胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型的激动剂中的应用的制作方法

胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型的激动剂中的应用
1.本发明涉及胡椒碱作用靶点的发现，胡椒碱能够激活人的苦味受体14亚型(htas2r14)，是htas2r14的一个高效激动剂。具体为胡椒碱能够激活消化道内分泌细胞htas2r14，可作为在制备糖尿病、肥胖症等治疗和预防药物中的应用。


背景技术：

2.味觉强烈影响着食物的偏好和摄取，脊椎动物对食物或化合物的感受器是不同的味觉受体(taste receptors,tasrs)，味觉受体最初被发现于口腔的味蕾中。人的味觉受体包括两种类型，即甜味受体(htas1rs)和苦味受体(htas2rs)。htas2rs是一类g蛋白藕联受体(gpcrs)，由疏水性七次跨膜区域、胞外较短的氨基末端、胞内羧基末端、3个细胞外环状结构和3个细胞内环状结构构成。htas2rs信号通路具有高度的保守性。htas2rs被配体激活后，htas2rs与gαβγ复合体分离，通过两种途径发挥作用：(1)gαgust
‑
pde途径，tas2rs被激活后使g蛋白α亚基味导素(gαgust)分离，从而导致磷酸二酯酶(pde)异构化，camp水平下降；camp水平下降导致camp对离子通道的抑制作用解除，触发选择性的ca
2
通道开放，继而引起细胞内ca
2
浓度的升高，细胞膜去极化，使神经递质或激素释放。(2)gβγ
‑
plcβ2途径，htas2rs被激活后释放gβγ亚基，进而使磷脂酶β2(plcβ2)活化，产生三磷酸肌醇(ip3)和二酰基甘油，ip3激活内质网上其受体3(ip3r3)，引起ca
2
动员、胞内ca
2
增加，而dag使pkc活化引起胞内ca
2
增加，这些使细胞膜上的瞬时受体电位离子通道蛋白m5(trpm5)激活，导致阳离子如na 等内流和膜去极化，使神经递质或激素释放。
3.目前已知的人类tas2rs有25个，包括htas2r1，3，4，5，7，8，9，10，13，14，16，19，20，30，31，38，39，40，41，42，43，45，46，50，60，其中htas2r14、10、46三个亚型的激动剂谱远远大于其他亚型。tas2rs还存在于口腔外组织中，如呼吸、胃肠、脑等系统。
4.肠是最早被发现存在味觉感受信号的口腔外组织(proc natl acad sci usa1996；93(13):6631
‑
6634)。早期报道发现胃肠道htas2r14激活可促进肠促胰酶肽的分泌，从而抑制食欲。近年来的报道显示，呼吸道htas2r14激活后可改善阻塞性气道疾病。目前htas2r14被激活后引起的生物功能仍有待研究，。
5.胡椒碱(piperine，pip)是黑胡椒(胡椒科胡椒属)的主要刺激性成分和特有气味的化合物，是黑胡椒中含量最高的天然生物碱(2％
‑
9％)。黑胡椒的粗提物和活性成分(主要是生物碱)具有广泛的药理活性，特别是抗氧化、抗抑郁、肝保护、抗微生物、抗肥胖、治疗认知障碍、降血糖、抗高脂血症、免疫增强和抗炎等。然而，未见胡椒碱作为苦味受体14激动剂的报道。
6.

