1.本发明涉及一种白桑葚发酵物及其制备方法与用途，特别是关于白桑葚发酵物用于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。
背景技术：
：：2.爱美是人的天性，肌肤美容及瘦身减脂已成为现代人重视的一大课题，不仅女性费尽心力追求肌肤美白及苗条体态，近年来男生注重于皮肤美白、保健保养的指数节节攀升，而皮肤之所以会变黑，其作用机制在于皮肤每天都直接或间接的暴露于日光照射下，为了保护皮肤不受紫外线的伤害，人体会合成黑色素(melanin)来防御阳光中的紫外线，所述黑色素会导致皮肤出现暗沉蜡黄、斑点或痘斑。3.另外，随着年龄增长肌肤会产生皱纹或松弛等问题，所述皮肤皱纹或松弛已知是由于皮肤纤维母细胞的胶原蛋白产生能力降低而引起；而老化会导致肌肤的含水量降低，使皮肤失去紧致和柔嫩，其与玻尿酸的流失有关，玻尿酸可以用于提升肌肤的保湿程度，同时加强肌肤表层的保护力。4.现今社会，自然有机及天然成分保养品概念逐渐兴起，生技公司及保养品相关业者积极投入天然植物的相关产品研发，为使天然植物类产品对于人体健康保健有实质科学验证的基础，植物的成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。5.白桑葚(morusalba，又名whitemulberry)是一种生长迅速的中小型桑树，其可生长到10‑20公尺高，且其通常被认定为寿命相较短的树种，原产于中国北部和印度，目前广泛种植于世界各地，包括：美国、土耳其、墨西哥、澳大利亚、阿根廷及伊朗等地区，其主要由蚕丝业者所种植目的是用以喂养生产中所使用的蚕，白桑葚叶子可长达30厘米呈锯齿圆形状，而其果实约长1‑1.5厘米，并在成熟时可供食用。6.一般熟知的桑葚果实是呈红色或者黑紫色，然白桑葚果实是为白色，因此亦被称为「白玉王」，其口感比普通黑桑葚更甜一些，而成熟的白桑葚带有一点紫色，待其全熟透后，甜度可达到19度；白桑葚含有的热量不高，适合身体肥胖者食用，且其含有蛋白质、脂肪、维生素、碳水化合物及膳食纤维等微量元素，营养价值丰富。然而，白桑葚是否具有其他功效及用途还未被广泛了解与应用。技术实现要素：7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白桑葚发酵物，其中所述白桑葚发酵物是由一白桑葚果实经由水浸提所得的一白桑葚汁液，再经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵而获得。8.在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液是以一溶剂对一青钱柳提取所得。9.在本发明的一实施例中，所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)。10.在本发明的一实施例中，所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。11.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物进一步以200‑400网目的网筛进行网筛过滤，并于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖进行规格调整，再于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌。12.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的总多酚含量为所述白桑葚汁液的总多酚含量的2‑5倍。13.本发明的另一目的在于提供一种前述白桑葚发酵物用于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。14.在本发明的一实施例中，其中所述改善肌肤状况是为降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生。15.在本发明的一实施例中，所述组合物是透过降低发炎反应因子生成及抑制酪胺酸酶活性以达到所述降低黑色素生成的功效，其中所述发炎反应因子是为一氧化氮。16.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的浓度为至少0.5％(v/v)。17.在本发明的一实施例中，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。18.本发明的另一目的在于提供一种白桑葚发酵物的制备方法，是包括将一白桑葚经由水浸提所得的一白桑葚汁液，经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵，并以200‑400网目的网筛过滤，再于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖调整后，于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌；其中所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)；其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。19.以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。附图说明20.图1是为实施例二的白桑葚汁液及白桑葚发酵物总多酚含量的直方图；21.图2是为实施例三的实验组与控制组的相对一氧化氮生成量比例图；22.图3是为实施例四的实验组与控制组的相对酪胺酸酶活性图；23.图4是为实施例五的实验组与控制组的相对黑色素生成比例图；24.图5是为实施例六的实验组与控制组的相对皮肤细胞粒线体活性图；25.图6是为实施例七的实验组与控制组的相对玻尿酸生成比例图；26.图7是为实施例八的实验组与控制组的相对脂肪油滴含量比例图；27.图8是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对紫外线色斑变化图；28.图9是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对肌肤含水量变化图；29.图10是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对肌肤弹力变化图；30.图11是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对胶原蛋白变化图。具体实施方式31.以下将配合图式进一步描述本案的部分具体实施态样，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。32.本案使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，各组的间的差异以学生t检验(student’st‑test)进行分析。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。而「###」符号代表与控制组相比p值小于0.001。33.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负20％的范围内，较佳为在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。34.本文中的「wt％」是指重量百分比，而「vol％」是指体积百分比。关于本文中所使用的「白桑葚」通常是指白桑葚果实。35.本文所述的「有效浓度」或「有效量」是表示能有效降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、抑制脂肪堆积、降低发炎反应因子生成、抑制酪胺酸脢活性、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生所需本发明的白桑葚发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(doseescalation)以实验决定其有效浓度。36.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物是由白桑葚汁液与酵母菌及乳酸菌进行一前发酵程序，再以一醋酸菌进行一后发酵程序所得。37.在本发明的一实施例中，所述白桑葚汁液包括白桑葚及水，所述白桑葚与水的比例为1:5‑20，并根据总重加入5％葡萄糖，使其糖度(degreesbrix)>8.5，并于95℃加热60分钟。38.于前发酵程序中，先添加0.01％‑0.5％的酵母菌至白桑葚汁液内，并将白桑葚汁液与酵母菌发酵1日至2日后，再添加0.01％‑0.25％乳酸菌进行发酵1日至2日以完成前发酵的程序。换言之，所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)，且所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)，其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，并于28℃‑37℃下进行。39.于后发酵程序中，添加1‑20％的醋酸菌静置发酵3‑10天，待brix值小于3.9且ph值等于3.7±1时即终止发酵。40.在本发明的一实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)，在一些实施例中，乳酸菌可以是嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、瑞士乳酸菌(lactobacillushelveticus)、或植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，在一些实施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌(acetobacteraceti)。41.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物可进一步进行网筛过滤、减压浓缩、规格调整及加热灭菌。42.在本发明的一实施例中，网筛过滤以200目数至400目数的网孔的滤网进行过滤，并于55‑65℃进行减压浓缩。43.在本发明的一实施例中，调整规格可透过添加40‑70％的赋形剂(excipient)来调整发酵原液的糖度。在一些实施例中，用以调整糖度的赋形剂可为异麦芽寡糖。44.在本发明的一实施例中，加热灭菌程序可为将原料混合液在95℃至105℃下灭菌100‑120分钟，并将灭菌后的混合液冷却至室温(即25℃至30℃)以形成白桑葚发酵物。在一些实施例中，灭菌后的原料混合液可采取自然降温的方式冷却至室温。45.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物的ph值为4.0±1.0，且白桑葚发酵物的糖度为39±2。46.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的制备方法，是包括将一白桑葚经由水浸提所得的一白桑葚汁液，经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵，并以200‑400网目的网筛过滤，再于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖调整后，于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌；其中所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)；其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。47.在本发明的一实施例中，前述白桑葚发酵物用于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。在一些实施例中，所述改善肌肤状况是为降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生。在一些实施例中，所述组合物是透过降低发炎反应因子生成及抑制酪胺酸酶活性以达到所述降低黑色素生成。