一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及dna重组技术领域，尤其涉及一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)感染是全球面临的主要公共卫生问题之一。据who报道，目前全球有约3亿hbv感染者，其中近1亿在中国；每年因hbv感染所致死的近100万，其中半数在中国。目前临床上治疗乙型肝炎患者的药物主要有干扰素和核苷(酸)类似物两大类，旨在减少患者血清和肝组织中的hbv dna。但在漫长的治疗过程中患者会存在耐药突变以及向肝纤维化、肝硬化和肝癌转化的风险，并且上述药物虽可显著抑制hbv复制，但均不能直接作用于肝细胞核中的hbv复制模板
‑‑
共价闭合环状dna(covalently closed circular dna,cccdna)，因此不能完全清除体内的共价闭合环状dna，导致乙型肝炎难以完全治愈。hbv cccdna是hbv慢性感染及复发的根源，其表达水平是临床监测抗病毒治疗疗效以及指导治疗方案的重要指标。
3.目前针对hbv cccdna靶点治疗所开展的研究主要从两个方面进行，一方面是抑制hbv cccdna的形成，如使用靶向病毒蛋白hbx和hbc负性调控cccdna，以抑制其形成。但是该方法可能会靶向宿主蛋白，导致出现更多的毒副作用。另一方面是清除hbv cccdna，对肝细胞核内的hbv cccdna进行表观遗传学修饰或通过基因编辑靶向清除，如靶向hbv cccdna的组蛋白修饰和dna甲基化修饰等以及基因编辑技术。然而到目前为止，尚未找到能彻底清除乙肝患者肝细胞核内cccdna的有效方法，彻底清除hbv cccdna是乙肝完全治愈的关键所在。
4.crispr/cas(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/crispr
‑
associated proteins)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古菌中的一种免疫系统，现已成为当今生命科学领域的研究热点。有研究表明，crispr/cas9系统可以有效破坏hbv表达模板，且没有明显的细胞毒性。它有可能是在慢性hbv感染患者中根除持续存在的hbv cccdna的一种潜在的方法。
5.但是，crispr/cas9系统要进入细胞发挥作用却面临着一个棘手的问题，即如何高效的同时传递两个大分子：cas9(约160kda)和单向导rna(sgrna，超过100个碱基对)。目前递送crispr/cas9的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体(如慢病毒、腺病毒等)作为研究者常用的一种递送方式，能够根据递送物的特点，将外源性的物质导入细胞体内。这种方式方便、快捷、易实施，然而该方法极易引起生物体内发生癌变、插入突变或引发宿主免疫反应，为后续的研究和治疗带来困难。近年来研究人员开始探索非病毒载体递送方式，以期开发出一种具有无内源性病毒重组、免疫原性低、运载负荷大、不良反应小以及生产合成简便的非病毒载体递送系统。到目前为止，非病毒载体包括金纳米颗粒、石墨烯氧化物、聚合物纳米颗粒以及其他纳米材料等已在体内外实验中初步实现了crispr/cas9的安全输送。然而目前仍未建立一种低免疫原性、高靶向性、运载负荷大、生产合成简
便的高效crispr/cas9递送系统，以及如何对crispr/cas9实施精准的远程时空操作是研究人员面临的主要问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种近红外响应的仿生纳米载体及其制备方法与应用，其解决了现有技术中存在的crispr/cas9递送系统免疫原性高、靶向性低、运载负荷小且无法实现远程时空操作的问题。
7.本发明的一方面，提供一种近红外响应的仿生纳米制剂，包括肝细胞模型的细胞膜和包裹在细胞膜内的纳米载体，所述纳米载体包括近红外响应的上转换纳米粒子和crispr/cas9，所述上转换纳米粒子表面修饰有亲和素蛋白，所述亲和素蛋白和crispr/cas9之间连接有生物素修饰的光解分子。
8.生物素修饰的光解分子(photo cleavable biotin，pcb)是一种紫外线照射的光切割连接剂，包括生物素、pc(photo cleavable)和光响应基团；上转换纳米粒子(upconversion nanoparticles,ucnps)表面修饰有亲和素形成亲和素修饰的上转换纳米粒子(ucnps
‑
avidin)；由于亲和素与生物素之间的强亲和力，pcb可以很容易地与ucnps
‑
avidin结合，形成纳米颗粒uncps
‑
avidin/pcb，然后与crispr/cas9结合生成ucnps
‑
cas9；最后，肝细胞模型的细胞膜包裹ucnps
‑
cas9，形成纳米制剂。通过近红外(nir)光照射，ucnps将高能的nir光转化为低能的uv光，uv断裂pc键，从而释放crispr/cas9，用于可控基因编辑。
9.优选地，所述肝细胞模型为hbv复制肝细胞模型、hbv感染肝细胞模型、原代肝细胞模型中的一种。
10.优选地，所述近红外响应的上转换纳米粒子为核壳结构，ca
2
掺杂的nayf4:yb
3
/tm
3
为核，nayf4:yb/nd为壳。
11.优选地，所述生物素修饰的光解分子为pc生物素
‑
nhs酯。
12.pc生物素
‑
nhs酯(pc biotin
‑
