一种新的快速高效低价的人工合成疫苗的设计和应用的制作方法

1.本发明涉及一种新的快速高效低价的人工合成疫苗的设计和应用。


背景技术：

2.大多数领先专家表示，可靠的检测将有助于控制大流行和个人感染，但最终目标是有效的疫苗。不幸的是，这种病毒的疫苗在小型临床试验之外是无法获得的，美国专家表示，如果一切顺利商业疫苗将在2021年初到年中之前才能获得。本文档介绍了原理，设计， sars-cov-2疫苗的配方和鼻内自我给药。从2020年3月开始，我们小组遵循了这些协议，这些协议是基于以前的出版物和关于sars-cov-2的快速增长的预印本文献为基础，以生产和自我管理多代逐步改进的疫苗。
3.有大量已发表的关于疫苗生产、测试和给药途径的所有方面的信息，其中一些是针对sars-cov-2病毒的。公布的信息足以在比商业疫苗短得多的时间内建立疫苗和进行药效试验。疫苗是所有治疗类中最安全的。由于其安全性和有效性，他们在整个临床试验过程中获得成功的概率最高（超过40%，大约是下一个最高级别的两倍）。由于这一点和这一流行病的影响，已计划进行加速的商业试验，并已开始绕过扩展的动物研究，其中一些将直接进行人类试验(例如，moderna, biontech, curevac, 等)。
4.然而，商业疫苗的设计必须能够大规模生产和部署，并且它们需要监管部门批准才能销售，这极大地限制和减缓了进展。至关重要的是，商业疫苗的某些特性不需要研究水平的生产和测试；因此，对于规模较小的、自我管理的疫苗来说，更短的时间是可能的。在疫苗研究和技术开发方面有许多进展，但并没有在商业产品中使用，部分原因是商业疫苗的设计和生产受到不同因素的限制，与小规模的研究疫苗不同。疫苗的关键属性是高安全性、低成本和易于生产和管理。我们在本文中讨论了这些问题，并考虑了如短期和长期安全等问题。
5.商业疫苗和研究疫苗的关键问题和一些区别因素：近期安全在制备时，鼻内疫苗的近期安全性应该是极好的。鼻内疫苗具有长久的安全性。这里描述的疫苗制剂也可以用于其他输送途径，包括吸入、口服或注射，但这些（特别是后者）只应由熟练的从业者尝试。一般来说，吸入肺部、口服或鼻给药疫苗比注射更安全。本文件的重点是鼻内给药，但专家将知道如何将这里的信息适应于另一种传递途径。对于任何给药途径，采购高质量的材料和精心准备是维护疫苗安全的关键。
6.长期安全任何疫苗的长期安全性目前都很难或无法预测，甚至广泛部署的商业疫苗也导致了严重和不可预见的并发症。显示出严重副作用的疫苗是可注射的完整病毒或亚单位制剂。至少有三种潜在的严重并发症可能长期出现：耐受性、疫苗增强的疾病和佐剂触发免疫或神经损伤并发症。
7.免疫耐受是一个术语，意思是由于接触抗原而导致的免疫力下降。这种减弱的免疫反应通常在食物抗原和体内的“自发”抗原中观察到。一般来说，人们认为极大和/或频繁的照射和口服剂量会导致耐受性。
8.疫苗增强疾病。少量注射疫苗导致了疾病的增强，这意味着相对于未接种疫苗的对照组，接种疫苗的人传染性增强，或者疾病变得更加严重。这是对呼吸道合胞病毒、登革热、寨卡病毒和非典疫苗的反应。一种机制是抗体依赖性增强(ade)，其中全身免疫系统的抗体增加免疫病理学(在sars的情况下，特别是肺组织)或以其他方式增强疾病。这突出了鼻内疫苗的一个重要优点：强大的粘膜免疫反应应该通过消除初始感染来大大减少或防止这种系统反应。一份关于sars-cov-2的早期报告表明，sars-cov-2受体结合结构域(rbd)的中和抗体没有表现出这种增强。我们提到抗sars-cov-2疫苗的ade和其他可能的负面结果，以提供足够的风险背景，但一些专家认为，ade在开发抗这种病毒的疫苗方面并不是关键。