在一些实施例中，所述发炎反应因子是为一氧化氮。其中，受体可为人。48.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的浓度为至少0.5％(v/v)。49.在本发明的一实施例中，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。换言之，此医药品、食品或保养品包含有效含量的白桑葚发酵物。50.在本发明的一实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服地、或局部地(topically)投药剂型。51.在本发明的一实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似的物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)或类似的物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)或病灶内注射(intralesionalinjection)。52.在本发明的一实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似的物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)、或含有醇的水性溶液(alcoholcontainingaqueoussolution)。53.在本发明的一实施例中，前述的任一组合物可为食用组合物。换言之，食用组合物包含特定含量的白桑葚发酵物。在一些实施例中，前述的食用组合物可为食品产品或食品添加物(foodadditive)。在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)或膳食补充品(dietarysupplements)。54.在本发明的一实施例中，前述的食用组合物可以口服方式施予受体。其中，食用组合物的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。55.在本发明的一实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的白桑葚发酵物。56.在本发明的一实施例中，前述的化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。57.实施例1.白桑葚发酵物的制备方法58.首先，将白桑葚(morusalba，白桑葚原产地为土耳其)与水以1:10(即，白桑葚为一倍重量，水为十倍重量)的比例混合均匀，再添加5％葡萄糖溶液将糖度调整为8.5，并于95℃下加热60分钟，以获得白桑葚汁液。59.接着，于白桑葚汁液中殖入0.1％啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)，寄存编号bcrc20271)并在约30℃下发酵1天，以得到第一初发酵汁液。接着，于第一初发酵汁液中殖入0.05％嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(购自bcrc，寄存编号bcrc910636)并在约30℃下发酵1天，以得到第二初发酵汁液。最后，于第二初发酵汁液中殖入5％乙酸醋酸菌(acetobacteraceti)(购自bcrc，寄存编号bcrc11688)并在约30℃下发酵5天，以得到第三初发酵汁液。60.再将第三初发酵汁液以目数200的网孔的滤网进行网筛过滤，再于约60℃下进行减压浓缩，以得到发酵原液。最后，添加60％异麦芽寡糖至发酵原液后在约100℃下灭菌2小时，以得到白桑葚发酵物。61.于此，分别对白桑葚汁液以及白桑葚发酵物进行糖度检测。其中，白桑葚汁液的糖度约为8.5，而白桑葚发酵物的糖度约为40。62.实施例2.总多酚含量测试63.秤取10.0mg的没食子酸(gallicacid，购自sigma，料号：g7384)置于10ml容量瓶中，然后以水(h2o)定量至10ml，以得到没食子酸的储备溶液(stocksolution)。将没食子酸的储备溶液稀释10倍，即100μl没食子酸的储备溶液加900μl的水，以得到100μg/ml没食子酸的初始溶液(即含1000ppm的没食子酸)。然后，依据下表一配置0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、及100μg/ml的没食子酸的标准溶液，并分别取100μl的各浓度的标准溶液至玻璃试管中。加入500μl的福林酚试剂(folin‑ciocalteu'sphenolreagent，购自merck，料号：1.09001.0100)至各玻璃试管内与标准溶液混合均匀并静置3分钟后，再加入400μl的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到标准反应溶液。取200μl的标准反应溶液至96孔板中，并测量其在750nm下的吸光值，以获得标准曲线。64.表一65.标准浓度(μg/ml)020406080100初始溶液(μl)020406080100水(μl)10080604020066.将实验组的测试样品(即实施例一的白桑葚发酵物)及对照组的测试样品(即实施例一的白桑葚水萃液)分别以水稀释20倍。将各样本取100μl到玻璃试管中。接着，加入500μl的福林酚试剂至玻璃试管中与样本混合均匀并静置3分钟后，再加入400μl的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到待测反应溶液。将装有待测反应溶液的玻璃试管进行震荡以确保无气泡后，取200μl的待测反应溶液至96孔板中，并测量待测反应溶液于750nm下的吸光值，接着，各样本对应的待测反应溶液的吸光值先除以样本的糖度，再利用标准曲线以内插法换算成总多酚含量。67.总多酚含量结果如图1所示，对照组的总多酚含量为90ppm及实验组的总多酚含量为250ppm，与对照组相较之下，样品组的总多酚含量有显着的提升，于此，可推断出稀释前的白桑葚水萃物及白桑葚发酵物(即经本案实施例一制备方式所制得的白桑葚水萃物及白桑葚发酵物)的实际总多酚含量分别为1800ppm及5000ppm。由此可知，白桑葚透过微生物发酵后，可提升总多酚含量约2.77倍。即，相对于白桑葚水萃物，白桑葚发酵物会大量释出总多酚，并能提升抗氧化活性，可有效减少自由基累积。68.实施例3.抗发炎能力之一氧化氮检测69.为探讨白桑葚发酵物是否具有降低发炎反应的效果，本实施例将巨噬细胞raw264.7作为细胞平台培养，再透过脂多醣(lipopolysaccharide，lps)处理诱导发炎反应产生，并侦测发炎反应因子一氧化氮(no)的生成量，以评估样品是否达到降低发炎反应的效果。70.材料与仪器71.1.细胞株：小鼠巨噬细胞raw264.7，取自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，cat.tib‑71)。72.2.培养基：将dmem改良培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem，购自gibco，cat.11965‑092)添加额外成分使其含有10vol％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs，购自gibco，cat.10437‑028)及1％青霉素‑链霉素(购自gibco，cat.15140122)。73.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号为cat.14200‑075。74.4.脂多醣(lipopolysaccharide，lps)：购自sigma，产品编号为si‑l2880‑25mg。75.5.亚硝酸盐检测试剂盒(griessreagentkit)：购自lifetechnologies，产品编号为1445263。76.6.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。77.实验步骤：78.1.实验将会分为实验组(实验组a及实验组b)、控制组、以及对照组进行；其中所述实验组a为白桑葚汁液组，实验组b为白桑葚发酵物组；各组分别进行三重复试验：79.2.将raw264.7细胞以1x104cells/well的密度种入96孔细胞培养盘，培养液体积为200μl/well，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养24小时。80.3.将待测孔盘中的培养基移除后，于实验组及對照组中加入lps(浓度为200ng/ml)；同时，实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml，作用24小时。(使用不含fbs的培养基配置)81.4.取一96孔盘,每孔加入130μl的二次水，并将反应完的步骤3每孔中取出150μl培养液加入上述已经含有130μl二次水的96孔盘中。82.5.配置griess试剂(reagenta:b＝1:1)，取20μl加入96孔盘各孔中的培养液避光反应30分钟。83.6.以elisa读盘机(购自biotek)，测定o.d.548nm波长的吸光值(od值读值越大，表示no的含量浓度越高)。84.7.使用studentt‑test进行统计分析(*表p<0.05，**表p<0.01，***表p<0.001)。85.实验结果86.参阅图2，其为经本发明白桑葚汁液及白桑葚发酵物处理后的一氧化氮相对生成量改变图，一氧化氮是为重要的发炎反应因子，故本实施例以一氧化氮的生成量作为发炎反应能力的指标。如图所示，对照组相对控制组的一氧化氮生成量为122.86％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的一氧化氮生成量为116.33％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的一氧化氮生成量为106％。由所述实验结果可知，与对照组相比白桑葚汁液及白桑葚发酵物分别降低一氧化氮生成量约6.53％及16.86％，且经白桑葚发酵物处理的raw264.7巨噬细胞的一氧化氮生成量显着低于对照组，表示raw264.7巨噬细胞经白桑葚发酵物处理后可降低发炎反应因子的生成，显示白桑葚发酵物具有抵抗发炎反应及分泌抗发炎因子的功效，且其效果优于白桑葚汁液，而分泌抗发炎因子可以达到降低黑色素沉淀的效果。87.实施例4.酪胺酸酶活性检测88.酪胺酸酶是生物体内黑色素合成的关键，酪胺酸酶会催化酪胺酸转变为l‑多巴(l‑dopa)，接着产生多巴醌(dopaquinone)进而形成黑色素。于此，藉由检测酪胺酸酶活性来了解白桑葚发酵物对于黑色素细胞产生黑色素的能力影响，当酪胺酸酶活性低时，黑色素细胞产生黑色素的能力就会相对降低。89.材料与仪器90.1.细胞株：小鼠黑色素瘤细胞b16f10，购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，no.6475)，以下简称b16f10细胞。91.2.培养基：将dmem改良培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem，购自gibco，cat.12100‑038)添加额外成分使其含有10vol％fbs(fetalbovineserum，购自gibco，产品编号10438‑026)及1％青霉素‑链霉素(购自gibco，cat.15140122)。92.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437‑028。93.4.曲酸(kojicacid)：购自sigma‑aldrich，产品编号k3125‑5g。94.5.全称放射免疫沉淀法缓冲液蛋白质裂解液(ripalysisbuffer(pmsf))：购自sigma‑aldrich，产品编号10837091001。95.6.bio‑radproteinassay，购自biotek，产品编号epoch。96.7.10mml‑多巴(l‑dopa)：将9.8mg的l‑多巴(购自sigma‑aldrich，产品编号d9628‑5g)溶于5ml的0.1mm，ph值7.0的pbs溶液中。97.8.胰蛋白酶：10xtrypsin‑edta(购自gibco)以1xpbs溶液稀释10倍。98.9.