技术实现要素：

7.1.发明目的
8.本发明目的发现胡椒碱在作为人的苦味受体14亚型的激动剂，拓展了胡椒碱的新用途。
9.2.技术方案
10.胡椒碱在制备作为htas2r14以及htas2r14的啮齿类动物的同源受体的激动剂中的应用，其中htas2r14的啮齿类动物的同源受体包括tas2r140，113，116，125。
11.本发明研究思路：以肠道内分泌细胞中htas2r14激活后能够促进肠促胰岛素glp
‑
1的分泌为指标，研究胡椒碱激活htas2r14信号通路后所产生的生物效应。通过实验证明胡椒碱是人的苦味受体14亚型的激动剂。
12.文献报道人的结直肠腺癌细胞系nci
‑
h716和caco
‑
2细胞均具有肠内分泌细胞(enteroendocrine)的功能，能够分泌一些肠肽激素。caco
‑
2细胞为贴壁生长细胞，不需要分化等，容易培养及给药观察。我们对caco
‑
2细胞中htas2r4，10和14基因表达的丰度进行了研究，发现htas2r14，4和10基因表达的丰度依次降低，其中htas2r14基因表达最高，分别为htas2r4和htas2r10的9.46倍和28.84倍。因此，本发明以caco
‑
2细胞为研究对象，观察胡椒碱对htas2r14信号通路的激活作用，以及glp
‑
1分泌的影响。我们通过上海交通大学分子设计实验室开发的网络平台bitter x，预测了能够与胡椒碱结合的htas2rs，发现有9个亚型，其中htas2r4，14和10的可能性较高，最大可能性在75％
‑
80％。
13.本发明公开了胡椒碱是一个htas2r14的高效激动剂，能够激活肠道内分泌细胞中htas2r14信号通路，进而促进glp
‑
1分泌的作用，我们研究发现，胡椒碱能够增加caco
‑
2细胞胞内钙的动员和glp
‑
1的分泌，增加htas2r14的蛋白表达和mrna水平，增加plcβ2蛋白表达和trpm5蛋白表达。另一方面，与htas2r14藕联的g蛋白的gβγ亚基抑制剂和胡椒碱合用明显减弱了胡椒碱对glp
‑
1的分泌，plcβ2抑制剂和胡椒碱合用显著减弱了胡椒碱对glp
‑
1的分泌。最重要的是，我们建立了敲低htas2r14的caco
‑
2细胞，发现敲低htas2r14后，胡椒碱增加plcβ2和trpm5蛋白表达的作用被抵消。另外，文献报道化合物6
‑
甲氧基黄酮(6
‑
methoxyflavone)是htas2r14拮抗剂，能够拮抗htas2r14激动剂sensing competence stimulating peptide 1的效应(faseb j.2021；35(3):e21375.)，然而，我们发现不同浓度的6
‑
甲氧基黄酮和胡椒碱共处理caco
‑
2细胞后，胞内钙离子浓度没有降低反而显著增加，表明6
‑
甲氧基黄酮不是拮抗而是激动htas2r14，与胡椒碱有协同效应。
14.通过上述胡椒碱和htas2r14信号通路的各种药理试验及其结果，来说明胡椒碱是htas2r14的一个高效激动剂。
15.3.有益效果
16.以上药理试验结果表明本发明具有以下优点：
17.(1)本发明首次发现胡椒碱能够激活htas2r14信号通路，是htas2r14的一个高效激动剂。htas2r14在机体的多个系统中都有表达，尤其是消化道的内分泌细胞中表达丰富。而且，htas2r14具有非常广泛的激动剂谱，与htas2r10和htas2r46属于激动剂谱最广的三个苦味受体亚型。
18.文献报道，南非原产蝴蝶仙人掌中提取的甾体皂苷能够选择性地激活htas2r7和htas2r14，进而促进胃肠道肠促胰酶肽的分泌，从而抑制食欲，这提示htas2r14激动剂还可
以通过影响消化道其他肠肽激素的分泌发挥改善代谢性疾病的作用。由于htas2r14的功能并不完全清晰，并非强调胡椒碱治疗如糖尿病等代谢疾病，本发明所要强调的是胡椒碱作为htas2r14的激动剂，htas2r14的激动剂可以启动多种信号通道和产生不同功能，如改善代谢疾病、呼吸道疾病等作用。
19.(2)本发明使用的天然产物胡椒碱是一种高效htas2r14激动剂，促进胞内钙离动员和glp