nhs ester)中包含光响应的邻硝基苯基和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)基团，nhs基团与crispr/cas9中的cas9蛋白的氨基连接，在一定光照调节下，邻硝基苯基发生断裂，从而释放crispr/cas9。
13.优选地，所述crispr/cas9包括cas9蛋白和sgrna，所述sgrna对应的dna序列如seq id no.1
‑
3所示。
14.本发明的另一方面，提供一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
15.1)构建crispr/cas9：设计合成sgrna，并将sgrna与cas9蛋白共孵育，制备crispr/cas9；
16.2)制备纳米载体ucnps
‑
cas9：合成上转换纳米粒子，并对上转换纳米粒子进行亲水性改性和亲和素表面修饰，得到uncps
‑
avidin，之后与生物素修饰的光解分子进行连接反应形成纳米颗粒uncps
‑
avidin/pcb，将纳米颗粒uncps
‑
avidin/pcb与步骤1)制备的crispr/cas9共孵育，得到纳米载体ucnps
‑
cas9；
17.3)制备仿生纳米制剂ucnps
‑
cas9@cm：提取hbv复制肝癌细胞模型的细胞膜，并将细胞膜与步骤2)制备的ucnps
‑
cas9混合，通过聚碳酸酯滤膜反复挤压，得到ucnps
‑
cas9@
cm。
18.优选地，骤1)中，sgrna与cas9蛋白的摩尔质量比为1:1
‑
10:1，共孵育的时间为5
‑
15min，温度为37℃。
19.优选地，步骤2)中，所述上转换纳米粒子表面包括油酸配体，所述亲水改性中用到的改性剂为聚丙烯酸，所述亲和素表面修饰的方法为：利用edc/nhs将亲和素连接在上转换纳米粒子的表面；所述连接反应的温度为37℃，时间为2h；uncps
‑
avidin中的avidin和生物素修饰的光解分子的质量比为1:4；所述共孵育的温度为4℃，时间为8
‑
12h。
20.优选地，步骤3)中，所述聚碳酸酯滤膜的孔径为200nm或400nm。
21.本发明再一方面，提供一种近红外响应的仿生纳米制剂在制备治疗肝炎药物中的应用。
22.本发明的技术原理为：
23.ucnps不具有组织靶向能力，从而降低了其在作用部位的治疗效果。现有技术中，在ucnps的表面进行壳聚糖、peg等基团的修饰，并添加靶向配体(包括抗体、肽或适配子等)来增强ucnps的靶向性和延长ucnps在血液中的循环时间。但这种化学修饰很容易被人体免疫系统识别，并被单核吞噬细胞系统清除。并且由于不同组织或细胞的靶向机制也存在较大差异，从而严重限制了人造微纳米运输载体在生物医学领域的应用。而发明人经过反复大量的实验，意外地发现在ucnps外包裹肝细胞模型的细胞膜仿生壳得到的仿生纳米制剂具有更好的稳定性，更长的血液循环时间和更好的同型细靶向能力。同时在ucnps表面修饰亲和素(avidin)，亲和素与pcb中的生物素结合，并将pcb与crispr/cas9连接，形成ucnps
‑
cas9；并用肝细胞模型的细胞膜包裹得到ucnps
‑
cas9@cm。肝细胞模型的细胞膜的同源靶向性，将ucnps
‑
cas9@cm精准的递送至肝细胞，被细胞内化后ucnps
‑
cas9进入肝细胞中。在nir照射下，ucnps将其转化为uv发射光，因pcb中包含了光响应基团，该光响应基团的吸收光谱与ucnps的发射光谱重合，从而使光响应基团发生断裂，释放crispr/cas9，crispr/cas9在核定位信号的引导下进入细胞核，发挥针对hbv的基因编辑作用，实现了细胞膜和crispr/cas9协同治疗抗hbv的目的，并实现了仿生纳米制剂的远程时空操作。
24.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
25.(1)该仿生纳米制剂不但有纳米载体自身的理化性能，而且纳米制剂的天然细胞膜不需要外加修饰，拥有与靶细胞相似的生物活性功能，在生理条件下具有更长的血液循环时间和更好的同型细靶向能力；实验表明该仿生纳米制剂的水动力直径变化在7天内几乎恒定，具有高稳定性；以hepg2.2.15细胞膜包覆的仿生纳米制剂(ucnps
‑
cas9@cm2.2.15)优先在hepg2.2.15细胞中积累，明显优于在293t(人胚胎肾细胞)、hela(人宫颈癌细胞)等异型细胞中的积累，说明该仿生纳米制剂具有高的同型细胞靶向能力；该仿生纳米制剂可以逃逸巨噬细胞的摄取，说明该纳米制剂具有抗吞噬能力，具有长的血液循环时间和低免疫原性；并且在激光照射下导致药物释放来达到协同治疗的目的。而现有技术中，采用聚乙烯亚胺(pei)、硅，peg包覆的上转换纳米粒子并不具有靶向性，抗吞噬性能和稳定性也较低，导致治疗效果较差；
26.(2)ucnps采用核壳结构，核中掺杂ca
2
，和无其他离子掺杂的ucnps相比，能够提高ucnps的荧光强度；ucnps的发射光谱与光敏分子的吸收光谱在360nm处重叠，使得ucnps通过荧光共振能量转移，将能量很好的转移至光敏分子，从而提高crispr/cas9的释放效率，
实现了远程操控，提高了治疗效果；
27.(3)ucnps表面修饰有亲和素，亲和素和生物素具有高亲和性，因此可以连接更多的生物素修饰的光敏分子，从而负载更多的cas9/sgrna，具有级联放大作用，进而起到增强治疗效果的作用；而现有技术中，采用的上转换纳米粒子(比如nayf4:yb/tm)和光敏分子(比如4
‑
羟甲基
‑3‑
硝基苯甲酸)制备的载体，其负载的cas9/sgrna的量会明显降低，导致的治疗效果受到限制；
28.(4)该仿生纳米制剂的脱靶效应几乎可以忽略不计，从而提高了仿生纳米制剂的定点编辑的效率，提高了打靶效率和敲除效率，降低了脱靶率；减少了对脱靶点所在功能区域的影响，从而避免影响其他基因的表达，提高了仿生纳米制剂的安全性；