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。99.实验步骤100.于每一孔中加入2ml上述培养基，并将b16f10细胞以1.5x105的每孔密度种入一6孔盘中，于37℃下，培养24小时。101.本实验分为控制组、对照组、实验组a及实验组b。其中，各组加入2ml的新鲜dmem培养液。而对照组的培养液额外加入曲酸(kojicacid)，使其浓度为0.5mg/ml，其中曲酸已被广泛认知为具有抑制细胞酪胺酸酶活性的物质；实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并反应培养48小时。102.培养完毕后，将培养液移除，以1xpbs清洗两次。再加入胰蛋白酶‑edta对细胞作用3分钟，回收悬浮的细胞于15ml离心管，以400xg离心5分钟使细胞沉淀。103.再将沉淀细胞以1xpbs清洗两次后，以200μl细胞裂解液让细胞悬浮，震荡混合后以12,000xg离心20分钟。104.将上清液取出至1.5ml离心管中，进行蛋白质浓度的检测：105.先将bio‑rad染剂与去离子水混合(体积比为1:4)，分装500μl至微量离心管中。而后，分别于前述微量离心管中，加入10、8、6、4、2、1与0μl2mg/ml的bsa以制备标准浓度蛋白质。再加入2μl测试样本进行检测。取出前述反应后的测试样本200μl于96孔盘中，以elisa读取仪(购自biotek)测定595nm的吸光值。106.接着，于每孔中加入400μg蛋白质，再加入90μl细胞裂解液，包括控制组及对照组。在避光环境下，在37℃下加入10μl10m的l‑dopa，每10分钟观察一次，直到悬浮液变黑。之后再测定405nm的吸光值。107.酪胺酸酶含量的分析公式为：酪胺酸酶抑制性(％)＝(样本吸光值/控制组吸光值)×100％。所得数值再以微软excel软件，利用studentt检定进行统计分析，其结果如图3所示。108.由图3的结果可知，在本发明的白桑葚样品的处理下，可达到抑制酪胺酸酶活性的功效。具体而言，对照组相对控制组的酪胺酸酶活性为69.87％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的酪胺酸酶活性为86.44％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的酪胺酸酶活性为74.13％。实验组a与控制组相比酪胺酸酶活性降低约13.56％，实验组b与控制组相比酪胺酸酶活性降低约25.87％，由此可知，实验组b(白桑葚发酵物)的酪胺酸酶抑制能力又高于实验组a(白桑葚水萃物)，且本案白桑葚发酵物的功效近似于曲酸的抑制酪胺酸酶活性的效果。因此，藉由本发明实施例所制备的白桑葚发酵物，确实可降低酪胺酸酶活性，进而可减少黑色素的生成，故可应用于减少皮肤黑斑、提升肌肤光泽、白皙度肌肤美白的相关组合物的成分中。109.实施例5.黑色素生成检测110.于此，以elisa读盘机(enzyme‑linkedimmunosorbentassayreader)测定黑色素瘤细胞株b16f10经白桑葚发酵物处理后，其黑色素含量的变化。111.材料与仪器112.1.细胞株：小鼠黑色素瘤细胞b16f10，购自美国典型培养物保存中心(americantypecμlturecollection，no.6475)，以下简称b16f10细胞。113.2.培养基：将dmem(dulbecco'smodifiedminimalessentialmedium，购自gibco，cat.12100‑038)添加额外成分使其含有1vol％的抗生素溶液(antibioticantimycoticsolution，购自gibco，15240‑062)及10vol％的fbs(fetalbovineserum，购自gibco，10437‑028)。114.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437‑028。115.4.以二次蒸馏水配制1nnaoh(购自sigma，产品编号221465)溶液。116.5.elisareader(购自biotek，产品编号flx800)。117.6.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。118.实验步骤119.实验将会分为实验组a、实验组b、控制组及对照组四组进行，各组分别进行三重复试验：120.1.将b16f10细胞以每孔1.5×105个的方式，接种于每孔含3ml培养基的6孔培养盘中。121.2.将培养盘置于5％co2、37℃环境下，培养24小时。122.3.而后，在不干扰附着细胞的情况下，移除每孔的培养基。123.4.本实验分为控制组、对照组、实验组a及实验组b。其中，各组加入2ml的新鲜dmem培养液。而对照组的培养液额外加入曲酸(kojicacid)，使其浓度为0.5mg/ml，其中曲酸已被广泛认知为具有降低黑色素生成效果的物质；实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并使其于37℃下培养24小时。124.5.将反应完毕的实验组a、实验组b及对照组移至蓝光箱中，使其在室温(25±5℃)下接受蓝光照射3小时。另外，控制组移至暗室中，使其在室温下静置3小时。125.6.反应后，将细胞于37℃下培养48小时。126.7.而后，移除培养基，并以pbs溶液清洗细胞2次。127.8.将200μl胰蛋白酶(trypsin‑edta(10x)，购自gibco；产品编号15400‑054)加至每孔中反应3分钟。反应后，添加6ml培养基溶液终止反应。而后收集各孔中的悬浮细胞与培养基至对应的15ml离心试管内，将各离心试管以400xg离心5分钟使细胞沉淀。128.9.以pbs溶液清洗沉淀细胞二次后，再以200μlpbs溶液重新悬浮细胞。129.10.将细胞悬浮液以液态氮冷冻10分钟，再置于室温约30分钟至完全解冻。130.11.完全解冻后，将试管以12,000g离心3分钟。131.12.移除上清液，再以120μl1n氢氧化钠溶液重新悬浮细胞沉淀后，使试管于60℃干浴1小时，以获得待检测样本。132.13.将100μl待检测样本移入一96孔盘，使用elisa读盘机测量细胞溶液在450nm的吸光值。133.实验结果134.实验组以及控制组的黑色素相对表现量是依下列公式计算：黑色素相对表现量(％)＝(各组od450值/控制组od450值)×100％。因实验是进行三重复，故将三重复实验的结果平均后，显示于图4。135.如图4所示，在本发明的白桑葚样品的处理下，可达到降低黑色素生成的功效。具体而言，对照组相对控制组的黑色素生成量为83.9％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的黑色素生成量为93.54％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的黑色素生成量为86.05％，实验组a与控制组相比黑色素生成降低约6.46％，实验组b与控制组相比黑色素生成降低约13.95％，且本案白桑葚发酵物的功效近似于曲酸的降低黑色素生成的效果。因此，本发明实施例所制备的白桑葚发酵物，确实可有效减少黑色素细胞所生成的黑色素，故可应用于减少皮肤黑斑、提升肌肤光泽、白皙度肌肤美白的相关组合物的成分中。136.实施例6.皮肤细胞粒线体活性实验137.为探讨白桑葚发酵物对皮肤细胞粒线体功能的影响，本实施例以流式细胞仪评估人类皮肤纤维母细胞ccd‑966sk经白桑葚发酵物处理后，其粒线体活性的变化。本实验以jc‑1聚集能力作为粒线体活性的指标，在膜电位正常的健康粒线体中，jc‑1以多聚体(polymer)形式存在，而当粒线体膜电位降低时，jc‑1会变成单体(monomer)，其可当作粒线体活性评估的指标。138.材料与仪器139.1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞ccd‑966sk(bcrcno.60153)。140.2.细胞培养基：含有10vol％fbs(购自gibco)的基础培养基。其中，基础培养基是由eagle’s最低限度基本培养基(eagle’sminimumessentialmedium(mem)，购自gibco，产品编号15188‑319)额外添加成分使其含有1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate，购自gibco)、1.5g/l碳酸氢钠(sodiumbicarbonate，购自sigma)及0.1mm非必需胺基酸(non‑essentialaminoacidsolution，购自gibco)所配制而成。141.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco。142.4.粒线体膜电位侦测套组(bdtmmitoscreen(jc‑1)kit，型号551302)。其中，粒线体膜电位侦测套组具有jc‑1染料(冻干)及10x分析缓冲液。于使用前，以1xpbs将10x分析缓冲液稀释10倍，以形成1x分析缓冲液。加入130μldmso至jc‑1染剂(冻干)中，以形成jc‑1储备溶液。然后，再以1x分析缓冲液稀释jc‑1储备溶液，以形成jc‑1工作试剂(jc‑1workingsolution；即jc‑1粒线体特异性染剂)。稀释倍率为jc‑1储备溶液比1x分析缓冲液为1:100。143.5.胰蛋白酶：10xtrypsin‑edta(购自gibco)以1xpbs溶液稀释10倍。144.6.流式细胞仪：购自bdpharmingen公司，型号bdtmaccuric6plus。145.7.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。146.实验步骤147.1.将ccd‑966sk细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml细胞培养基的6孔培养盘中。148.2.将培养盘的各孔中的培养基更换成2ml实验培养基。其中，实验组a的实验培养基为含有0.5mg/ml的实施例一得到的白桑葚汁液。实验组b的实验培养基为含有0.5mg/ml的实施例一得到的白桑葚发酵物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含白桑葚样品)。149.3.将培养盘置于5％co2、37℃下，培养24小时。150.4.移除培养盘中的实验培养基并以1ml的1xpbs溶液润洗2次。151.5.将200μl胰蛋白酶加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加细胞培养基终止反应。将各孔中的细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5ml离心管内，并将含有细胞与细胞培养基的离心管以400xg离心10分钟。152.6.于离心后移除上清液，再以1ml的1xpbs溶液重新回溶或转移细胞沉淀物至15ml离心管以形成细胞悬浮液。153.7.将含有细胞悬浮液的离心管以400xg离心5分钟。154.8.于离心后移除各离心管中的上清液并加入100μl的jc‑1工作试剂至各离心管。155.9.将各离心管中的细胞沉淀物与jc‑1工作试剂涡旋均匀并在避光处理下培养15分钟。156.10.15分钟后，将各离心管以400xg离心5分钟。157.11.于离心后，移除各离心管中的上清液、以1ml的1xpbs溶液回溶各试管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟，此步骤重复两遍。158.12.于离心后，移除各离心管中的上清液、以500μl的1xpbs重新悬浮细胞，以得到待测细胞液。159.13.以流式细胞仪量测各孔的待检测细胞中细胞粒线体的膜电位，以进行粒线体活性分析。因实验是进行三重复，故将各组的三重复实验的结果平均以得平均值，然后以控制组的平均值为100％的相对jc‑1聚集量，将实验组的平均值换算为相对jc‑1聚集量，如图5所示。160.实验结果161.参阅图5，其为经本发明白桑葚汁液及白桑葚发酵物处理的实验组与未经处理的控制组的jc‑1聚集相对量比较直方图。由所述图5可知，实验组a的相对jc‑1聚集量约为97.5％，然实验组b的相对jc‑1聚集量约为117.19％。换言之，与控制组相较之下，实验组b的人类皮肤纤维母细胞的粒线体活性提升约17.19％。显示白桑葚发酵物可提升皮肤细胞的粒线体活性，而达到提升皮肤细胞活性的效果。