一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法与流程

1.本发明属于抗体制备领域，具体涉及到一种饥饿培养细胞使在培养基中高产量表达抗体并纯化得到该抗体的抗体制备方法。


背景技术：

2.单克隆抗体在生物医药领域和科研学术领域都具有重要的作用。首先，单克隆抗体药物作为一种靶向类的抗体类药物，主要针对的靶点是肿瘤细胞表面所产生的一些特异性的抗原，或者肿瘤细胞表面表达量远高于正常细胞表面的抗原。由于其对肿瘤细胞的杀伤作用具有专一性强、疗效显著等优势，成为近年来研究的热点药物之一。例如科学家通过研究发现乳腺癌细胞表面her
‑
2抗原的表达量远远超过正常细胞，设计了曲妥珠单抗，是专一性针对该抗原的单克隆抗体，能够杀伤乳腺癌细胞，为患者带来很大的希望。利妥珠单抗在1999年得到美国fda批准上市。单克隆抗体药物在生物技术制药中占有重要地位，并逐渐发展成为生物医药领域发展的重要方法。其次，单克隆抗体在科研学术领域，作为一种常用的分子生物学鉴定工具，被广泛应用于免疫沉淀试验，酶联免疫试验，蛋白质印迹等分析实验中。因此单克隆抗体的高产量高纯度制备一直备受关注，对于其更广泛的生产及应用均具有重要意义。
3.在生物制药领域，通常通过淋巴细胞杂交瘤技术或者基因工程技术来制备单克隆抗体药物。其中淋巴细胞杂交瘤技术的原理是指，单克隆抗体是由b淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个b淋巴细胞只能产生一种它专有的抗体，b淋巴细胞具有抗体分泌功能和在合适培养基中生长的特征。但是，b淋巴细胞不能无线扩增，因此科学家将经过抗原免疫的小鼠b淋巴细胞与可以在培养条件下无限分裂、扩增的小鼠骨髓瘤细胞进行融合而得到杂交瘤细胞，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞。在筛选出所需要的细胞群后，大规模的单克隆抗体的制备主要采用动物体内诱生腹水法和体外培养淋巴细胞两种方式。而动物体内诱生腹水法需要专业人士将杂交瘤细胞住宿到小鼠的腹膜内进行培养，然后经过周期培养后收集腹水进行单克隆抗体的纯化，而腹水中含有脂类成分等复杂的杂质干扰，因此其抗体的表达和纯化均较为复杂。于此相反，体外培养淋巴细胞的方式操作简单，培养基成分单一，纯化难度小。但是体外培养淋巴细胞的抗体产量较低，一般1ml培养基中仅含有10
‑
20ug单克隆抗体。因此对于提高其产量提出了急切的需求。