29.(5)ucnps进行亲疏水组装，通过亲水改性，去掉表面疏水性配体，赋予其水溶性，使其可稳定的分散在水中，从而具有良好的生物相容性；
30.(6)ucnps的粒径小，平均直径大小为64nm，粒径越小越不容易被巨噬细胞当成异物吞噬，从而提高了治疗效果；
31.综上，本发明首次基于生物膜介导的近红外光控触发crispr/cas9靶向清除hbv cccdna，具有很好的抗病毒作用，可从根本上去除乙肝病毒，使乙型肝炎患者能够痊愈，对乙肝治愈提供新的治疗策略，并且本发明的仿生纳米制剂具有低免疫原性、高靶向性、运载负荷大、生产合成简便，并可实现对crispr/cas9的精准时间和空间的远程操作，提高了治疗效果和效率，有望发展成为一种简便、可靠、实用性强的乙肝治疗新方法。
附图说明
32.图1为本发明实施例2中cas9/sgrna体外sgrna靶向基因序列的琼脂糖凝胶电泳图；
33.图2为本发明实施例2中ucnps的特征分析图，其中，a为nayf4：yb/tm/ca的sem图像；b为其尺寸直方图；c为nayf4:yb/tm/ca@nayf4:yb/nd(ucnps)的sem图像；d为其尺寸直方图；e为ucnps的hrtem图像；f为ucnps的saed；
34.图3为本发明实施例2中ucnps的特征分析图，其中，a为nayf4：yb/tm/ca的tem图像；b为nayf4:yb/tm/ca@nayf4:yb/nd(ucnps)的tem图像；c为ucnps的xrd模式图：d为ucnps及其edx元素分析图；e为任意单位的ucnps、ucnps
‑
paa、avidin和ucnps
‑
avidin.的紫外
‑
可见吸收光谱；f为ucnps、ucnps
‑
paa和ucnps
‑
avidin的傅里叶红外光谱；g为用808nm激光激活的ucnps和ucnps
‑
paa的荧光光谱和pc biotin
‑
nhsester(pcb)的紫外吸收光谱，插图是ucnps的亮场(左)和nir激发下的荧光图片(右)；
35.图4为本发明实施例3中细胞膜的表征图：a为cms的透射电镜图像、b为cms的流体动力直径、c为cms的zeta电位；
36.图5为nir控制的ucnps
‑
cas9@cm的表征图：a为ucnps
‑
cas9@cm的tem图像；b为ucnps
‑
cas9@cm的sem图像；c为cms、ucnps和ucnps
‑
cas9@cm的水动力尺寸分布；d为cas9/sgrna、ucnps
‑
paa、ucnps
‑
avidin、ucnps
‑
avidin/pcb、ucnps
‑
cas9和ucnps
‑
cas9@cm的zeta电位；e为细胞总蛋白、ucnps
‑
cas9@cm、avidin和cas9蛋白(36pmol)的sds
‑
page蛋白分析(从左到右，样品用考马斯亮蓝染色；f为(i)细胞裂解液和(ii)cms的wb分析；g为ucnps
‑
cas9@cm的水动力直径随时间的变化；h为用808nm激光在不同照射时间测定ucnps
‑
cas9上
清液的紫外吸收(280nm)；i为细胞与ucnps
‑
cas9@cm在nir
‑
/ 照射孵育后的clsm图像(白色：gfp标记的cas9；浅灰色：dapi)；
37.图6为clsm观察ucnps
‑
cas9@cm被细胞内化后nir对crispr/cas9的控制释放作用效果图：a为细胞在无nir照射下与ucnps
‑
cas9@cm一起孵育后的效果图；b为细胞在nir照射下与ucnps
‑
cas9@cm一起孵育后的效果图；
38.图7为ucnps
‑
cas9@cm的免疫逃逸和同型靶向实验结果图：a为raw264.7细胞与ucnps
‑
cas9或ucnps
‑
cas9@cm共培养6小时后的clsm图像和流式细胞仪图谱；b为hepg2.2.15、293t、hela、l929细胞与ucnps
‑
cas9@cm
2.2.15
共培养6小时后的clsm图像和流式细胞仪图谱；
39.图8为raw264.7细胞与ucnps
‑
cas9和ucnps
‑
cas9@cm共培养3小时或6小时后，raw264.7细胞的clsm图像；
40.图9为四种细胞系与ucnps
‑
cas9@cm共培养1h、3h或6h后的clsm图像；
41.图10为细胞活力测试结果图：a为不同nir功率(固定20min，无ucnps
‑
cas9@cm)照射后的细胞活力；b为固定nir功率为2.0w/cm2，不同照射时间(无ucnps
‑
cas9@cm)的细胞活力；c为不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm(无nir)处理后的细胞活力；d为不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm(nir功率：2.0w/cm2，固定20min)照射后的细胞活力；其中，ucnps
‑
cas9@cm浓度以cas9浓度(um)的形式标记；
42.图11为经或不经nir辐照后，ucnps
‑
cas9@cm溶液的温度变化图；
43.图12为ucnps
‑
cas9@cm在体外对hbv的基因编辑作用：a为ucnps
‑
cas9@cm在经/不经nir照射处理后，在hepg2.2.15和hepad38细胞中t7ei的实验结果；b、c为hepg2.2.15细胞中pcr扩增sgrna17作用靶向基因的片段的测序结果图；d
‑
f为qrt
‑
pcr分析ucnps
‑
cas9@cm在经nir照射处理后，hepg2.2.15和hepad38细胞中hbv 3.5kb mrna、细胞内hbv dna和hbv cccdna水平，pbs处理组作为阴性对照；g