162.实施例7.分泌玻尿酸能力检测163.于此，以人类玻尿酸检测套组配合酵素免疫分析仪(elisareader)，测定人类初代皮肤角质细胞hpek‑50经白桑葚发酵物处理后，其细胞分泌玻尿酸的变化。164.材料与仪器165.1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(humanprimaryepidermalkeratinocytes)hpekp(cellntec公司(瑞士)，hpek‑50)。166.2.培养基：无血清的角质细胞培养液(keratinocyte‑sfm)(gibco公司，美国，编号为#10724‑011)。167.3.人类玻尿酸检测套组(humanhyaluronicacid,haelisakit)：购自cusabiobiotech。168.4.酵素免疫分析仪(elisareader)，购自biotek公司。169.5.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。170.实验步骤171.实验将会分为实验组a、实验组b、控制组(未添加白桑葚样本)三组进行：172.1.将人类初代皮肤角质细胞以每孔1×104个的密度，接种于每孔培养于每孔含2ml培养基的96孔培养盘中，并于实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；于实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。173.2.每孔取100μl的培养基，然后加到pre‑coatedelisa盘中中，于37℃下培养2小时。174.3.移除每个孔中的培养基，勿进行清洗。175.4.于每个孔中添加100μl的生物素抗体(biotin‑antibody)，并于37℃下培养1小时。176.5.反应完毕后，移除每孔的培养基，并以洗涤缓冲液(washbuffer)200μl进行清洗，每次清洗静置2分钟，重复此步骤三次。最后一次清洗完成后，透过抽吸除去所有剩余的洗涤缓冲液。(确认完全清除液体)177.6.向每个孔中加入100μlhrp‑抗生物素蛋白(hrp‑avidin)，并在37℃下培养1小时。178.7.反应完毕后，重复步骤6的清洗方式。179.8.于每孔中添加90μltmb底物(tmbsubstrate)，并37℃下避光反应15‑30分钟。180.9.于每孔中添加50μl终止液(stopsolution)，轻轻敲打培养盘以确保其充分混合。181.10.利用酵素免疫分析仪(elisareader)于5分钟内测量每孔450nm的吸光值。182.11.所得结果以excel软件进行统计分析。183.实验结果184.图6是经本发明白桑葚汁液或白桑葚发酵物处理后，角质细胞分泌玻尿酸的结果图。具体而言，实验组a的相对玻尿酸分泌约为130％，然实验组b的相对玻尿酸分泌约为170％。换言之，与控制组相较之下，实验组a及实验组b的相对玻尿酸分泌率皆有提升，其中，实验组a(白桑葚汁液)的相对玻尿酸分泌与控制组相比提升30％，而实验组b(白桑葚发酵物)的相对玻尿酸分泌与控制组相比提升70％，由此可知，白桑葚发酵物的提升玻尿酸分泌的能力相较白桑葚汁液优异。本实施例的结果显示，本发明白桑葚发酵物具有促进玻尿酸分泌的功效，藉此有益于保留皮肤胶原蛋白、增加皮肤含水量，并提供皮肤弹性和柔韧性。185.玻尿酸可以防止皮肤自然老化，并保护皮肤免于太阳紫外线、烟草烟雾和空气中污染物质的危害。玻尿酸亦具有帮助增加皮肤水份，使肌肤结构紧密澎润，以减少皮肤细纹和皱纹的出现。另外，玻尿酸在伤口愈合中也起着关键作用，当皮肤细胞需要修复或受损时其浓度亦会增加，且其应用于皮肤伤口已被证明可以减轻伤口的大小且减缓疼痛，亦可帮助降低伤口细胞感染风险。186.另外，玻尿酸对于骨关节炎亦具有帮助，实验证实每天食用80‑200毫克玻尿酸至少两个月，即可显着减轻骨关节炎患者的膝关节疼痛，亦有助于减轻胃酸反流症状，而玻尿酸具有出色的保湿性，其亦常用于治疗干眼症、减缓骨质疏松及减轻膀胱疼痛症候群等诸多功效。187.实施例8.抑制脂肪堆积功效试验188.脂肪细胞内以油滴(lipiddroplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。189.本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称op9细胞)，op9细胞购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，)的op9细胞株(atcccrl‑2749)。190.首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个op9细胞及500μl培养基(medium)，所述培养基为memam(minimumessentialmediumalphamedium，购自gibco，产品编号cat.12000‑022)细胞培养液加入20％的胎牛血清(fetalbovineserum，购自gibco，产品编号cat.10437‑028)及0.1％的青霉素/链霉素(penicillin‑streptomycin，购自gibco，产品编号cat.15240‑062)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(zeiss；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。191.然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组a、实验组b与控制组。192.实验组：依照每孔500μl培养基含有125μg的由本案实施例一的方式制备而成的白桑葚汁液(实验组a)或白桑葚发酵物(实验组b)，使其浓度为0.25mg/ml，并在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。193.控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。194.接下来，依据下列步骤进行油红o的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1ml的磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline,pbs)清洗脂肪细胞两次，再加入1ml的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1ml的pbs轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1ml的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1ml的油红o作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红o作用溶液并迅速地以1ml的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞。195.后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红o的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μl至96孔培养盘中，以测量elisa读取仪(biotek)读取各组的od510nm读值。其中，利用excel软件进行studentt‑test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异，如图7所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。196.参考图7，将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，实验组b的脂肪油滴含量为82.6％，意即经由白桑葚发酵物处理之后能显着地减少约17.4％的脂肪堆积量。此结果显示，白桑葚发酵物能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积的功效。197.实施例9.白桑葚酵素饮的皮肤改善功效试验198.令10位肌肤较暗沉、松垮不紧致的受试者每日饮用一瓶50ml白桑葚酵素饮(其含有12vol％实施例一中所得到的白桑葚发酵物与88vol％水)，连续饮用4周。并且，于饮用前(即第0周)及饮用4周后(即第4周)，以visia肌肤检测仪(visiacomplexionanalysissystem，购自美国canfield公司)及皮肤表面湿度测试仪(corneometercm825，购自德国c k公司)检测肌肤状况。于此，以visia肌肤检测仪量测肌肤纹理、肌肤紫外线色斑、肌肤皱纹、肌肤弹性及胶原蛋白的改变情况，并且以皮肤表面湿度测试仪量测肌肤含水量。199.请参阅图8，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的紫外线色斑的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均紫外线色斑含量为100％时，饮用4周后的平均紫外线色斑含量为93.3％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均紫外线色斑含量减少6.7％。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有降低紫外线色斑生成的功效，以达到淡斑的效果。200.请参阅图9，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤含水量的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤含水量为100％时，饮用4周后的平均肌肤含水量为120.2％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤含水量提升20.2％，达统计上的显着(「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤含水量，锁住肌肤水分，以及提升肌肤保湿效果的功能。201.请参阅图10，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤弹力的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤弹力为100％时，饮用4周后的平均肌肤弹力为104％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤弹力提升4％，达统计上的显着。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤弹力的功效，使肌肤更加有弹性。202.请参阅图11，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤胶原蛋白的平均改变百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤胶原蛋白含量为100％时，饮用4周后的平均肌肤胶原蛋白含量为115.5％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤胶原蛋白含量提升15.5％，达统计上的显着。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤胶原蛋白含量的功效，胶原蛋白与皮肤的弹性有关，能延缓皮肤的老化并减少皱纹、改善橘皮组织，以使肌肤更加有弹性。203.参照图8至图11，相比饮用前(第0周)，持续4周饮用白桑葚发酵饮可使肌肤紫外线色斑含量减少约6.7％，使肌肤含水量显着提升约20.2％，使肌肤弹力提升约4％，以及使肌肤胶原蛋白含量显着提升15.5％。由此可知，长期使用白桑葚发酵饮可改善肌肤状况，即白桑葚发酵物具改善肌肤状况的功效。204.综上所述，根据本发明任一实施例的白桑葚发酵物，其可于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物。