‑
1分泌的有效浓度较低，属于几微摩尔每升级别，而且低于合成的htas2r14激动剂氟芬那酸(cellular and molecular life sciences 2020；77:531
–
542)的有效浓度(属于几十微摩尔每升级别)，通常htas2rs激动剂促进胞内钙离动员的有效浓度都在百微摩尔每升及以上级别。这些表明本发明中胡椒碱激动htas2r14引起肠肽激素的分泌的效价强度较高，为良好的潜在抗代谢性疾病药物。
20.(3)本发明使用的两种htas2r14激动剂胡椒碱和氟芬那酸能够显著促进glp
‑
1分泌及htas2r14信号通路的激活，而htas2r14敲低明显减弱了胡椒碱对htas2r14信号通路的激活作用。然而，文献报道的htas2r14拮抗剂6
‑
甲氧基黄酮没有拮抗、反而增强了胡椒碱对htas2r14的激动作用。这些表明htas2r14为胡椒碱的作用靶点，同时也表明htas2r14的拮抗剂的发现任重而道远，因此而说明htas2r14作用的复杂性。
附图说明
21.图1胡椒碱对caco
‑
2细胞plcβ2蛋白表达的影响。ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine.细胞免疫荧光法测定蛋白表达水平。scale bar:20μm。
22.图2htas2r14敲低对胡椒碱增加caco
‑
2细胞plcβ2蛋白表达的影响。ctrl:control；nc:negative control；pip
‑
50:50μm胡椒碱piperine；shrna:sh
‑
htas2r14 rna.细胞免疫荧光法测定蛋白表达水平。scale bar:20μm。
具体实施方式
23.实施例1：胡椒碱和氟芬那酸对caco
‑
2细胞胞内钙离动员和glp
‑
1分泌的影响
24.1材料与方法
25.1.1细胞系
26.caco
‑
2细胞(fh0029)购自上海富衡生物科技有限公司。
27.1.2药品与主要试剂
28.1.2.1药品：胡椒碱(purity>98％)购自成都普思生物科技股份有限公司；氟芬那酸(purity>99％)购自上海源叶生物科技有限公司。
29.1.2.2试剂：dmem高糖培养基(4.5g/l葡萄糖)购自北京索莱宝科技有限公司；trizol试剂(15596
‑
026)购自美国invitrogen公司；primescript rt reagent kit(perfect real time)(rr037a)和sybr premix ex taq ii购自大连takara公司；dnase/rnase
‑
freeh2o(t121
‑
02)购自天根生化科技(北京)有限公司；cck
‑
8试剂盒购自上海dongren化学科技有限公司；fura
‑
2钙离子荧光探针购自江苏碧云天生物技术研究所；人的glp
‑
1(7
‑
36)elisa试剂盒购自上海博蕴生物科技有限公司。
30.1.3方法
31.1.3.1分组及给药：caco
‑
2为贴壁生长细胞，常规培养于含10％fbs和1％双抗(青链霉素)dmem高糖培养液中，5％co2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为对照组(ctrl)、不同浓度pip及fa处理组，培养30min后收集细胞，进行胞内钙离子浓度测定；培养1h后收集培养基进行glp
‑
1水平测定；培养24h后进行其他相关指标测定。
32.1.3.2细胞活力测定：采用cck
‑
8法测定细胞活力。根据1.3.1培养细胞，pip设置0.1，1，10，50，100μmol/l五个浓度，同时设置ctrl组，培养24h后收集细胞，按照试剂盒操作步骤进行测定。
33.1.3.3mrna水平测定：rt
‑
qpcr法测定mrna水平。采用trizol提取总rna，测定总rna浓度，依据试剂说明书进行操作。测定其纯度，od
260/280
在1.8
‑