‑
h为ucnps
‑
cas9@cm在经nir照射处理后，hepg2.2.15和hepad38细胞上清液中hbsag和hbeag水平的elisa结果；
44.图13为ucnps
‑
cas9@cm在体内的生物相容性和毒性分析结果图：a为不同浓度ucnps
‑
cas9@cm对小鼠红细胞的溶血影响，ucnps
‑
cas9@cm浓度以cas9浓度(um)的形式标记；b为用ucnps
‑
cas9@cm和pbs分别处理14天后小鼠的血液常规和血液生化水平；c为用ucnps
‑
cas9@cm和pbs分别处理14天后小鼠体重的变化；d为静脉注射ucnps
‑
cas9@cm后7天内粪便和尿液中的镧系离子(y
3
)含量；e为用ucnps
‑
cas9@cm和pbs分别处理14天后对小鼠主要器官的h&e染色，比例尺：60um；
45.图14为ucnps
‑
cas9@cm在体内对hbv的基因编辑作用：a为采用qrt
‑
pcr检测hbv
‑
tg小鼠血清中血清hbv dna载量；b
‑
c为采用化学发光免疫法测定小鼠血清中hbsag和hbeag的水平；d为用ucnps
‑
cas9@cm处理14天后，hbv
‑
tg小鼠肝内hbsag和hbeag表达水平的代表性图像(免疫组化染色，量尺：30um)；
46.图15为ucnps
‑
cas9@cm在体外hepg2.2.15细胞(a
‑
b)和体内小鼠肝脏(c
‑
d)的脱靶效应：15a、15b中浅灰色表示带有错配位点和错配碱基的脱靶序列列表。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
48.实施例1设计合成针对靶向hbv基因组的sgrna
49.从已发表的文献中选择3个hbv特异性sgrna(rt、6和17)，使用t7rna聚合酶从dna模板中体外转录sgrna。使用hiscribet7快速高产量rna合成试剂盒(neb，#e2040s)合成sgrna，然后使用dnasei(takara，#2270a)在37℃下15分钟去除模板dna。最后，用hipurerna试剂盒(magen，#r2144)纯化得到的rna。获得的sgrna使用nano
‑
500分光光度计(奥盛)测量，并保存在
‑
80℃直到进一步使用。sgrna rt、sgrna 6和sgrna 17对应的dna序列如seq id no.1
‑
3所示。体外转录的dna模板序列如表1，seq id no.4
‑
6所示。
50.表1 dna模板序列
[0051][0052]
注：划线部分为目标靶基因序列，5'端为t7启动子，3'端为sgrna scaffold。
[0053]
实施例2cas9/sgrna体系的构建和表征
[0054]
1.将合成的sgrna与带有核定位信号(nls)和gfp表达的cas9蛋白(egfp
‑
cas9
‑
nls，购自南京金斯瑞科技公司)按摩尔质量比1:1在37℃下共同孵育10min，使其形成复合体cas9/sgrna。
[0055]
2.cas9/sgrna体外切割hbv cccdna的活性检测
[0056]
2.1以pch9/3091质粒为模板，pcr扩增含sgrna靶向基因序列的目的片段。所使用的引物序列如表2，seq id no.7
‑
12所示。
[0057]
表2引物序列
[0058][0059]
2.2将sgrna、cas9以及10
×
反应缓冲液(200mm hepes，1m nacl，50mm mgcl2，1mm edta，ph6.5)按照表3所示配置反应体系。然后加入5ul纯化后的具有sgrna靶序列的全长pcr片段(fl)，于37℃条件下反应2h。最后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率。
[0060]
表3 cas9/sgrna体外切割hbv cccdna的反应体系
[0061][0062][0063]
实验结果如图1所示。结果显示：cas9/sgrna17具有较高的裂解效率。
[0064]
实施例3纳米载体ucnps
‑
cas9的制备与表征
[0065]
1.油酸钙前驱体的制备
[0066]
将油酸钠(naoa)6.09g溶解在20ml无水乙醇中，在圆底烧瓶中与10ml硝酸钙溶液(10mm)混合。然后加入35ml环己烷，混合溶液在80℃下回流加热4h。完成后，混合物冷却到室温，转移到分离漏斗。收集上层，用水洗涤。最后，通过旋转蒸发去除残留的环己烷，得到白色油酸钙前驱体。
[0067]
2.ca
2
掺杂的nayf4:yb
3
/tm
3
(nayf4:yb/tm/ca)的合成
[0068]
将0.5mm裸核前驱体lncl3水溶液加入到三口烧瓶中，加热到100℃，直到形成固体氯化物，lncl3水溶液包括0.1205g氯化钇(ycl3·
6h2o)、0.03874g氯化镱(ybcl3·
6h2o)和0.000958g氯化铥(tmcl3·
6h2o)。然后，加入油酸钙前驱体30mg、油酸(oa)3.75ml和十八烯(ode)7.5ml，得到混合物1。将混合物1被加热到150℃搅拌1.5h，形成均匀溶液，然后冷却至室温。然后，将含有naoh 0.05g和氟化铵(nh4f)0.074g的甲醇溶液5ml滴入反应中，50℃搅拌30min，将溶液加热至100℃30min，蒸发甲醇。然后，将溶液在300℃下加热1.5h，然后冷却至室温。所有实验均在氩气条件下进行。最后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀，12000rpm离心5min，用乙醇/环己烷(1：1v/v)洗涤几次，4ml环己烷分散，得到ca
2