换言之，前述的组合物具有下列一种或多种功能：降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、降低发炎反应因子生成、抑制酪胺酸酶活性、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、促进胶原蛋白增生以及抑制脂肪堆积。205.当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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：：2.爱美是人的天性，肌肤美容及瘦身减脂已成为现代人重视的一大课题，不仅女性费尽心力追求肌肤美白及苗条体态，近年来男生注重于皮肤美白、保健保养的指数节节攀升，而皮肤之所以会变黑，其作用机制在于皮肤每天都直接或间接的暴露于日光照射下，为了保护皮肤不受紫外线的伤害，人体会合成黑色素(melanin)来防御阳光中的紫外线，所述黑色素会导致皮肤出现暗沉蜡黄、斑点或痘斑。3.另外，随着年龄增长肌肤会产生皱纹或松弛等问题，所述皮肤皱纹或松弛已知是由于皮肤纤维母细胞的胶原蛋白产生能力降低而引起；而老化会导致肌肤的含水量降低，使皮肤失去紧致和柔嫩，其与玻尿酸的流失有关，玻尿酸可以用于提升肌肤的保湿程度，同时加强肌肤表层的保护力。4.现今社会，自然有机及天然成分保养品概念逐渐兴起，生技公司及保养品相关业者积极投入天然植物的相关产品研发，为使天然植物类产品对于人体健康保健有实质科学验证的基础，植物的成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。5.白桑葚(morusalba，又名whitemulberry)是一种生长迅速的中小型桑树，其可生长到10‑20公尺高，且其通常被认定为寿命相较短的树种，原产于中国北部和印度，目前广泛种植于世界各地，包括：美国、土耳其、墨西哥、澳大利亚、阿根廷及伊朗等地区，其主要由蚕丝业者所种植目的是用以喂养生产中所使用的蚕，白桑葚叶子可长达30厘米呈锯齿圆形状，而其果实约长1‑1.5厘米，并在成熟时可供食用。6.一般熟知的桑葚果实是呈红色或者黑紫色，然白桑葚果实是为白色，因此亦被称为「白玉王」，其口感比普通黑桑葚更甜一些，而成熟的白桑葚带有一点紫色，待其全熟透后，甜度可达到19度；白桑葚含有的热量不高，适合身体肥胖者食用，且其含有蛋白质、脂肪、维生素、碳水化合物及膳食纤维等微量元素，营养价值丰富。然而，白桑葚是否具有其他功效及用途还未被广泛了解与应用。技术实现要素：7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白桑葚发酵物，其中所述白桑葚发酵物是由一白桑葚果实经由水浸提所得的一白桑葚汁液，再经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵而获得。8.在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液是以一溶剂对一青钱柳提取所得。9.在本发明的一实施例中，所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)。10.在本发明的一实施例中，所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。11.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物进一步以200‑400网目的网筛进行网筛过滤，并于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖进行规格调整，再于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌。12.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的总多酚含量为所述白桑葚汁液的总多酚含量的2‑5倍。13.本发明的另一目的在于提供一种前述白桑葚发酵物用于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。14.在本发明的一实施例中，其中所述改善肌肤状况是为降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生。15.在本发明的一实施例中，所述组合物是透过降低发炎反应因子生成及抑制酪胺酸酶活性以达到所述降低黑色素生成的功效，其中所述发炎反应因子是为一氧化氮。16.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的浓度为至少0.5％(v/v)。17.在本发明的一实施例中，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。18.本发明的另一目的在于提供一种白桑葚发酵物的制备方法，是包括将一白桑葚经由水浸提所得的一白桑葚汁液，经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵，并以200‑400网目的网筛过滤，再于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖调整后，于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌；其中所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)；其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。19.以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。附图说明20.图1是为实施例二的白桑葚汁液及白桑葚发酵物总多酚含量的直方图；21.图2是为实施例三的实验组与控制组的相对一氧化氮生成量比例图；22.图3是为实施例四的实验组与控制组的相对酪胺酸酶活性图；23.图4是为实施例五的实验组与控制组的相对黑色素生成比例图；24.图5是为实施例六的实验组与控制组的相对皮肤细胞粒线体活性图；25.图6是为实施例七的实验组与控制组的相对玻尿酸生成比例图；26.图7是为实施例八的实验组与控制组的相对脂肪油滴含量比例图；27.图8是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对紫外线色斑变化图；28.图9是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对肌肤含水量变化图；29.图10是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对肌肤弹力变化图；30.图11是为实施例九的试验者使用白桑葚发酵物饮4周后的相对胶原蛋白变化图。具体实施方式31.以下将配合图式进一步描述本案的部分具体实施态样，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。32.本案使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，各组的间的差异以学生t检验(student’st‑test)进行分析。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。而「###」符号代表与控制组相比p值小于0.001。33.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负20％的范围内，较佳为在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。34.本文中的「wt％」是指重量百分比，而「vol％」是指体积百分比。关于本文中所使用的「白桑葚」通常是指白桑葚果实。35.本文所述的「有效浓度」或「有效量」是表示能有效降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、抑制脂肪堆积、降低发炎反应因子生成、抑制酪胺酸脢活性、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生所需本发明的白桑葚发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(doseescalation)以实验决定其有效浓度。36.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物是由白桑葚汁液与酵母菌及乳酸菌进行一前发酵程序，再以一醋酸菌进行一后发酵程序所得。37.在本发明的一实施例中，所述白桑葚汁液包括白桑葚及水，所述白桑葚与水的比例为1:5‑20，并根据总重加入5％葡萄糖，使其糖度(degreesbrix)>8.5，并于95℃加热60分钟。38.于前发酵程序中，先添加0.01％‑0.5％的酵母菌至白桑葚汁液内，并将白桑葚汁液与酵母菌发酵1日至2日后，再添加0.01％‑0.25％乳酸菌进行发酵1日至2日以完成前发酵的程序。换言之，所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)，且所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)，其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，并于28℃‑37℃下进行。39.于后发酵程序中，添加1‑20％的醋酸菌静置发酵3‑10天，待brix值小于3.9且ph值等于3.7±1时即终止发酵。40.在本发明的一实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)，在一些实施例中，乳酸菌可以是嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、瑞士乳酸菌(lactobacillushelveticus)、或植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，在一些实施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌(acetobacteraceti)。41.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物可进一步进行网筛过滤、减压浓缩、规格调整及加热灭菌。42.在本发明的一实施例中，网筛过滤以200目数至400目数的网孔的滤网进行过滤，并于55‑65℃进行减压浓缩。43.在本发明的一实施例中，调整规格可透过添加40‑70％的赋形剂(excipient)来调整发酵原液的糖度。在一些实施例中，用以调整糖度的赋形剂可为异麦芽寡糖。44.在本发明的一实施例中，加热灭菌程序可为将原料混合液在95℃至105℃下灭菌100‑120分钟，并将灭菌后的混合液冷却至室温(即25℃至30℃)以形成白桑葚发酵物。在一些实施例中，灭菌后的原料混合液可采取自然降温的方式冷却至室温。45.在本发明的一实施例中，白桑葚发酵物的ph值为4.0±1.0，且白桑葚发酵物的糖度为39±2。46.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的制备方法，是包括将一白桑葚经由水浸提所得的一白桑葚汁液，经由一酵母菌以及一乳酸菌进行一前发酵，再以一醋酸菌进行一后发酵，并以200‑400网目的网筛过滤，再于55‑65℃进行减压浓缩，再添加40‑70％异麦芽寡糖调整后，于95‑105℃下加热100‑120分钟进行灭菌；其中所述酵母菌的添加量为0.01‑0.5％(v/v)、所述乳酸菌的添加量为0.01‑0.25％(v/v)、及所述醋酸菌的添加量为1‑20％(v/v)；其中所述前发酵的发酵时间为1‑3天，且所述后发酵的发酵时间为3‑10天。47.在本发明的一实施例中，前述白桑葚发酵物用于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。在一些实施例中，所述改善肌肤状况是为降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、及/或促进胶原蛋白增生。在一些实施例中，所述组合物是透过降低发炎反应因子生成及抑制酪胺酸酶活性以达到所述降低黑色素生成。