2.0间的样本为合格样本。每个样本取0.5μg总rna用于逆转录成cdna，具体操作依据cdna反转录合成试剂盒说明书进行。合成的cdna用罗氏480荧光定量pcr仪进行扩增。在扩增结束后，扩增溶解曲线以检测扩增片段的纯度。cp值越小，目的基因的含量就越高。以2
‑⊿
cp
值(
⊿
cp＝
⊿
cp
β
‑
actin
﹣
⊿
cp
目的
)作为该样本的基因表达的相对数值。
34.1.3.4钙离子浓度测定：采用荧光探针法测定细胞内钙离子浓度。细胞接种于96孔板预培养24h，pbs洗三次，加入fura
‑
2钙离子荧光探针工作液避光孵育45min，pbs洗三次，加入含不同浓度两种药物的培养基避光孵育30min。采用荧光酶标仪，分别检测激发波长340nm和380nm，发射波长510nm处的荧光强度，钙离子浓度用340nm与380nm处的荧光强度比值反映，比值越大，钙离子浓度越高。
35.1.3.5glp
‑
1浓度测定：采用elisa法测定glp
‑
1浓度。根据1.3.1培养细胞，收集细胞培养基，严格按照试剂盒说明书进行测定。
36.2结果
37.2.1caco
‑
2细胞中htas2r14，4，10的表达丰度的比较
38.caco
‑
2细胞培养24h后，实时定量pcr法测定三种人苦味受体的表达，发现htas2r14，4，10都有表达，而htas2r14表达量最高，且依htas2r14，4，10顺序mrna水平依次降低(见表1)。因此，caco
‑
2细胞可用于htas2r14激动剂的功能研究。
39.表1 caco
‑
2细胞中htas2r14，4，10的表达丰度
[0040][0041]
注rt
‑
qpcr法测定htas2rs水平。mean
±
sd。
[0042]
2.2caco
‑
2细胞中胡椒碱浓度的筛选
[0043]
以细胞活力为指标筛选胡椒碱对caco
‑
2细胞无损伤的药物浓度。结果发现，与药物未处理组相比，胡椒碱浓度小于100μmol/l时对caco
‑
2细胞的细胞活力无明显影响(见表2)。因此，初步设置50，10，2μmol/l三个浓度的胡椒碱进行其对胞内钙动员影响的研究。
[0044]
表2胡椒碱对caco
‑
2细胞活力的影响
[0045][0046][0047]
注ctrl:control；pip
‑
0.1，pip
‑
1，pip
‑
10，pip
‑
50，pip
‑
100分别代表0.1,1,10,50,100μm胡椒碱piperine.mean
±
sd，n为复孔数.##p<0.01,与ctrl组比较。
[0048]
2.3氟芬那酸和胡椒碱对caco
‑
2细胞胞内钙动员的影响
[0049]
本研究采用氟芬那酸作为胡椒碱对htas2r14激动作用的一个阳性对照药。尽管文献报道氟芬那酸增加胞内钙离子水平的ec
50
值为238nmol/l，但使用的是工具细胞hek293过表达htas2r14后进行研究所测得的钙动员的ec
50
值。因细胞类型不同，ec
50
值有差异，所以本研究对其浓度进行了筛选。结果发现，氟芬那酸在20和50μmol/l时显著增加胞内钙离子水平(见表3)。由于50μmol/l时，胞内钙离子水平增加的百分率更明显，因此，选择50μmol/l氟芬那酸进行后续研究。
[0050]
表3 htas2r14激动剂氟芬那酸对caco
‑
2细胞胞内钙动员的影响
[0051][0052]
注ctrl:control；fa
‑
2，fa
‑
5，fa
‑
10，fa
‑
20，fa
‑
50分别代表2,5,10,20,50μm氟芬那酸flufenamic acid.mean
±
sd，n为复孔数.#p<0.05,##p<0.01,与ctrl组比较。
[0053]
我们采用胡椒碱低、中、高三个浓度2，10，50μmol/l处理caco
‑
2细胞，发现10和50μmol/l胡椒碱显著增加胞内钙离子水平，而2μmol/l胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表4)。另外，10μmol/l胡椒碱的效应稍强于20μmol/l氟芬那酸的效应(见表3，4)。
