浓度0.1mol/l)，其余各组小鼠腹腔注射stz(35mg/kg/d)及柠檬酸缓冲液(ph 4.4，浓度0.1mol/l)，连续注射三天，每天一次，最后一次注射72小时后，测定小鼠的空腹血糖，其中，血糖值≥16.7mmol/l时认为2型糖尿病小鼠模型已建立。
102.各组小鼠治疗方法具体如下：
103.实验组小鼠分别灌胃给予芦丁100mg/kg(t2dm
‑
rutin100)、芦丁200mg/kg(t2dm
‑
rutin200)治疗，其中，芦丁为实施例1制得。
104.模型组(t2dm)小鼠不进行给药治疗，灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水；
105.正常组(nd)灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水。
106.小鼠在上述条件下治疗或喂养，每周监测各组小鼠血糖和体重，4周后处死上述小鼠，取结肠，进行h&e(苏木精
‑
伊红染色法)染色，结果如图1
‑
b所示，图中，红箭头代表空泡，黑色箭头代表绒毛，白色箭头代表地下室。用h&e染色对各组小鼠的结肠进行组织病理学评分，结果如图2
‑
b所示，其中，平均值
±
平均值的标准误差:*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
107.由图1和图2可知：
108.正常组中，小鼠的结肠组织形态正常。
109.模型组中，结肠绒毛排列紊乱，容易碎裂，肠绒毛缩短，出现了许多液泡和隐窝损伤。
110.实验组中，当芦丁剂量为100mg/kg时，小鼠的结肠与模型组相比恢复肠绒毛，液泡减少，结肠的组织病理学评分降低。当芦丁剂量为200mg/kg时，小鼠的结肠损伤程度逐步减轻，治疗效果优于芦丁100mg/kg的剂量组；
111.此外，结合图1和图2还可以明显看出，芦丁对糖尿病诱导的结肠损伤具有一定的治疗效果，可见，在糖尿病小鼠模型中，芦丁能够缓解糖尿病诱导的结肠损伤，且具有一定的剂量依赖性。
112.以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。