在一些实施例中，所述发炎反应因子是为一氧化氮。其中，受体可为人。48.在本发明的一实施例中，所述白桑葚发酵物的浓度为至少0.5％(v/v)。49.在本发明的一实施例中，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。换言之，此医药品、食品或保养品包含有效含量的白桑葚发酵物。50.在本发明的一实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服地、或局部地(topically)投药剂型。51.在本发明的一实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似的物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)或类似的物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)或病灶内注射(intralesionalinjection)。52.在本发明的一实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似的物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)、或含有醇的水性溶液(alcoholcontainingaqueoussolution)。53.在本发明的一实施例中，前述的任一组合物可为食用组合物。换言之，食用组合物包含特定含量的白桑葚发酵物。在一些实施例中，前述的食用组合物可为食品产品或食品添加物(foodadditive)。在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)或膳食补充品(dietarysupplements)。54.在本发明的一实施例中，前述的食用组合物可以口服方式施予受体。其中，食用组合物的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。55.在本发明的一实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的白桑葚发酵物。56.在本发明的一实施例中，前述的化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。57.实施例1.白桑葚发酵物的制备方法58.首先，将白桑葚(morusalba，白桑葚原产地为土耳其)与水以1:10(即，白桑葚为一倍重量，水为十倍重量)的比例混合均匀，再添加5％葡萄糖溶液将糖度调整为8.5，并于95℃下加热60分钟，以获得白桑葚汁液。59.接着，于白桑葚汁液中殖入0.1％啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)，寄存编号bcrc20271)并在约30℃下发酵1天，以得到第一初发酵汁液。接着，于第一初发酵汁液中殖入0.05％嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(购自bcrc，寄存编号bcrc910636)并在约30℃下发酵1天，以得到第二初发酵汁液。最后，于第二初发酵汁液中殖入5％乙酸醋酸菌(acetobacteraceti)(购自bcrc，寄存编号bcrc11688)并在约30℃下发酵5天，以得到第三初发酵汁液。60.再将第三初发酵汁液以目数200的网孔的滤网进行网筛过滤，再于约60℃下进行减压浓缩，以得到发酵原液。最后，添加60％异麦芽寡糖至发酵原液后在约100℃下灭菌2小时，以得到白桑葚发酵物。61.于此，分别对白桑葚汁液以及白桑葚发酵物进行糖度检测。其中，白桑葚汁液的糖度约为8.5，而白桑葚发酵物的糖度约为40。62.实施例2.总多酚含量测试63.秤取10.0mg的没食子酸(gallicacid，购自sigma，料号：g7384)置于10ml容量瓶中，然后以水(h2o)定量至10ml，以得到没食子酸的储备溶液(stocksolution)。将没食子酸的储备溶液稀释10倍，即100μl没食子酸的储备溶液加900μl的水，以得到100μg/ml没食子酸的初始溶液(即含1000ppm的没食子酸)。然后，依据下表一配置0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、及100μg/ml的没食子酸的标准溶液，并分别取100μl的各浓度的标准溶液至玻璃试管中。加入500μl的福林酚试剂(folin‑ciocalteu'sphenolreagent，购自merck，料号：1.09001.0100)至各玻璃试管内与标准溶液混合均匀并静置3分钟后，再加入400μl的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到标准反应溶液。取200μl的标准反应溶液至96孔板中，并测量其在750nm下的吸光值，以获得标准曲线。64.表一65.标准浓度(μg/ml)020406080100初始溶液(μl)020406080100水(μl)10080604020066.将实验组的测试样品(即实施例一的白桑葚发酵物)及对照组的测试样品(即实施例一的白桑葚水萃液)分别以水稀释20倍。将各样本取100μl到玻璃试管中。接着，加入500μl的福林酚试剂至玻璃试管中与样本混合均匀并静置3分钟后，再加入400μl的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到待测反应溶液。将装有待测反应溶液的玻璃试管进行震荡以确保无气泡后，取200μl的待测反应溶液至96孔板中，并测量待测反应溶液于750nm下的吸光值，接着，各样本对应的待测反应溶液的吸光值先除以样本的糖度，再利用标准曲线以内插法换算成总多酚含量。67.总多酚含量结果如图1所示，对照组的总多酚含量为90ppm及实验组的总多酚含量为250ppm，与对照组相较之下，样品组的总多酚含量有显着的提升，于此，可推断出稀释前的白桑葚水萃物及白桑葚发酵物(即经本案实施例一制备方式所制得的白桑葚水萃物及白桑葚发酵物)的实际总多酚含量分别为1800ppm及5000ppm。由此可知，白桑葚透过微生物发酵后，可提升总多酚含量约2.77倍。即，相对于白桑葚水萃物，白桑葚发酵物会大量释出总多酚，并能提升抗氧化活性，可有效减少自由基累积。68.实施例3.抗发炎能力之一氧化氮检测69.为探讨白桑葚发酵物是否具有降低发炎反应的效果，本实施例将巨噬细胞raw264.7作为细胞平台培养，再透过脂多醣(lipopolysaccharide，lps)处理诱导发炎反应产生，并侦测发炎反应因子一氧化氮(no)的生成量，以评估样品是否达到降低发炎反应的效果。70.材料与仪器71.1.细胞株：小鼠巨噬细胞raw264.7，取自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，cat.tib‑71)。72.2.培养基：将dmem改良培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem，购自gibco，cat.11965‑092)添加额外成分使其含有10vol％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs，购自gibco，cat.10437‑028)及1％青霉素‑链霉素(购自gibco，cat.15140122)。73.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号为cat.14200‑075。74.4.脂多醣(lipopolysaccharide，lps)：购自sigma，产品编号为si‑l2880‑25mg。75.5.亚硝酸盐检测试剂盒(griessreagentkit)：购自lifetechnologies，产品编号为1445263。76.6.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。77.实验步骤：78.1.实验将会分为实验组(实验组a及实验组b)、控制组、以及对照组进行；其中所述实验组a为白桑葚汁液组，实验组b为白桑葚发酵物组；各组分别进行三重复试验：79.2.将raw264.7细胞以1x104cells/well的密度种入96孔细胞培养盘，培养液体积为200μl/well，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养24小时。80.3.将待测孔盘中的培养基移除后，于实验组及對照组中加入lps(浓度为200ng/ml)；同时，实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml，作用24小时。(使用不含fbs的培养基配置)81.4.取一96孔盘,每孔加入130μl的二次水，并将反应完的步骤3每孔中取出150μl培养液加入上述已经含有130μl二次水的96孔盘中。82.5.配置griess试剂(reagenta:b＝1:1)，取20μl加入96孔盘各孔中的培养液避光反应30分钟。83.6.以elisa读盘机(购自biotek)，测定o.d.548nm波长的吸光值(od值读值越大，表示no的含量浓度越高)。84.7.使用studentt‑test进行统计分析(*表p<0.05，**表p<0.01，***表p<0.001)。85.实验结果86.参阅图2，其为经本发明白桑葚汁液及白桑葚发酵物处理后的一氧化氮相对生成量改变图，一氧化氮是为重要的发炎反应因子，故本实施例以一氧化氮的生成量作为发炎反应能力的指标。如图所示，对照组相对控制组的一氧化氮生成量为122.86％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的一氧化氮生成量为116.33％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的一氧化氮生成量为106％。由所述实验结果可知，与对照组相比白桑葚汁液及白桑葚发酵物分别降低一氧化氮生成量约6.53％及16.86％，且经白桑葚发酵物处理的raw264.7巨噬细胞的一氧化氮生成量显着低于对照组，表示raw264.7巨噬细胞经白桑葚发酵物处理后可降低发炎反应因子的生成，显示白桑葚发酵物具有抵抗发炎反应及分泌抗发炎因子的功效，且其效果优于白桑葚汁液，而分泌抗发炎因子可以达到降低黑色素沉淀的效果。87.实施例4.酪胺酸酶活性检测88.酪胺酸酶是生物体内黑色素合成的关键，酪胺酸酶会催化酪胺酸转变为l‑多巴(l‑dopa)，接着产生多巴醌(dopaquinone)进而形成黑色素。于此，藉由检测酪胺酸酶活性来了解白桑葚发酵物对于黑色素细胞产生黑色素的能力影响，当酪胺酸酶活性低时，黑色素细胞产生黑色素的能力就会相对降低。89.材料与仪器90.1.细胞株：小鼠黑色素瘤细胞b16f10，购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，no.6475)，以下简称b16f10细胞。91.2.培养基：将dmem改良培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem，购自gibco，cat.12100‑038)添加额外成分使其含有10vol％fbs(fetalbovineserum，购自gibco，产品编号10438‑026)及1％青霉素‑链霉素(购自gibco，cat.15140122)。92.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437‑028。93.4.曲酸(kojicacid)：购自sigma‑aldrich，产品编号k3125‑5g。94.5.全称放射免疫沉淀法缓冲液蛋白质裂解液(ripalysisbuffer(pmsf))：购自sigma‑aldrich，产品编号10837091001。95.6.bio‑radproteinassay，购自biotek，产品编号epoch。96.7.10mml‑多巴(l‑dopa)：将9.8mg的l‑多巴(购自sigma‑aldrich，产品编号d9628‑5g)溶于5ml的0.1mm，ph值7.0的pbs溶液中。97.8.胰蛋白酶：10xtrypsin‑edta(购自gibco)以1xpbs溶液稀释10倍。98.9.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。99.