掺杂的nayf4:yb
3
/tm
3
溶液。
[0069]
3.nayf4:yb/tm/ca@nayf4:yb/nd核壳型上转换纳米材料(ucnps)的合成
[0070]
将0.4mm核壳前驱体lncl3水溶液(包括0.04852g ycl3·
6h2o、0.07172g ndcl3·
6h2o、0.01549g ybcl3·
6h2o)加入到三口烧瓶中，加热至100℃，直到形成固体氯化物。然后加入oa 7.5ml和ode 15ml，得混合物2。将混合物2加热至150℃，反应1.5h，搅拌形成均匀溶液，然后冷却至室温。然后，将4ml预制备的ca
2
掺杂的nayf4:yb
3
/tm
3
溶液和含有naoh 0.04g和nh4f 0.0592g的5ml的甲醇溶液滴加到反应中，在50℃下剧烈搅拌30min。将溶液加热至100℃30min，蒸发环己烷和甲醇。然后，将溶液在300℃下加热1.5h，然后冷却至室温。所有实验均在氩气条件下进行。最后，加入2倍体积无水乙醇沉淀，12000rpm离心5min，用乙醇/环己烷(1:1v/v)洗涤几次。最后在60℃下干燥12h，得到ucnps。
[0071]
4.ucnps
‑
cas9的制备
[0072]
将聚丙烯酸(paa)0.5g和二乙二醇10ml的混合物加热到110℃、1小时。将2ml含有30mg ucnps的环己烷滴加入反应中，在110℃下搅拌1h。随后将溶液再加热到240℃、1小时，
然后冷却到室温。加入稀释盐酸(ph4
‑
5)，然后进行涡旋，12000rpm离心5min。得到羧基功能化的ucnps(ucnps
‑
paa)。
[0073]
使用1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨丙基)
‑
碳化二亚胺(edc)/n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)共价化学方法将亲和素结合到ucnps
‑
paa的表面。具体方法为：将1mg uncps
‑
paa、50mg edc和25mg nhs分散在1ml的2
‑
(n
‑
吗啉)乙醇酸缓冲液(mes，0.1m，ph5.5)中，37℃，温和旋转孵育1h。然后立即加入1mg亲和素，ph调整为8。反应溶液在4℃下保持孵育过夜。获得的ucnps
‑
avidin，洗涤3次。将获得的ucnps
‑
avidin 1mg(按avidin算)在600ul pbs中重悬，然后与4mg pc biotin
‑
nhs ester(重悬在400ul pbs中，购自sigma)溶液混合，在37℃下旋转2h，收集纳米颗粒uncps
‑
avidin/pcb，用pbs洗涤3次；同时将nls
‑
cas9
‑
egfp蛋白和sgrna在pbs中混合10min(37℃)形成crispr/cas9(或称为cas9 rnp、cas9/sgrna)；然后将crispr/cas9与得到的纳米颗粒uncps
‑
avidin/pcb在4℃旋转过夜12h，得到ucnps
‑
cas9。之后使用超滤自旋柱(vivaspin500,300kd)对混合物进行透析，丢弃未结合的crispr/cas9。回收的ucnps
‑
cas9在500ul pbs中重悬，并在4℃下短暂保存。
[0074]
通过紫外
‑
可见分光光度计、负染色电镜、透射电镜(transmission electron microscope,tem)、扫描电镜(scanning electron microscope，sem)、动态光散射(dynamic light scattering，dls)等对上述产物进行光谱分析和形态、大小、电荷等表征。
[0075]
实验结果如图2、图3、图5d所示。结果显示：钙掺杂的nayf4:yb
3
/tm
3
颗粒，平均直径为41nm(图2a
‑
b、图3a)。nayf4:yb/tm/ca@nayf4:yb/nd为平均直径大小64nm的核壳结构(图2c
‑
d，图3b)。hrtem和saed显示ucnps的晶格条纹间距为0.52nm，对应于六边形结构的典型(100)平面(图2e
‑
f)。xrd显示ucnps具有六边形相，因为衍射峰可以很好地索引到六边形的β
‑
nayf4(jcpds卡no.28
‑
1192)(图3c)。透射电镜元素分析图显示了详细的ucnps复合结构(图3d)。这些结果表明，nayf4:yb/tm/ca@nayf4:yb/nd核壳型ucnps已成功合成。
[0076]
紫外
‑
可见光谱、fitr光谱(图3e
‑
f)和zeta电位(图5d)测量证明水溶性羧基功能化的ucnps
‑
paa的表面修饰。如图3e
‑
f所示，ucnps
‑
paa修饰后，亲和素的主要紫外吸收最大值发生了蓝移。ftir在1737cm
‑1和1558cm
‑1处的可见吸收峰表明c＝o和coo
‑
基团的拉伸振动，表明羧基的有效修饰，而在1643cm
‑1(酰胺)处也观察到n
‑
h的弯曲振动。图5d显示，ucnps在经paa修饰后，zeta电位约为
‑
46.46mv；在偶联上亲和素以后，zeta电位约为22.02mv；这些结果表明ucnps
‑
avidin合成成功。与ucnps相比，ucnps
‑
paa的荧光强度没有降低。此外，pcb的紫外
‑
可见吸收光(uv
‑
vis)吸收与ucnps的发射光谱部分重叠(图3g)。
[0077]
实施例3仿生纳米制剂ucnps
‑
cas9@cm的制备与表征
[0078]
1.细胞膜碎片的提取
[0079]