9.佐剂过度刺激或毒性：佐剂有助于刺激对疫苗的强烈免疫反应；然而，某些佐剂引起了过度刺激和其他严重的副作用。例如，明矾产生强大的th2免疫反应，但th2：th1的比例不平衡。th2过度刺激，与免疫病理有关，包括ade。添加剂也可能有毒。例如，鼻内使用解毒突变形式的大肠杆菌热不稳定毒素已导致短暂贝尔麻痹，或面神经麻痹。在商业疫苗中使用强佐剂的原因之一是，一次给药即可引发强大的免疫反应，并避免加强免疫。
10.稳定：稳定性是商业疫苗的关键决定因素。在研究环境中既安全又有效，但保质期有限的配方通常被排除在商业产品之外。我们发现，疫苗的配方非常简单、安全和有效，但只有短期稳定性。例如，壳聚糖凝胶纳米粒子被证明是非常有效和非常简单的配方，但保质期短导致它们在商业疫苗中的使用有限。
11.鼻内给药：鼻内疫苗比其他递送方法有优势，包括最常见的注射递送方式。鼻腔给药已被证明是非常安全的，轻微的副作用与安慰剂治疗后相同。重要的是它不仅能引起全身免疫，而且还能引起呼吸道病毒感染点的粘膜免疫。商业鼻内流感疫苗是可用的，对全身免疫的效力相当于注射给药，但对呼吸道病毒进入部位(鼻子，肺）的粘膜免疫的效力更大。这对sars-cov-2至关重要，因为早期的研究表明，大多数感染都是从鼻腔开始的。截至2020年6月，开发中的大多数或所有商业sars-cov-2疫苗都被设计为注射，这一途径不太可能为感染提供粘膜免疫。
12.初免-加强：鼻内注射可以像注射一样有效，但要达到这种免疫反应和保护水平——特别是对于较温和的佐剂——通常需要多次注射。最初的剂量是主要的，随后的剂量是为了增强或增加免疫反应。在接触病原体或密切相关的病原体之前，其作用与疫苗的主要剂量相似。唯一常用的鼻内疫苗是流感疫苗。由于基本上每个人都自然暴露在流感中，带有减毒病毒的鼻腔疫苗在本质上是加强免疫的。加强疫苗的需求限制了疫苗的商业化生产，而此前普遍存在这种疫苗的可能性不大。
13.由于多种原因，包括上述原因，商业疫苗难以实现鼻内给药。但是，对于研究疫苗而言，它不仅相对容易，在某些情况下，对于某些病原体类型（如呼吸道病毒），它是首选的给药方式。相对于注射，没有针刺伤或血液传播感染的风险。通过鼻内途径进行免疫接种，不仅可以防止病毒通过鼻黏膜感染，而且可以有效地刺激肺部和上呼吸道的粘膜免疫应答。例如，gai及其同事已经证明，鼻内递送的sars疫苗可引发强大的粘膜免疫反应，从而防止初始感染，而注射同样的疫苗则不能。这种差异很重要，因为粘膜表面（鼻、肺、胃肠、泌尿生殖等）的面积非常大，大约是皮肤表面积的200倍，大约70%的病原体通过这些途径进入。单次给药依从性也很高，因为鼻内给药不会涉及针头或引起疼痛。高安全性和易管理性有望提高免疫接种率。有关鼻用纳米疫苗研究的最新综述，见bernocchi等人见表1。
14.基于合成肽的疫苗相对于基于减毒病毒甚至关键表位蛋白的全长开放阅读框（orf）的最广泛使用的疫苗设计具有优势。在动物和人类细胞研究中，冠状病毒穗状病毒和核仁全长蛋白已与ade相关。 yasui和他的同事表明，核衣原体疫苗接种不能提供保护性免疫，但可以增强免疫病理学。用spike蛋白的某些表位进行疫苗接种确实可以提供保护，但是使用不建议使用全长钉。例如，来自tais及其同事：
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...应谨慎使用全长s蛋白。 kam等。报道说，尽管重组的三聚体sars-cov s蛋白疫苗在小鼠中引起了保护性免疫反应，但抗-s抗体还介导了抗体依赖性病毒在体外进入人b细胞的增强作用。在另一项研究中，用bhk21和vero e6细胞中生长的重组修饰牛痘安卡拉表达的sars-cov全长s蛋白疫苗接种的雪貂显示出sars-cov诱导的肝炎毒力增强。此外，使用sars s蛋白疫苗可能会导致疾病和免疫病理增强，而不是像猫冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒那样得到保护。考虑到这些问题，使用全长s蛋白的sars疫苗策略对人类而言可能不是最佳选择。因此，最好的方法可能是使用小的s蛋白表位，它们是主要的中和决定因素。”针对类似使用其他病原体的疫苗全长构建体还引起病毒敏感性或疾病的增强。此处描述的疫苗设计基于s或刺突蛋白的此类b细胞肽表位，预计是主要的中和决定因素，以及预测和实验测试的有效t细胞表位。一些是组合的b和t细胞表位。