实验步骤100.于每一孔中加入2ml上述培养基，并将b16f10细胞以1.5x105的每孔密度种入一6孔盘中，于37℃下，培养24小时。101.本实验分为控制组、对照组、实验组a及实验组b。其中，各组加入2ml的新鲜dmem培养液。而对照组的培养液额外加入曲酸(kojicacid)，使其浓度为0.5mg/ml，其中曲酸已被广泛认知为具有抑制细胞酪胺酸酶活性的物质；实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并反应培养48小时。102.培养完毕后，将培养液移除，以1xpbs清洗两次。再加入胰蛋白酶‑edta对细胞作用3分钟，回收悬浮的细胞于15ml离心管，以400xg离心5分钟使细胞沉淀。103.再将沉淀细胞以1xpbs清洗两次后，以200μl细胞裂解液让细胞悬浮，震荡混合后以12,000xg离心20分钟。104.将上清液取出至1.5ml离心管中，进行蛋白质浓度的检测：105.先将bio‑rad染剂与去离子水混合(体积比为1:4)，分装500μl至微量离心管中。而后，分别于前述微量离心管中，加入10、8、6、4、2、1与0μl2mg/ml的bsa以制备标准浓度蛋白质。再加入2μl测试样本进行检测。取出前述反应后的测试样本200μl于96孔盘中，以elisa读取仪(购自biotek)测定595nm的吸光值。106.接着，于每孔中加入400μg蛋白质，再加入90μl细胞裂解液，包括控制组及对照组。在避光环境下，在37℃下加入10μl10m的l‑dopa，每10分钟观察一次，直到悬浮液变黑。之后再测定405nm的吸光值。107.酪胺酸酶含量的分析公式为：酪胺酸酶抑制性(％)＝(样本吸光值/控制组吸光值)×100％。所得数值再以微软excel软件，利用studentt检定进行统计分析，其结果如图3所示。108.由图3的结果可知，在本发明的白桑葚样品的处理下，可达到抑制酪胺酸酶活性的功效。具体而言，对照组相对控制组的酪胺酸酶活性为69.87％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的酪胺酸酶活性为86.44％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的酪胺酸酶活性为74.13％。实验组a与控制组相比酪胺酸酶活性降低约13.56％，实验组b与控制组相比酪胺酸酶活性降低约25.87％，由此可知，实验组b(白桑葚发酵物)的酪胺酸酶抑制能力又高于实验组a(白桑葚水萃物)，且本案白桑葚发酵物的功效近似于曲酸的抑制酪胺酸酶活性的效果。因此，藉由本发明实施例所制备的白桑葚发酵物，确实可降低酪胺酸酶活性，进而可减少黑色素的生成，故可应用于减少皮肤黑斑、提升肌肤光泽、白皙度肌肤美白的相关组合物的成分中。109.实施例5.黑色素生成检测110.于此，以elisa读盘机(enzyme‑linkedimmunosorbentassayreader)测定黑色素瘤细胞株b16f10经白桑葚发酵物处理后，其黑色素含量的变化。111.材料与仪器112.1.细胞株：小鼠黑色素瘤细胞b16f10，购自美国典型培养物保存中心(americantypecμlturecollection，no.6475)，以下简称b16f10细胞。113.2.培养基：将dmem(dulbecco'smodifiedminimalessentialmedium，购自gibco，cat.12100‑038)添加额外成分使其含有1vol％的抗生素溶液(antibioticantimycoticsolution，购自gibco，15240‑062)及10vol％的fbs(fetalbovineserum，购自gibco，10437‑028)。114.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437‑028。115.4.以二次蒸馏水配制1nnaoh(购自sigma，产品编号221465)溶液。116.5.elisareader(购自biotek，产品编号flx800)。117.6.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。118.实验步骤119.实验将会分为实验组a、实验组b、控制组及对照组四组进行，各组分别进行三重复试验：120.1.将b16f10细胞以每孔1.5×105个的方式，接种于每孔含3ml培养基的6孔培养盘中。121.2.将培养盘置于5％co2、37℃环境下，培养24小时。122.3.而后，在不干扰附着细胞的情况下，移除每孔的培养基。123.4.本实验分为控制组、对照组、实验组a及实验组b。其中，各组加入2ml的新鲜dmem培养液。而对照组的培养液额外加入曲酸(kojicacid)，使其浓度为0.5mg/ml，其中曲酸已被广泛认知为具有降低黑色素生成效果的物质；实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并使其于37℃下培养24小时。124.5.将反应完毕的实验组a、实验组b及对照组移至蓝光箱中，使其在室温(25±5℃)下接受蓝光照射3小时。另外，控制组移至暗室中，使其在室温下静置3小时。125.6.反应后，将细胞于37℃下培养48小时。126.7.而后，移除培养基，并以pbs溶液清洗细胞2次。127.8.将200μl胰蛋白酶(trypsin‑edta(10x)，购自gibco；产品编号15400‑054)加至每孔中反应3分钟。反应后，添加6ml培养基溶液终止反应。而后收集各孔中的悬浮细胞与培养基至对应的15ml离心试管内，将各离心试管以400xg离心5分钟使细胞沉淀。128.9.以pbs溶液清洗沉淀细胞二次后，再以200μlpbs溶液重新悬浮细胞。129.10.将细胞悬浮液以液态氮冷冻10分钟，再置于室温约30分钟至完全解冻。130.11.完全解冻后，将试管以12,000g离心3分钟。131.12.移除上清液，再以120μl1n氢氧化钠溶液重新悬浮细胞沉淀后，使试管于60℃干浴1小时，以获得待检测样本。132.13.将100μl待检测样本移入一96孔盘，使用elisa读盘机测量细胞溶液在450nm的吸光值。133.实验结果134.实验组以及控制组的黑色素相对表现量是依下列公式计算：黑色素相对表现量(％)＝(各组od450值/控制组od450值)×100％。因实验是进行三重复，故将三重复实验的结果平均后，显示于图4。135.如图4所示，在本发明的白桑葚样品的处理下，可达到降低黑色素生成的功效。具体而言，对照组相对控制组的黑色素生成量为83.9％，实验组a(白桑葚汁液)相对控制组的黑色素生成量为93.54％，而实验组b(白桑葚发酵物)相对控制组的黑色素生成量为86.05％，实验组a与控制组相比黑色素生成降低约6.46％，实验组b与控制组相比黑色素生成降低约13.95％，且本案白桑葚发酵物的功效近似于曲酸的降低黑色素生成的效果。因此，本发明实施例所制备的白桑葚发酵物，确实可有效减少黑色素细胞所生成的黑色素，故可应用于减少皮肤黑斑、提升肌肤光泽、白皙度肌肤美白的相关组合物的成分中。136.实施例6.皮肤细胞粒线体活性实验137.为探讨白桑葚发酵物对皮肤细胞粒线体功能的影响，本实施例以流式细胞仪评估人类皮肤纤维母细胞ccd‑966sk经白桑葚发酵物处理后，其粒线体活性的变化。本实验以jc‑1聚集能力作为粒线体活性的指标，在膜电位正常的健康粒线体中，jc‑1以多聚体(polymer)形式存在，而当粒线体膜电位降低时，jc‑1会变成单体(monomer)，其可当作粒线体活性评估的指标。138.材料与仪器139.1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞ccd‑966sk(bcrcno.60153)。140.2.细胞培养基：含有10vol％fbs(购自gibco)的基础培养基。其中，基础培养基是由eagle’s最低限度基本培养基(eagle’sminimumessentialmedium(mem)，购自gibco，产品编号15188‑319)额外添加成分使其含有1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate，购自gibco)、1.5g/l碳酸氢钠(sodiumbicarbonate，购自sigma)及0.1mm非必需胺基酸(non‑essentialaminoacidsolution，购自gibco)所配制而成。141.3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco。142.4.粒线体膜电位侦测套组(bdtmmitoscreen(jc‑1)kit，型号551302)。其中，粒线体膜电位侦测套组具有jc‑1染料(冻干)及10x分析缓冲液。于使用前，以1xpbs将10x分析缓冲液稀释10倍，以形成1x分析缓冲液。加入130μldmso至jc‑1染剂(冻干)中，以形成jc‑1储备溶液。然后，再以1x分析缓冲液稀释jc‑1储备溶液，以形成jc‑1工作试剂(jc‑1workingsolution；即jc‑1粒线体特异性染剂)。稀释倍率为jc‑1储备溶液比1x分析缓冲液为1:100。143.5.胰蛋白酶：10xtrypsin‑edta(购自gibco)以1xpbs溶液稀释10倍。144.6.流式细胞仪：购自bdpharmingen公司，型号bdtmaccuric6plus。145.7.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。146.实验步骤147.1.将ccd‑966sk细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml细胞培养基的6孔培养盘中。148.2.将培养盘的各孔中的培养基更换成2ml实验培养基。其中，实验组a的实验培养基为含有0.5mg/ml的实施例一得到的白桑葚汁液。实验组b的实验培养基为含有0.5mg/ml的实施例一得到的白桑葚发酵物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含白桑葚样品)。149.3.将培养盘置于5％co2、37℃下，培养24小时。150.4.移除培养盘中的实验培养基并以1ml的1xpbs溶液润洗2次。151.5.将200μl胰蛋白酶加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加细胞培养基终止反应。将各孔中的细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5ml离心管内，并将含有细胞与细胞培养基的离心管以400xg离心10分钟。152.6.于离心后移除上清液，再以1ml的1xpbs溶液重新回溶或转移细胞沉淀物至15ml离心管以形成细胞悬浮液。153.7.将含有细胞悬浮液的离心管以400xg离心5分钟。154.8.于离心后移除各离心管中的上清液并加入100μl的jc‑1工作试剂至各离心管。155.9.将各离心管中的细胞沉淀物与jc‑1工作试剂涡旋均匀并在避光处理下培养15分钟。156.10.15分钟后，将各离心管以400xg离心5分钟。157.11.于离心后，移除各离心管中的上清液、以1ml的1xpbs溶液回溶各试管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟，此步骤重复两遍。158.12.于离心后，移除各离心管中的上清液、以500μl的1xpbs重新悬浮细胞，以得到待测细胞液。159.13.以流式细胞仪量测各孔的待检测细胞中细胞粒线体的膜电位，以进行粒线体活性分析。因实验是进行三重复，故将各组的三重复实验的结果平均以得平均值，然后以控制组的平均值为100％的相对jc‑1聚集量，将实验组的平均值换算为相对jc‑1聚集量，如图5所示。160.实验结果161.参阅图5，其为经本发明白桑葚汁液及白桑葚发酵物处理的实验组与未经处理的控制组的jc‑1聚集相对量比较直方图。由所述图5可知，实验组a的相对jc‑1聚集量约为97.5％，然实验组b的相对jc‑1聚集量约为117.19％。换言之，与控制组相较之下，实验组b的人类皮肤纤维母细胞的粒线体活性提升约17.19％。显示白桑葚发酵物可提升皮肤细胞的粒线体活性，而达到提升皮肤细胞活性的效果。162.实施例7.分泌玻尿酸能力检测163.于此，以人类玻尿酸检测套组配合酵素免疫分析仪(elisareader)，测定人类初代皮肤角质细胞hpek‑50经白桑葚发酵物处理后，其细胞分泌玻尿酸的变化。