选择hepg2.2.15和hepad38细胞作为肝细胞模型，并收集细胞膜碎片(cms)。按照细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(碧云天，产品编码p0033)操作进行：首先，用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，收集在ep管中，用适量冰浴预冷的pbs轻轻重悬细胞沉淀，计数细胞，然后在4℃，600g离心5分钟沉淀细胞。把1ml临用前添加了pmsf的膜蛋白抽提试剂a加入至2000
‑
5000个万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10
‑
15分钟。把细胞悬液转移到提前冰浴预冷的玻璃匀浆器中，匀浆约30
‑
50下。然后在4℃，700g离心10分钟，小心收集上清液至一新的ep管中。最后在4℃，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。弃去上清，将沉淀进冷冻干燥，保存在
‑
80℃行。并对提取的细胞膜碎片进行表征，结果如图4所示。
[0080]
2.制备ucnps
‑
cas9@cm
[0081]
选用孔径为400nm、200nm的聚碳酸酯滤膜依次对ucnps
‑
cas9和细胞膜碎片的混合溶液进行挤压。反复挤压21个循环后，离心去除上清液中残留的细胞膜，获得的ucnps
‑
cas9@cm重新置于pbs缓冲液中，4℃保存。
[0082]
采用sds
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)方法进行细胞膜的表征。首先，按照标准方案进行蛋白质电泳。然后，用考马斯亮蓝染色，使用冰醋酸过夜脱色，可见蛋白质条带。为了进行western蛋白印迹分析，将细胞膜蛋白电泳印迹到硝化纤维素膜上。使用指定的抗体进行检测，包括gapdh(proteintech，#60004
‑1‑
ig)、na /k
‑
atp酶(proteintech，#14418
‑1‑
ap)、组蛋白h3(bimake，#a5737)、细胞色素c(bimake，#a5184)、pan
‑
cadherin(bimake，#a5614)和二抗羊抗兔igg(proteintech，#sa000001
‑
2)。用ecl试剂(millipore)观察信号，分析细胞膜提取的纯度。
[0083]
采用808nm波长的nir激光器(中国长春激光技术有限公司)研究了cas9 rnp的释放情况。用nano
‑
500分光光度计测定紫外吸收光谱。
[0084]
实验结果如图4
‑
6所示。由结果可知，提取的细胞膜没有细胞核、线粒体等其他细胞器，说明细胞膜具有很高的纯度(图4a)，并通过动态光散射(dls)测量细胞膜的粒径和zeta电位(图4b
‑
c)；透射电镜图像显示了ucnps
‑
cas9@cm具有核
‑
壳结构，外层壳的厚度约为10nm(图5a)，同时用扫描电镜检测其表面形态(图5b)；用动态光散射(dls)测量粒径和zeta电位(图5c
‑
d)；图5e可知源细胞膜内的膜蛋白被广泛保留，并且有与单体亲和素(17kda)和cas9(160kda)对应的条带，表明亲和素和cas9成功地嵌入仿生纳米制剂中；在10ul ucnps
‑
cas9@cm溶液中，cas9蛋白带约为纯cas9蛋白带(36pmol)带的1/3；由此可知，每10ul的ucnps
‑
cas9@cm溶液中含有大约12pmol的cas9；图5f结果显示，pan cadherin和na

/k

‑
atpase(膜标记物)保留良好，而不是gapdh(胞质标记物)、细胞色素c(线粒体标记物)和组蛋白h3(核标记物)，表明膜蛋白具有选择性保留；由此可知，细胞膜碎片成功地包覆在ucnps
‑
cas9纳米颗粒上；由图5g可知ucnps
‑
cas9@cm也表现出良好的稳定性，水动力直径的变化在7天内几乎恒定；图5h显示，280nm处的吸光度随nir照射时间的增加而增加，而无nir照射组没有这一趋势；图6中的clsm显示，在细胞与ucnps
‑
cas9@cm共培养3h后，gfp标记的cas9的位置位于细胞质中；在nir照射下6小时，ucnps
‑
cas9@cm在细胞核中可见gfp荧光，而对照组(无nir)的gfp荧光只出现在细胞质中(图5i)；由此可知，本发明的纳米制剂有对crispr/cas9释放的时间和空间远程控制的潜力。
[0085]
实施例4ucnps
‑
cas9@cm体外免疫逃逸和同型靶点的研究
[0086]
以ucnps
‑
cas9为对照，研究ucnps
‑
cas9@cm对小鼠巨噬细胞raw264.7的抗吞噬能力。将raw264.7(小鼠巨噬细胞)细胞接种于24孔培养板中，培养板上铺有细胞爬片。细胞与gfp标记的ucnps
‑
cas9和ucnps
‑
cas9@cm在dmem培养基中共同孵育。然后用4％多聚甲醛固定细胞20min，用含有dapi的防荧光猝灭剂进行封片，通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm，leicatcssp8，德国)观察。此外，采用流式细胞仪(贝克曼库尔特，美国)分析cas9
‑
gfp的在细胞的积累水平。结果如图7a、8所示。
[0087]
由结果可知：细胞中显示的荧光显示，raw264.7细胞在共培养6h后内化了大量的ucnps
‑
cas9。相比之下，与ucnps
‑
cas9@cm共培养的raw264.7细胞表现出非常弱的荧光信号。此外，采用流式细胞术评估其内化效率，与clsm观察到的结果一致。这些结果表明，细胞
膜包被的颗粒能有效抑制巨噬细胞的摄取行为。
[0088]
为了验证ucnps
‑
cas9@cm的同型靶向能力，本发明在hepg2.2.15、293t(人胚胎肾细胞)、hela(人宫颈癌细胞)中评估了hepg2.2.15细胞膜包覆的ucnps