[0054]
表4 htas2r14激动剂胡椒碱对caco
‑
2细胞胞内钙动员的影响
[0055][0056]
注ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine.mean
±
sd，n为复孔数.##p<0.01,与ctrl组比较。
[0057]
2.4胡椒碱和氟芬那酸对caco
‑
2细胞glp
‑
1分泌的影响
[0058]
与ctrl组(25mmol/l葡萄糖培养)相比，10和50μmol/l胡椒碱处理后明显刺激caco
‑
2细胞分泌glp
‑
1，使培养基中glp
‑
1浓度显著增加，而2μmol/l胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表5)。而且，50μmol/l氟芬那酸处理后也能够显著增加胞外glp
‑
1浓度，但作用远弱于10μmol/l胡椒碱(见表5)。
[0059]
表5胡椒碱和氟芬那酸对caco
‑
2细胞glp
‑
1分泌的影响
[0060][0061]
注ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine；
[0062]
fa代表50μm氟芬那酸flufenamic acid.mean
±
sd,n为细胞批数.#p<0.05,
[0063]
##p<0.01,与ctrl组比较。
[0064]
2.5胡椒碱对caco
‑
2细胞glp
‑
1前体胰高血糖素原mrna水平的影响
[0065]
与ctrl组相比，高浓度胡椒碱能够显著增加caco
‑
2细胞中gcg水平，而低、中浓度胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表6)。结果表明，胡椒碱能够促进glp
‑
1前体胰高血糖素原的表达，进而增加glp
‑
1的合成。
[0066]
表6胡椒碱对caco
‑
2细胞glp
‑
1前体胰高血糖素原mrna水平的影响
[0067]
[0068][0069]
注ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine.gcg为胰高血糖素原(proglucagon)的基因符号.以β
‑
actin为内参，rt
‑
qpcr法测定htas2rs水平。mean
±
sd,n为细胞批数.##p<0.01,与ctrl组比较。
[0070]
实施例2：胡椒碱对caco
‑
2细胞htas2r14信号通路的影响
[0071]
1材料与方法
[0072]
1.1细胞系 实施例1。
[0073]
1.2药品与主要试剂bca蛋白分析试剂盒(23225)购自thermo
‑
scientific(rockford,il,usa)；兔htas2r14抗体(df5159)购自affinity抗体公司；兔plcβ2抗体(a8141)购自abclonal抗体公司；兔trpm5抗体(18027
‑1‑
ap)购自proteintech抗体公司；兔β
‑
actin(#ap0060)抗体购自bioworldtechnology抗体公司；羊抗兔dylight 594 affinipureigg(h l)二抗(#v926
‑
32211)购自li
‑
cor,inc.(lincoln,ne)；其他同实施例1。
[0074]
1.3方法
[0075]
1.3.1分组及给药：同实施例1。
[0076]
1.3.2蛋白表达测定(westernblot法)：细胞匀浆上清液用bca法测定蛋白浓度，sds上样缓冲液稀释蛋白液。常规westernblot方法测定蛋白表达，即依次进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影、扫描，以目标蛋白与内参蛋白相对灰度为指标，分析目标蛋白表达量的变化。
[0077]
1.3.3蛋白表达测定(immunofluorescence法)：将无菌的圆形盖玻片置12孔板中，接种细胞于孔板中，细胞在盖玻片上稳定生长后，给予无血清的培养基进行细胞周期同步化处理12h，给药时更换完全培养基，分别给予药物处理，24h后弃去培养基，进行后续实验。