15.合成肽的合成为设计足够长的抗原表位提供了自由，但预计不会引发这些严重的副作用。这种方法还允许使用多表位肽，这些表位肽可以组合成单个多聚线性肽，也可以作为单个肽的集合。此处采用的方法使用了s蛋白的单个b细胞表位肽，以及s和其他蛋白的t细胞表位。某些b细胞表位氨基酸序列包含预测的t细胞表位。我们使用了其中一些组合表位。基于中和抗体和先前感染sars-cov-2的恢复期患者的t细胞反应的数据，选择了较新版本的表位。s
16.佐剂的选择对于安全增强免疫反应很重要。已经比较了许多佐剂引起免疫应答各个方面的能力。这些包括明矾，壳聚糖，灭活的霍乱毒素（ct），cpg dna，单磷酰脂质a（mpl），poly ic，加地基莫德和大肠杆菌热不稳定毒素。明矾是铝盐（硫酸铝钾，alk（so4）2），是商业疫苗中使用最广泛的佐剂。它已经作为一种有效的佐剂使用了近一个世纪。直接比较中，较高剂量的明矾优于大多数其他佐剂，包括鼻内注射疫苗。在动物研究中，发现明矾在引发全身免疫方面（在igg1，igg2a，igg2b中）等于或优于大多数其他动物，在引发分泌性iga（siga）粘膜免疫和抗病毒攻击方面也优于或超过其他大多数。聚（i：c）可以作为辅助剂使用；但是，它相对于明矾显示出较弱的活性，并且已在动物模型中引发了自身免疫。
17.基于壳聚糖的治疗剂已被开发用于许多生物医学应用。在疫苗应用方面，壳聚糖既可作为纳米颗粒，又可作为佐剂，用于鼻内给药、肠外注射、口服和舌下给药等。它在动物实验中得到了广泛的应用，并且已经安全地用于人体临床和临床前试验（有些是使用商业产品粘凝胶）。guro gafvelin和hansgr
ö
nlund在“分子疫苗：从预防到治疗-第2卷，matthias giese编辑”；第39页，第pp页中回顾的部分人体试验） 624-629； springer，请参阅表39.1。
18.用壳聚糖滴鼻给健康志愿者接种流感疫苗可产生全身性（igg）保护作用，尽管比含明矾佐剂的肠胃外疫苗要少（尽管15微克的剂量很低）；另外，与肠胃外疫苗不同，它还可以诱导粘膜免疫反应。
19.壳聚糖作为佐剂已与注射用和鼻内形式的明矾和其他佐剂单独或作为佐剂混合
物的一部分进行了比较。单独的壳聚糖是有效的粘膜和全身佐剂，它与明矾和其他佐剂具有协同作用。重要的是，以壳聚糖为基础的疫苗经鼻腔给药可以同时激发黏膜免疫和全身免疫。


技术实现要素：

20.本发明要解决的技术问题是：商业疫苗的设计必须能够大规模生产和部署，它们需要监管部门批准才能销售，这极大地限制和减缓了进展。至关重要的是，研究级的生产和测试不需要商业疫苗的某些功能。因此，对于规模较小的、自我管理的疫苗来说，更短的时间是可能的。在本文中，我们描述了使用成熟，便宜且大多为现成的成分配制的疫苗。所描述的sars-cov-2疫苗可以在各种实验室和医师办公室环境中快速廉价地生产。我们的团队快速部署疫苗合作组织（radvac）于2020年4月下旬生产并首次向我们自己注射了疫苗。截至6月中旬，我们已经设计并自行管理了第六代（gen 6）疫苗。这将是一个版本化的活文件，使疫苗的设计和测试能够逐步改进。
附图说明
21.下面结合附图对本发明的具体实施方式加以详述：
22.①
安全成分。发布结果的悠久历史；
23.②
生产的简易性和稳健性。制造简单，但可能会折中短期稳定性。在多种条件和成分浓度下；