164.材料与仪器165.1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(humanprimaryepidermalkeratinocytes)hpekp(cellntec公司(瑞士)，hpek‑50)。166.2.培养基：无血清的角质细胞培养液(keratinocyte‑sfm)(gibco公司，美国，编号为#10724‑011)。167.3.人类玻尿酸检测套组(humanhyaluronicacid,haelisakit)：购自cusabiobiotech。168.4.酵素免疫分析仪(elisareader)，购自biotek公司。169.5.白桑葚汁液及白桑葚发酵物：由本案实施例一的制备方式所制得。170.实验步骤171.实验将会分为实验组a、实验组b、控制组(未添加白桑葚样本)三组进行：172.1.将人类初代皮肤角质细胞以每孔1×104个的密度，接种于每孔培养于每孔含2ml培养基的96孔培养盘中，并于实验组a的培养液额外加入白桑葚汁液，使其浓度为0.5mg/ml；于实验组b的培养液额外加入白桑葚发酵物，使其浓度为0.5mg/ml。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。173.2.每孔取100μl的培养基，然后加到pre‑coatedelisa盘中中，于37℃下培养2小时。174.3.移除每个孔中的培养基，勿进行清洗。175.4.于每个孔中添加100μl的生物素抗体(biotin‑antibody)，并于37℃下培养1小时。176.5.反应完毕后，移除每孔的培养基，并以洗涤缓冲液(washbuffer)200μl进行清洗，每次清洗静置2分钟，重复此步骤三次。最后一次清洗完成后，透过抽吸除去所有剩余的洗涤缓冲液。(确认完全清除液体)177.6.向每个孔中加入100μlhrp‑抗生物素蛋白(hrp‑avidin)，并在37℃下培养1小时。178.7.反应完毕后，重复步骤6的清洗方式。179.8.于每孔中添加90μltmb底物(tmbsubstrate)，并37℃下避光反应15‑30分钟。180.9.于每孔中添加50μl终止液(stopsolution)，轻轻敲打培养盘以确保其充分混合。181.10.利用酵素免疫分析仪(elisareader)于5分钟内测量每孔450nm的吸光值。182.11.所得结果以excel软件进行统计分析。183.实验结果184.图6是经本发明白桑葚汁液或白桑葚发酵物处理后，角质细胞分泌玻尿酸的结果图。具体而言，实验组a的相对玻尿酸分泌约为130％，然实验组b的相对玻尿酸分泌约为170％。换言之，与控制组相较之下，实验组a及实验组b的相对玻尿酸分泌率皆有提升，其中，实验组a(白桑葚汁液)的相对玻尿酸分泌与控制组相比提升30％，而实验组b(白桑葚发酵物)的相对玻尿酸分泌与控制组相比提升70％，由此可知，白桑葚发酵物的提升玻尿酸分泌的能力相较白桑葚汁液优异。本实施例的结果显示，本发明白桑葚发酵物具有促进玻尿酸分泌的功效，藉此有益于保留皮肤胶原蛋白、增加皮肤含水量，并提供皮肤弹性和柔韧性。185.玻尿酸可以防止皮肤自然老化，并保护皮肤免于太阳紫外线、烟草烟雾和空气中污染物质的危害。玻尿酸亦具有帮助增加皮肤水份，使肌肤结构紧密澎润，以减少皮肤细纹和皱纹的出现。另外，玻尿酸在伤口愈合中也起着关键作用，当皮肤细胞需要修复或受损时其浓度亦会增加，且其应用于皮肤伤口已被证明可以减轻伤口的大小且减缓疼痛，亦可帮助降低伤口细胞感染风险。186.另外，玻尿酸对于骨关节炎亦具有帮助，实验证实每天食用80‑200毫克玻尿酸至少两个月，即可显着减轻骨关节炎患者的膝关节疼痛，亦有助于减轻胃酸反流症状，而玻尿酸具有出色的保湿性，其亦常用于治疗干眼症、减缓骨质疏松及减轻膀胱疼痛症候群等诸多功效。187.实施例8.抑制脂肪堆积功效试验188.脂肪细胞内以油滴(lipiddroplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。189.本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称op9细胞)，op9细胞购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，)的op9细胞株(atcccrl‑2749)。190.首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个op9细胞及500μl培养基(medium)，所述培养基为memam(minimumessentialmediumalphamedium，购自gibco，产品编号cat.12000‑022)细胞培养液加入20％的胎牛血清(fetalbovineserum，购自gibco，产品编号cat.10437‑028)及0.1％的青霉素/链霉素(penicillin‑streptomycin，购自gibco，产品编号cat.15240‑062)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(zeiss；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。191.然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组a、实验组b与控制组。192.实验组：依照每孔500μl培养基含有125μg的由本案实施例一的方式制备而成的白桑葚汁液(实验组a)或白桑葚发酵物(实验组b)，使其浓度为0.25mg/ml，并在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。193.控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。194.接下来，依据下列步骤进行油红o的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1ml的磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline,pbs)清洗脂肪细胞两次，再加入1ml的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1ml的pbs轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1ml的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1ml的油红o作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红o作用溶液并迅速地以1ml的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞。195.后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红o的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μl至96孔培养盘中，以测量elisa读取仪(biotek)读取各组的od510nm读值。其中，利用excel软件进行studentt‑test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异，如图7所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。196.参考图7，将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，实验组b的脂肪油滴含量为82.6％，意即经由白桑葚发酵物处理之后能显着地减少约17.4％的脂肪堆积量。此结果显示，白桑葚发酵物能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积的功效。197.实施例9.白桑葚酵素饮的皮肤改善功效试验198.令10位肌肤较暗沉、松垮不紧致的受试者每日饮用一瓶50ml白桑葚酵素饮(其含有12vol％实施例一中所得到的白桑葚发酵物与88vol％水)，连续饮用4周。并且，于饮用前(即第0周)及饮用4周后(即第4周)，以visia肌肤检测仪(visiacomplexionanalysissystem，购自美国canfield公司)及皮肤表面湿度测试仪(corneometercm825，购自德国c k公司)检测肌肤状况。于此，以visia肌肤检测仪量测肌肤纹理、肌肤紫外线色斑、肌肤皱纹、肌肤弹性及胶原蛋白的改变情况，并且以皮肤表面湿度测试仪量测肌肤含水量。199.请参阅图8，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的紫外线色斑的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均紫外线色斑含量为100％时，饮用4周后的平均紫外线色斑含量为93.3％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均紫外线色斑含量减少6.7％。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有降低紫外线色斑生成的功效，以达到淡斑的效果。200.请参阅图9，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤含水量的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤含水量为100％时，饮用4周后的平均肌肤含水量为120.2％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤含水量提升20.2％，达统计上的显着(「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤含水量，锁住肌肤水分，以及提升肌肤保湿效果的功能。201.请参阅图10，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤弹力的平均改善百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤弹力为100％时，饮用4周后的平均肌肤弹力为104％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤弹力提升4％，达统计上的显着。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤弹力的功效，使肌肤更加有弹性。202.请参阅图11，其是受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮后的肌肤胶原蛋白的平均改变百分比。其中，当受试者于饮用前的平均肌肤胶原蛋白含量为100％时，饮用4周后的平均肌肤胶原蛋白含量为115.5％。换言之，受试者饮用含本发明的白桑葚发酵物的酵素饮4周后，平均肌肤胶原蛋白含量提升15.5％，达统计上的显着。由此可见，本发明的白桑葚发酵物具有提升肌肤胶原蛋白含量的功效，胶原蛋白与皮肤的弹性有关，能延缓皮肤的老化并减少皱纹、改善橘皮组织，以使肌肤更加有弹性。203.参照图8至图11，相比饮用前(第0周)，持续4周饮用白桑葚发酵饮可使肌肤紫外线色斑含量减少约6.7％，使肌肤含水量显着提升约20.2％，使肌肤弹力提升约4％，以及使肌肤胶原蛋白含量显着提升15.5％。由此可知，长期使用白桑葚发酵饮可改善肌肤状况，即白桑葚发酵物具改善肌肤状况的功效。204.综上所述，根据本发明任一实施例的白桑葚发酵物，其可于制备改善肌肤状况及/或抑制脂肪堆积的组合物。换言之，前述的组合物具有下列一种或多种功能：降低黑色素生成、提升皮肤纤维母细胞粒线体活性、提升玻尿酸分泌、降低发炎反应因子生成、抑制酪胺酸酶活性、减少紫外线色斑、提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、促进胶原蛋白增生以及抑制脂肪堆积。205.当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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