[0078]
1)pbs清洗细胞爬片，5min/次
×
3次；
[0079]
2)加入4％多聚甲醛或者甲醇覆盖爬片，
‑
20℃固定15min；
[0080]
3)pbs清洗，5min/次
×
3次；
[0081]
4)加入0.1％tritonx
‑
100穿孔10min；
[0082]
5)pbs清洗，5min/次
×
3次；
[0083]
6)加1％bsa(pbs配制)封闭30min；
[0084]
7)按照说明书要求稀释一抗，覆盖整个爬片，放入湿盒4℃过夜。
[0085]
8)pbs清洗，5min/次
×
3次；
[0086]
9)按照说明书要求配制dylight 594(抗兔)标记的二抗，覆盖整个爬片，37℃孵育1h；
[0087]
10)pbs清洗，5min/次
×
3次；
[0088]
11)dapi染色2min；
[0089]
12)pbs清洗，5min/次
×
3次；
[0090]
13)用滤纸吸干残余的pbs，加入一滴抗荧光淬灭剂，爬片转移至载玻片上，正面朝下。
[0091]
14)荧光显微镜拍照，观察细胞中目标蛋白的细胞定位。
[0092]
最终结果，目标蛋白为红色荧光，细胞核为蓝色荧光。
[0093]
1.3.4mrna水平测定(rt
‑
qpcr法)：同实施例1。
[0094]
2结果
[0095]
2.1胡椒碱对caco
‑
2细胞htas2r14mrna水平和蛋白表达的影响
[0096]
与ctrl组相比，高浓度胡椒碱能够显著增加caco
‑
2细胞中htas2r14 mrna水平，低、中浓度胡椒碱也能够增加htas2r14 mrna水平，但差异不显著(见表7)。同时，中、高浓度胡椒碱能够显著增加caco
‑
2细胞中htas2r14蛋白表达，低浓度胡椒碱也能够增加htas2r14蛋白表达，但差异不显著(见表7)。结果表明，胡椒碱能够上调caco
‑
2细胞中htas2r14。
[0097]
表7胡椒碱对caco
‑
2细胞htas2r14 mrna水平和蛋白表达的影响
[0098][0099]
注ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine.以β
‑
actin为内参，rt
‑
qpcr法测定htas2rs水平。以β
‑
actin为内参，westernblot法测定蛋白表达水平。mean
±
sd,n＝4(protein)细胞批数,n＝5(mrna)
[0100]
细胞批数.#p<0.05,##p<0.01,与ctrl组比较。
[0101]
2.2胡椒碱对caco
‑
2细胞plcβ2蛋白表达的影响
[0102]
与ctrl组相比，中、高浓度胡椒碱能够显著增加caco
‑
2细胞中plcβ2蛋白表达，低浓度胡椒碱无明显增加(见图1)。结果表明，胡椒碱能够激活caco
‑
2细胞中htas2r14，从而使g蛋白的gα和gβγ亚基分离而增加plcβ2的表达。
[0103]
2.3胡椒碱对caco
‑
2细胞trpm5蛋白表达的影响
[0104]
与ctrl组相比，中、高浓度胡椒碱能够显著增加caco
‑
2细胞中trpm5蛋白表达，低浓度胡椒碱无明显增加(见表8)。结果表明，胡椒碱能够激活caco
‑
2细胞中htas2r14/gβγ通路，促进胞内钙的动员，进而增加trpm5的表达。
[0105]
表8胡椒碱对caco
‑
2细胞trpm5蛋白表达的影响
[0106]
[0107]
注ctrl:control；pip
‑
2，pip
‑
10，pip
‑
50分别代表2,10,50μm胡椒碱piperine.以β
‑
actin为内参，westernblot法测定蛋白表达水平。mean
±
sd，n为细胞批数.#p<0.05,##p<0.01,与ctrl组比较。
[0108]
实施例3：caco
‑
2细胞htas2r14通路抑制对其激动剂胡椒碱效应的影响
[0109]