24.③
壳聚糖纳米粒子可自发且可重复形成；
25.④
鼻内免疫。呼吸道和鼻病毒的首选传递方式。最高的安全性。潜在地刺激感染部位的保护性粘膜免疫和全身免疫；
26.⑤
多肽表位抗原。线性表位的短肽最容易获得或产生，并且被预测在没有特定结构限制的情况下发挥最佳作用。这些可以从丰富的文献中提取，也可以从新产生。掺入疫苗的抗原可以合成产生或作为重组表达蛋白产生；
27.⑥
加速计划进展。允许使用鼻内给药和较低剂量或更温和的佐剂，但有可能产生与单剂量高刺激性佐剂等效的免疫反应；
28.图1. 示意图显示th1和th2获得性免疫的途径(a.k.a。适应性免疫)，以及mhci类和ii类的作用。
具体实施方式
29.现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的技术原理，因此其仅显示与本发明有关的构成。
30.关键技术特点和规格
31.①
鼻内给药可能是最安全的给药途径。对于呼吸道病毒，鼻内递送具有在病毒进入位点引起粘膜免疫反应的优点。鼻内给药也可引起全身免疫，尽管通常不如单剂后肠胃外给药那样快速；
32.②
壳聚糖纳米颗粒和佐剂。成功的疫苗取决于成功的递送和免疫刺激佐剂。许多
佐剂已被验证和可用性，各有其优缺点。基于壳聚糖和三磷酸钠（stp）或三聚磷酸酯（tpp）的领先的纳米颗粒鼻腔输送和佐剂组合系统是鼻内疫苗的首选。壳聚糖是几丁质的一部分或完全脱乙酰化的衍生物，几丁质是在甲壳类动物的壳（如虾）中发现的线性多糖。可以使用简单的可调参数来创建各种大小的纳米粒子。理想情况下，纳米粒子的大小应调整为100 nm至200 nm之间。如上所述，已证明壳聚糖是安全且耐受良好的，并且鼻内递送引起粘膜和全身免疫应答；
33.③
可能的其他佐剂/免疫刺激剂。壳聚糖是一种th1免疫触发，自佐剂多糖。因此，并非绝对需要额外的佐剂或免疫刺激剂，并且不会将任何佐剂或免疫刺激剂掺入初始制剂中。但是，如果单独使用壳聚糖不能产生足够的免疫刺激，我们正在考虑尝试加入其他可增强th1或特定t细胞靶向反应的佐剂。
34.肽抗原：基于肽的疫苗是我们选择的方法。
35.①
已经证明多聚/多表位疫苗是有效的。此处采用的方法是使用多种肽，每种肽将携带一个或多个b和/或t细胞表位。
36.②
合成肽价格便宜，可以快速从很多肽的制造商处订购。它们可以合成许多可能的化学修饰，这些修饰据报道可以提高免疫原性。
37.③
radvac疫苗的早期版本包含简单的线性表位，没有特别考虑其构象。从gen 3开始，大多数b细胞表位肽都被二硫键构象约束。理想情况下，应该对病毒蛋白质的3d结构成像，并选择不需要特殊构象约束的线性表位，或者应该尝试实现表位肽的天然结构构象。
38.④
其他抗原也是可能的，并且可以由壳聚糖经鼻内递送，包括dna或rna。
39.表位选择至关重要。b细胞和t细胞表位已被其他人选择和发表。应该选择两种类型的多个表位，最好是在病毒的高度保守区域。这样，每个表位成功地刺激免疫力的可能性提高，而不是依赖于单个表位。
40.b细胞表位：来自恢复期患者的抗体图谱研究有助于鉴定可用于抗体结合b细胞表位的病毒部分，在人类细胞研究中已显示其中一些抗体可中和病毒感染。在康复期血清中，尚未以较高的频率报道某些通过常见机器学习预测获得高分的b细胞表位。这可能是由于基于线性肽的方法可绘制表位，病毒周围广泛的聚糖屏蔽或其他复杂因素。无论采用哪种解释，我们都认为恢复期抗体数据优于纯粹的计算预测。
41.t细胞表位：与用于b细胞表位选择的那些相似但比其复杂的经验方法已经用于选择优良的t细胞表位。
42.测试：黏膜和全身免疫刺激的成功获得将通过测试洗鼻液、唾液和血清的抗体滴度来评估。免疫测试将使用目前正在开发的标准检测方法和试剂，以及使用新技术，例如外周血单核细胞（pbmcs）的转录组图谱分析进行。