技术实现要素：

4.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法，通过饥饿培养的方式来增加体外培养杂交瘤细胞培养基中单克隆抗体的含量，通过较为简单高效的抗体纯化处理后，可以得到相较于传统培养方式3倍抗体量和纯度达到90％的单克隆抗体，可以大大缩减抗体生产成本，并扩大该方法在科研学术领域的进一步应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法，其对目标抗体对应的杂交瘤细胞进行饥饿培养使杂交瘤细胞大量表达目标抗体，继而从饥饿培养后的培养基中提取目标抗体，最后对目标抗体进行纯化。
7.根据以上方案，所述的对目标抗体进行纯化是利用蛋白磁珠采用免疫沉淀法对目标抗体进行免疫吸附并富集纯化。
8.根据以上方案，所述的一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法包括以下详细步骤：
9.步骤s1扩增培养，对目标抗体对应的杂交瘤细胞进行正常扩增培养，至杂交瘤细胞扩增到传代密度；
10.步骤s2饥饿培养，向杂交瘤细胞中加入不含主要营养物质的培养基后继续培养，至细胞存活率低于50％，收集培养基的上清液；
11.步骤s3免疫沉淀富集，向步骤s2收集到的上清液中添加包被有特异性蛋白抗原的蛋白磁珠，使目标抗体结合到蛋白磁珠上，收集蛋白磁珠；
12.步骤s4，对步骤s3收集到的蛋白磁珠使用冲洗溶液进行冲洗，将蛋白磁珠上非特异性结合的物质冲走，收集蛋白磁珠；
13.步骤s5，对步骤s4收集到的蛋白磁珠使用洗脱液进行洗脱，将特异性结合的目标抗体从蛋白磁珠上洗脱，收集洗脱液，对洗脱液进行浓缩。
14.根据以上方案，所述的主要营养物质是胎牛血清。
15.根据以上方案，所述的蛋白磁珠是包被有蛋白a或蛋白g的蛋白磁珠。
16.根据以上方案，所述的步骤s1扩增培养中的培养基内添加有抑制非目标抗体对应的杂交瘤细胞生长的抑制物质；所述的步骤s2饥饿培养中的培养基内不添加有抑制非目标抗体对应的杂交瘤细胞生长的抑制物质。
17.根据以上方案，所述的抑制物质包括抗生素。
18.本发明的有益效果是：本发明此方法的抗体表达和纯化方法，较现有的单克隆抗体的筛选方法相比，具有操作简单，成本低，易于上手，产量高，纯度高和活性完整等优势，为单克隆抗体生产制备的广泛应用提供了可期的前景。
附图说明
19.图1：实施例中单克隆抗体的sds
‑
page胶图
20.图2：实施例中单克隆抗体的蛋白质高分辨分子量(非还原)的质谱图和结果
21.图3：实施例中单克隆抗体的蛋白质高分辨分子量(还原)的质谱图和结果
22.图4：实施例中单克隆抗体的亲和性实验验证的western
‑
blot图。
23.图2和图3为实施例中的结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
25.实施例一：杂交瘤细胞株hb95的饥饿培养及单克隆抗体的纯化。
26.一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法，其对目标抗体对应的杂交瘤细胞进行饥饿培养使杂交瘤细胞大量表达目标抗体，继而从饥饿培养后的培养基中提取目标抗体，最后利用蛋白磁珠采用免疫沉淀法对目标抗体进行免疫吸附并富集纯化。
27.本实施例以杂交瘤细胞株hb95为例，对本发明提供的一种细胞上清中高产量抗体表达和纯化的方法进行详细阐述，具体包括以下详细步骤：
28.步骤s1扩增培养，，至杂交瘤细胞扩增到传代密度，取冻存的hb95细胞株(目标抗体对应的杂交瘤细胞)快速的进行细胞复苏后，将细胞置于15cm培养皿中，并加入20ml成分为dmem培养基 10％fbs(胎牛血清) 1％双抗(青霉素和链霉素)的全培养基中进行扩增培养，接种密度控制在2x 105cells/ml左右，将细胞置于37℃，5％co2的培养箱中进行扩增培养，hb95细胞传代2
‑
3天后密度达到1x 106cells/ml左右(传代密度)；
29.步骤s2饥饿培养，继续向15cm培养皿中补加温热的、无双抗、含glutamax的dmem培养基40ml，继续培养并每天观测细胞存活率，待细胞存活率约50％左右，回收培养基，离心后取上清液备用；暂时不用的培养基或培养基上清液可以使用液氮速冻后放入
‑
80℃保存；
30.步骤s3免疫沉淀富集，取三份步骤s2收集到的上清液各50ml，分别编号为#1，#2和#3，若上清液是冷冻保存的，则先进行室温解冻。上清液经过0.45μm滤膜过滤后，加入约1ml摇匀的protein a sephrose，并置于360℃旋转摩天轮中，在室温下结合半个小时以上，或者4℃结合2小时以上，除去上清液并收集蛋白磁珠；
31.步骤s4，向步骤s3收集到的protein a sephrose中加入10ml pbs，在360℃旋转摩天轮中旋转5min后，除去pbs并回收protein a sephrose；
32.步骤s5，向步骤s4收集到的protein a sephrose加入5ml的洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液ph 4.5)，在360℃旋转摩天轮中旋转10min后，回收上清到含有1ml 1mtris(ph 9)的新离心管中，即得到纯化后的单克隆抗体，再将单克隆抗体引入10k超滤管中进行浓缩，5000g离心约30min，待浓缩液体积为约250ul时，取浓缩液，od
280
进行单克隆抗体的定量，结果如下：
[0033][0034]
本实施例中所使用的细胞培养相关试剂，包括胎牛血清、dulbecco’s modified eagle medium(dmem)，青链霉素双抗ps，谷氨酰胺glutamax，胎盘蓝均购自gibco公司。杂交瘤细胞株购hb95自美国模式培养物集存库atcc；protein a sephrose，磷酸盐缓冲液(pbs,ph 7.4)购自thermo公司；柠檬酸一水合物、柠檬酸三钠二水合物，三羟甲基氨基甲烷(tris)购自sigma公司；抗体浓缩超滤管，滤膜购自millipore；抗体浓度定量仪器nanodrop购自thermo公司。