1材料与方法
[0110]
1.1细胞系 实施例1。
[0111]
1.2药品与主要试剂：gallein(gc13945，purity>98％)购自美国glpbio公司；u73122(t6243，purity＝97.98％)购自美国targetmol公司；6
‑
甲氧基黄酮(6
‑
methoxyflavone，6
‑
mf,purity>98％)购自上海源叶生物科技有限公司。其他同实施例1、例2。
[0112]
1.3方法
[0113]
1.3.1分组及给药：caco
‑
2常规培养于含10％fbs和1％双抗(青链霉素)dmem高糖培养液中，5％co2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为pip高浓度组(pip
‑
50)，以及pip
‑
50与不同干预制剂共处理组，培养30min后进行胞内钙离子浓度测定；培养1h后进行培养基中glp
‑
1水平测定。
[0114]
1.3.2钙离子浓度测定(荧光探针法)：同实施例1。
[0115]
1.3.3glp
‑
1水平测定(elisa法)：同实施例1。
[0116]
2结果
[0117]
2.16
‑
甲氧基黄酮对胡椒碱促进caco
‑
2细胞胞内钙动员的影响
[0118]
文献报道化合物6
‑
甲氧基黄酮是htas2r14拮抗剂，6
‑
甲氧基黄酮(30μmol/l)能够拮抗htas2r14激动剂sensing competence stimulating peptide 1的效应(fasebj.2021；35(3):e21375.)，然而，在研究中我们发现25，50，100μmol/l浓度的6
‑
甲氧基黄酮和高浓度胡椒碱(50μmol/l)共处理caco
‑
2细胞后，胞内钙离子浓度没有降低反而显著增加(见表9)，表明6
‑
甲氧基黄酮没有拮抗而是激动htas2r14，与胡椒碱有协同效应。
[0119]
表9 6
‑
甲氧基黄酮对胡椒碱促进caco
‑
2细胞胞内钙动员的影响
[0120][0121]
注pip
‑
50代表50μm胡椒碱piperine；6
‑
mf
‑
25，6
‑
mf
‑
50，6
‑
mf
‑
100分别代表25，50，100μm6
‑
甲氧基黄酮6
‑
methoxyflavone.mean
±
sd，n为复孔数.##p<0.01,与pip
‑
50组比较。
[0122]
2.2htas2r14通路抑制对胡椒碱促进caco
‑
2细胞glp
‑
1分泌的影响
[0123]
与高浓度胡椒碱组相比，高浓度胡椒碱与gβγ抑制剂gallein共处理caco
‑
2细胞后，glp
‑
1分泌显著降低(见表10)；同时，高浓度胡椒碱与plcβ2抑制剂u73122共处理caco
‑
2细胞后，glp
‑
1分泌也显著降低(见表10)。这些结果表明，htas2r14/gβγ通路抑制减弱了胡椒碱促进glp
‑
1分泌作用。
[0124]
表10 htas2r14通路抑制对胡椒碱促进caco
‑
2细胞glp
‑
1分泌的影响
[0125][0126]
注pip
‑
50代表50μm胡椒碱piperine；gallein:agβγinhibitor；u73122:aplcβ2inhibitor.mean
±
sd，n为细胞指数.##p<0.01,与pip
‑
50组比较。
[0127]
实施例4：caco
‑
2细胞htas2r14敲低对其激动剂胡椒碱效应的影响
[0128]
1材料与方法
[0129]
1.1细胞系 实施例1。
[0130]
1.2药品与主要试剂：三个lv
‑
sh
‑
htas2r14rna(shrna)产品及其阴性对照(nc)购自上海吉凯基因科技有限公司；其他同实施例1、例2。
[0131]
1.3方法
[0132]
1.3.1htas2r14敲低的caco
‑
2细胞的建立：将细胞计数按1
×
105个细胞/ml接种到6孔板中，生长至约60
‑