‑
cas9纳米载体(称为ucnps
‑
cas9@cm
2.2.15
)的细胞内化进行了评估。结果显示：ucnps
‑
cas9@cm
2.2.15
优先在hepg2.2.15细胞中积累，并表现出较高的荧光强度。相反，异型细胞组的荧光强度要弱得多(图7b)。然后用流式细胞术测定每个细胞的平均荧光强度(mfi)。数据显示，与其他细胞相比，hepg2.2.15细胞内的mfi含量约为3.5～4.1倍(图7b)。此外，随着时间的推移，细胞的内化速度会更快(图9)。这些结果表明ucnps
‑
cas9@cm对源细胞具有高度靶向的特异性。
[0089]
实施例5ucnps
‑
cas9@cm的体外治疗效果
[0090]
1.细胞的活力试验
[0091]
将hepg2.2.15和hepad38细胞在96孔板中培养12小时后，用不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm、nir功率和辐照时间进行处理。pbs为阴性对照。然后，在每孔中加入10％的cck
‑
8溶液，孵育4h。通过测定od
450
值来评估细胞活力。
[0092]
1.1在ucnps
‑
cas9@cm处理细胞前，检测不同的nir功率和辐照时间对细胞活力的影响。结果如图10所示。由结果可知：不同的nir功率(固定照射时间为20分钟)和不同光照时间(固定照射功率为2w/cm2)对hepg2.2.15和hepad38细胞的活力不受影响(图10a、10b)。
[0093]
1.2加入ucnps
‑
cas9@cm处理细胞后，研究了不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm(无nir)对细胞活力的影响；不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm在固定的激光功率和光照时间(2w/cm2，20分钟)条件下对细胞活力的影响。结果如图10所示。由结果可知：在上述条件下，对细胞活力无显著影响(图10c、10d)。
[0094]
1.3通过照射ucnps
‑
cas9@cm溶液来观察温度的变化。温度分布结果如图11所示。由结果可知：在实验过程中采用1min照射后停止2min间隔，ucnps
‑
cas9@cm不会因为产热过高对细胞造成伤害。
[0095]
2.ucnps
‑
cas9@cm的体外效果检测
[0096]
将hepg2.2.15和hepad38细胞在96孔板中培养12小时后，用ucnps
‑
cas9@cm(cas9浓度为0.06um)再培养4小时后，用nir进行照射，功率2w/cm2，辐照时间20分钟，照射1分钟，间隔2分钟，循环往复。pbs为阴性对照。
[0097]
2.1ucnps
‑
cas9@cm切割hbv cccdna效率检测
[0098]
继续培养3天后，使用allpuredna/rna试剂盒(magen，中国)分别从hepad38细胞和hepg2.2.15细胞中分离基因组dna。用pcr扩增sgrna17作用靶向基因的片段，对pcr扩增后的dna进行t7ei酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图12a所示。同时，将hepg2.2.15细胞的pcr扩增产物克隆到ptopo
‑
blunt载体(中国mei5，中国)上进行测序，结果如图12b、c所示。
[0099]
由结果可知，ucnps
‑
cas9@cm可成功的切割基因hbv cccdna(图12a)，具有高的切割效率；ucnps
‑
cas9@cm nir治疗组的pcr扩增子表现出dna测序双峰，证实了hbv cccdna位点发生突变(图12b
‑
c)。
[0100]
2.2.hbv3.5kbrna、hbvdna和hbvcccdna的检测
[0101]
采用rt
‑
qpcr方法检测hbv 3.5kbrna、细胞内hbv dna和hbv cccdna水平。
[0102]
从hepg2.2.15和hepad38细胞中分离hbv dna。具体方法为：首先，细胞在0.5ml核心裂解缓冲液(10mm tris
‑
hcl ph8.0,1mm edta、1％np
‑
40、2％蔗糖)中37℃下裂解15分
钟。离心后，用4ul dnasei(5iu/ml)和5ul mgcl2(1m)在37℃下处理4小时。进一步离心，200ul 35％peg8000与上清液在冰浴中孵育1小时，沉淀hbv核心衣壳。然后用蛋白酶k在45℃下处理12h。通过苯酚/氯仿(1:1)提取法纯化hbv dna，用乙醇沉淀，并在te缓冲液中重悬。提取的hbv dna采用一对特异性引物(hbv
‑
f
2150
和hbv
‑
r
2300
)，采用qpcr法进行定量。
[0103]
采用改良的hirt法分离hbvcccdna。具体方法为：细胞在0.5ml sds裂解缓冲液(50mm tris
‑
hcl，ph8.0,10mm edta，150mm氯化钠，1％sds)37℃中裂解15分钟，然后将裂解液与125ul kcl(2.5m)在4℃下孵育过夜。离心后，用苯酚/氯仿(1:1)提取上清液，用异丙醇沉淀，用乙醇清洗，在te缓冲液中重悬。采用taqman探针qrt
‑
pcr检测hbv cccdna。
[0104]
采用实时荧光定量聚合酶链反应(qrt
‑
pcr)检测hbv pgrna的表达。具体方法为：将细胞接种于24孔板中过夜，然后分别用pbs和ucnps
‑