[0035]
实施例二：sds
‑
page法进行单克隆抗体纯度的表征。
[0036]
本实施例使用的丙烯酰胺电泳凝胶10％nupage预制胶、10
×
还原剂、4
×
上样液、20
×
电泳缓冲液均购自于thermo公司；单克隆抗体w6/32标准品购于abcam公司；预染蛋白分子量marker购于bio
‑
rad公司；电泳仪mini gel tank采购于thermo公司。
[0037]
取实施例一中的单克隆抗体#1、#2、#3和单克隆抗体标准品各两份，每份都为3ug，分别加入电泳上样液，并且一份加入还原剂，一份不加入还原剂。95
°
煮沸变性后，按照顺序在预制胶各上样通道内点入样品，以及预染蛋白分子量marker进行电泳分离，并最终用考马斯亮蓝显色液进行显色和胶图扫描，胶图如图1所示。
[0038]
由图1可看到实施例一中纯化后的抗体完整的分子量约为150kda，与标准品一致；其还原后的分子量分别为重链50kda，轻链～23kda，与标准品一致。并且该单克隆抗体的纯度达到90％以上。
[0039]
实施例三：单克隆抗体的蛋白质高分辨分子量表征。
[0040]
对于非还原的单克隆抗体分子量表征，取实施例一中纯化后的样品，并用纯水稀释样品浓度为0.1μg/μl即可。对于还原的单克隆抗体分子量表征，取实施例一中纯化后的样品，用纯水稀释样品浓度为0.1μg/μl，再加入dtt至终浓度10mm，加入6m盐酸胍至1m，56℃反应30min。将对应样品转移到自动进样小瓶中，并放入岛津液相lc20ad的自动进样器中，安装色谱柱eclipsexd
‑
c8。上样体积为10ul，缓冲液：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的a液平衡，流速为400nl/min。色谱梯度设置为10min，相关液相梯度如下：0分钟
‑‑‑
1分钟，b液线性梯度从2％到2％；1分钟
‑‑‑
8分钟，b液线性梯度从2％到100％；8分钟
‑‑‑‑
10分钟，b液维持在100％。高分辨质谱仪为q
‑
exactive plus质谱仪(thermo公司)。分析时长：10min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300
‑
3000m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，agc target：3e6，一级maximum it：20ms，number of scan ranges：1，dynamic exclusion：40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(ms2 scan)，ms2activation type：hcd，isolation window：2m/z，二级质谱分辨率：17,500at m/z 200，microscans：1，二级maximum it：60ms，normalized collision energy：27ev，underfill ratio：0.1％。
[0041]
采集的普通采用biopharma finder 2.0软件进行谱图去卷积，得到对应峰的分子量大小，如图2和图3。
[0042]
本实施例中对实施例一中的单克隆抗体的高分辨分子量鉴定，图2可以看到其非还原分子量为149004.55da。从图3可知，其还原后分子量中重链为50960.85da。并且因为质谱的灵敏度和分辨率远远高于sds
‑
page技术，其测定得到该单克隆抗体具有两条不同的轻链，分子量分别为23636.87da和23866.67da。证明其为一个轻链不相同的双抗。从其质谱图上根据峰面积进行积分可以得到，其纯度高达99％。
[0043]
实施例四，单克隆抗体的亲和性实验验证。
[0044]
本实施例使用的丙烯酰胺电泳凝胶10％nupage预制胶、10
×
还原剂、4
×
上样液、20
×
电泳缓冲液、western blot印记膜和滤纸均购自于thermo公司；预染蛋白分子量marker购于bio
‑
rad公司；一抗抗β2
‑
微球蛋白兔重组抗体(anti
‑
beta 2 microglobulin)采购于abcam公司；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg采购于碧云天公司；电泳仪mini gel tank和iblot2干式转印系统采购于thermo公司。
[0045]
取实施例一中的单克隆抗体，各加入1mg到体积为1ml protein a sephrose悬液中，并置于360℃旋转摩天轮中，在室温下结合半个小时以上或者4℃结合2小时以上。然后取1例组织样品200mg，加入2ml温和的组织提取液(含有0.5％(v/v)igepal ca
‑
630，50mm tris(ph 8.0)，150mm nacl，1mm edta和蛋白酶抑制剂的水溶液)和钢珠后，对组织进行匀浆处理用于组织内蛋白的提取，并保留其蛋白的生物活性。对该组织裂解液进行40,000g超速离心30min后，留存50ul的上清作为富集前的对照a，然后将剩余的上清均加入到protein a sephrose悬液中，并置于360℃旋转摩天轮中，在4℃结合2小时以上。该单克隆抗体会特异性结合组织细胞表面的mhc
‑
i蛋白。结合完成后，离心回收protein a sephrose，并取50ul上清作为富集后的对照样品b。
[0046]
将样品a和b进行sds
‑
page跑胶和wb分析，以验证该单克隆抗体成功富集到了样品中的mhc
‑
i蛋白，mhc
‑
i蛋白由α链(分子量为43kda)和β链(分子量为43kda)组成，该wb实验中对β链进行验证。结果如图4所示，对比a和b样品，在富集后组织裂解液中的mhc成分明显降低，证明该单克隆纯化方式保留了单克隆抗体的活性。
[0047]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。