80％，换至无血清或1％的血清的dmem培养基，开始加入慢病毒(lv)进行转染。lv携带htas2r14和空载体(nc)shrna，转染至72h后观察gfp荧光强度，当荧光丰度在90％左右，转染完成。同时，加入2μg/ml嘌呤霉素进行筛杀细胞，24h后，降至1μg/ml维持浓度培养72h，待正常组细胞全部死亡，即转染结束，收取稳转细胞株进行转染效果的验证或进行传代保种。
[0133]
1.3.2分组及给药：转染的lv
‑
sh
‑
htas2r14及nc的caco
‑
2细胞常规培养于含10％fbs和1％双抗(青链霉素)dmem高糖培养液中，5％co2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为nc组、htas2r14敲低组，以及两组经pip高浓度(pip
‑
50)处理组，培养24h后进行相关指标测定。
[0134]
1.3.3mrna水平测定(rt
‑
qpcr法)：同实施例1。
[0135]
1.3.4蛋白表达测定(westernblot法)：同实施例2。
[0136]
1.3.5蛋白表达测定(immunofluorescence法)：同实施例2。
[0137]
2结果
[0138]
2.1caco
‑
2细胞敲低htas2r14的验证
[0139]
caco
‑
2细胞分别转染三个lv
‑
sh
‑
htas2r14及其阴性对照后，发现第三个sh
‑
htas2r14组的htas2r14 mrna水平极显著降低，而第一个sh
‑
htas2r14和阴性对照组的反而表现出增加的趋势，第二个sh
‑
htas2r14只表现出降低的趋势，无显著性差异(见表11)。这些结果表明第三个sh
‑
htas2r14是有效的，而且对其转染后htas2r14蛋白表达进行了验证。结果发现，第三个sh
‑
htas2r14转染caco
‑
2细胞后，htas2r14蛋白表达显著降低(见表12)。
[0140]
表11三个lv
‑
sh
‑
htas2r14转染caco
‑
2细胞后htas2r14mrna水平的变化
[0141][0142]
注ctrl：control；nc:negativecontrol；shrna
‑
1，2，3分别为三个lv
‑
sh
‑
htas2r14rna.mean
±
sd,n为细胞批数.##p<0.01,与ctrl组比较。
[0143]
表12三个lv
‑
sh
‑
htas2r14转染caco
‑
2细胞后htas2r14蛋白表达的变化
[0144][0145]
注nc:negative control；shrna
‑
3表示为第三个lv
‑
sh
‑
htas2r14 rna.mean
±
sd,n为细胞批数.##p<0.01,与nc组比较。
[0146]
2.2敲低htas2r14对胡椒碱对plcβ2蛋白表达的影响
[0147]
与ctrl组比较，nc组的plcβ2蛋白表达无明显变化。与nc组比较，高浓度胡椒碱组plcβ2蛋白表达显著增加，而htas2r14敲低组显著降低。与高浓度胡椒碱培养的nc组比较，高浓度胡椒碱培养的htas2r14敲低组，plcβ2蛋白表达显著降低。这些结果表明，敲低htas2r14减弱了胡椒碱对plcβ2蛋白表达增加的效应(见图2)。
[0148]
2.3敲低htas2r14对胡椒碱对trpm5蛋白表达的影响
[0149]
与nc组比较，高浓度胡椒碱组trpm5蛋白表达显著增加，而htas2r14敲低组显著降低。与高浓度胡椒碱培养的nc组比较，高浓度胡椒碱培养的htas2r14敲低组，trpm5蛋白表达显著降低。这些结果表明，敲低htas2r14减弱了胡椒碱对trpm5蛋白表达增加的效应(见表13)。
[0150]
表13敲低sh
‑
htas2r14对trpm5蛋白表达的变化
[0151][0152]
注nc:negative control；shrna：lv
‑
sh
‑
htas2r14 rna；pip
‑
50:50μm胡椒碱piperine.mean
±
sd,n为细胞批数.#p<0.05,##p<0.01,与nc组比较；**p<0.01,与nc pip
‑
50组比较。