cas9@cm(cas9浓度为0.06um)处理细胞。孵育3h后，用808nm nir激光器(2w/cm2)照射20min(1min照射后停止2min)。72h后，用allpuredna/rna试剂盒从细胞中提取rna，然后用cdna合成试剂盒逆转录(takara)。qrt
‑
pcr采用sybr green qpcr master mix(bimake，中国)，采用abi7500实时pcr系统(美国应用生物系统公司)进行。将靶基因的转录归一化为gapdh，并采用2
‑
δδct
法对结果进行分析。所用引物序列如表4，seq id no.13
‑
21所示。
[0105]
表4引物序列
[0106][0107]
2.3hbsag和hbeag的检测
[0108]
采用elisa试剂盒(科华生物技术，中国上海)检测hepg2.2.15和hepad38细胞培养上清中的hbsag和hbeag水平。
[0109]
结果如图12d
‑
h所示。由结果可知，与阴性对照组相比，细胞与ucnps
‑
cas9@cm孵育后，hbv3.5kbrna、细胞内hbvdna、hbvcccdna和hbv病毒抗原均显著下降。说明ucnps
‑
cas9@cm能够清除细胞内的hbv cccdna，具有明显的抗病毒作用。经检测，其效果明显优于ucnps
‑
cas9，而cms对抗hbv没有任何治疗效果。
[0110]
实施例6ucnps
‑
cas9@cm在体内的抗病毒作用
[0111]
选取6只hbvdna、hbsag水平和hbeag水平较高的hbv
‑
tg小鼠，随机分为两组，每组3只。然后连续3天给小鼠注射pbs或ucnps
‑
cas9@cm，每次ucnps
‑
cas9@cm注射浓度为2mg/kg(cas9浓度)，pbs组注射为ucnps
‑
cas9@cm等体积溶液，然后用nir激光照射肝脏30min(照1分钟，停2分钟，循环往复)。注射后第14天摘取小鼠眼球取血，然后颈椎脱位处死小鼠，再解
剖小鼠肝脏和其他主要器官。
[0112]
1.ucnps
‑
cas9@cm的安全性评估
[0113]
在治疗过程中，在注射后每2天监测一次体重。为了进一步分析体内ucnps
‑
cas9@cm的排泄情况，采用icp
‑
ms测定粪便和肾脏排泄的镧系离子(y
3
)浓度。分别对小鼠血液进行血液常规和血液生物化学检测和小鼠的主要器官进行组织学分析，以评估基于ucnps
‑
cas9@cm的毒性。实验结果如图13所示。
[0114]
由结果可知：用不同浓度的ucnps
‑
cas9@cm与小鼠血细胞共同孵育后，未检测到溶血情况(图13a)。此外，两组小鼠血液常规和血液生物化学等血液分析没有明显变化(图13b)，体重也没有明显变化(图13c)。小鼠尿液和粪便中y
3
水平随着时间的推移逐渐下降，提示ucnps在体内可以有效排泄(图13d)。两组小鼠主要器官的he染色显示，治疗后没有发现显著差异(图13e)。这些结果再次证实了ucnps
‑
cas9@cm具有良好的生物相容性。
[0115]
2.ucnps
‑
cas9@cm的体内抗病毒作用
[0116]
分别对小鼠血液中hbv dna、hbsag和hbeag进行检测，肝细胞中hbsag和hbe进行检测，以评估ucnps
‑
cas9@cm的体内抗病毒作用。实验结果如图14所示。
[0117]
经过ucnps
‑
cas9@cm和nir光处理后，可不同程度地显著降低小鼠血清hbv dna、hbsag和hbeag的分泌水平(图14a
‑
c)，通过免疫组化检测发现小鼠肝细胞的hbsag和hbe水平也下降(图14d)。这与体外实验结果一致。
[0118]
实施例7ucnps
‑
cas9@cm的脱靶效应检测
[0119]
按照上述实施例5
‑
2和实施例6的方法，用ucnps
‑
cas9@cm分别处理hepg2.2.15细胞和小鼠后，使用allpuredna/rna试剂盒(magen，中国)分别从hepg2.2.15细胞和小鼠肝组织中分离基因组dna。通过生物信息学软件预测sgrna17的潜在脱靶位点，用特异性引物扩增脱靶基因组位点，特异性引物序列见表5(h:人，m:鼠)，seq id no.22
‑
47所示。对产物进行t7ei检测，结果如图15所示。15a、b为ucnps
‑
cas9@cm的体外脱靶效应：a中浅灰色为错配位点和错配碱基的脱靶序列列表；b为采用t7ei检测，对得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确定染色体不同靶序列(chr#)中潜在的脱靶效应；15c、d为ucnps
‑
cas9@cm的体内脱靶效应：c中浅灰色为错配位点和错配碱基的脱靶序列列表；d为采用t7ei检测，对得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确定染色体不同靶序列(chr#)中潜在的脱靶效应。
[0120]
表5特异性引物
[0121]
[0122][0123]
以上结果表明，ucnps
‑
cas9@cm的脱靶效应可以忽略不计。sgrna17可以特异性地识别并熟练地编辑hbv。
[0124]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明/实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明/实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明/实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明/实用新型技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明/实用新型的权利要求范围当中。