一种提高小鼠体外受精效率的操作液及其使用方法与流程

1.本发明属于小鼠体外受精技术领域，特别是提高小鼠体外受精效率的操作液及其使用方法。


背景技术：

2.体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为ivf。由于它与胚胎移植技术(et)密不可分，又简称为ivf
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et。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
3.体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，ivf
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et技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分，如何提升体外受精的成功率(效率)，是当前影响该技术发展的重要因素之一。
4.现有技术中，例如中国授权专利cn112322579b提供了一种牛体外受精使用的培养液和提高牛体外受精的方法，该方法先将卵丘
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卵母细胞复合体在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中备用；然后取一支冻精细管，水浴解冻后将精液注入盛有精液制备培养液的离心管中，离心弃上清；将300μl精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液，限定了受精培养液的配方。该专利还提供了卵丘
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卵母细胞复合体的制备方法，先从牛卵巢中采集获得卵丘
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卵母细胞复合体放入运输培养液中暂存；然后放入卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，最后放入新的成熟培养液中培养22
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24h，并限定了运输培养液、成熟培养液的具体配方。该专利还提供了胚胎体外培养保存的方法，在体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，降温至
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35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存；限定了胚胎培养液的具体方法。
5.又例如中国专利申请cn111849872a提供了一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，先将冷冻后的精液取出后解冻处理，限定了精液冷冻所用的冷冻基础液配方；然后将解冻后的精液用清洗并离心，取沉淀用mtbm获能液清洗离心1次，向沉淀中加入mtbm液获能液重悬，调整精液浓度4
‑9×
106个/ml，放入培养箱中获能35
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45min，得到获能精液，限定了mtbm获能液的配方；再从母猪卵巢中抽出卵泡液，拣出卵丘
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卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞放入受精操作液中清洗，拣出有极体的成熟卵母细胞，在mtbm获能液中清洗，放入平衡好的mtbm受精小滴中备用保存；最后向每个受精小滴加获能精液，放入培养箱中培养，在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外
受精培养完成。
6.然而，上述这几种提高体外受精效果的方法，受精效果仍然一般，且不适用于小鼠的体外受精操作过程。
7.又例如文献《不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响》(吴嫦丽等，华南农业大学学报，2006年1月第27卷第1期，107
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109页)中虽然公开了不同浓度(0.1、0.5、1.0iu/ml)的fsh(胎牛血清)能够对小鼠体外受精率和2
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细胞胚率产生影响，但是其并未被公开采用的其他培养液、平衡液的配方，其公开的体外受精方法得到的受精率为69.21％
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78.06％，受精效果仍然一般。


技术实现要素：

8.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种提高小鼠体外受精效率的操作液及其使用方法，具体通过以下技术实现。
9.一种提高小鼠体外受精效率的操作液，其配方包括htf混合液和胎牛血清；
10.所述htf混合液的配方包括nacl 0.6mg/ml、kcl 0.35mg/ml、kh2po
4 0.05mg/ml、mgso4.7h2o 0.05mg/ml、葡萄糖0.5mg/ml、nahco
3 2.1mg/ml、cacl2.2h2o 0.6mg/ml、丙酮酸钠0.037mg/ml、60％乳酸钠水乳液3.42μl/ml、牛血清蛋白5
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8mg/ml。
11.本发明提供了上述操作液，包括采用特殊配方制备的htf混合液和胎牛血清(fbs)。通过将两者进行联用，本发明申请人偶然发现能够大幅提升小鼠体外受精的效率(成功率)。
12.优选地，所述胎牛血清以htf混合液的体积计的用量为60
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80μl/ml。
13.更优选地，所述胎牛血清以htf混合液的体积计的用量为75μl/ml。
14.本发明还提供了上述提高小鼠体外受精效率的操作液的使用方法，包括以下步骤：
15.s1、超排和平衡：在被处死之前第三天对雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pmsg)，注射量为5
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10iu/只；44
‑
48h后对雌鼠腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)，注射量为5
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10iu/只；在雄鼠被处死精液的前一天取所述htf混合液在5％co2培养体系下过夜平衡，同时另取htf混合液和胎牛血清混合均匀后在5％co2培养体系下过夜平衡，制得htf混合液和操作液；
16.s2、精子获能：处死步骤s1的雄鼠并获得附睾尾，将附睾尾精液移入500μl步骤s1的所述htf混合液中，盖上石蜡油，在5％co2培养体系下获能40
‑
60min；
17.s3、制作受精盘和取卵：取步骤s1的所述操作液100
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200μl作为受精滴，取2
‑
5个受精滴作为受精盘，盖上石蜡油；处死检出阴道栓的步骤s1的雌鼠并取出卵团，将卵团转入所述受精盘的受精滴中；每个所述受精滴含有3
‑
5个卵团；
18.s4、受精：在步骤s3所得的每个所述受精滴中分别加入步骤s2的产物5
‑
10μl，在5％co2培养体系下培养4
‑
6h；
19.s5、洗胚和培养：将步骤s4培养后的受精盘中的胚胎挑出，(显微镜下)挑选出受精胚胎，用培养液清洗数次后，转到培养孔中培养洗胚。
20.本发明的申请人发现，分别用普通的htf混合液平衡液对雄鼠的精液获能，和用含有胎牛血清(fbs)的htf混合液进行受精，最后培养4
‑
6h后得到受精卵。相比于采用现有的
《不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响》提供的方法，本发明的特殊制备方法所获得的小鼠的体外受精率和2
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细胞胚率显著提高。
21.优选地，步骤s2的获能时间为55min。
22.优选地，步骤s3中作为受精滴的所述操作液的用量为150ul。
23.优选地，步骤s4中，步骤s2的产物的加入量为8μl，在5％co2培养体系下培养5.5h。
24.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种用于小鼠体外受精的操作液，以及该操作液的使用方法，采用该操作液和方法，能够显著提升小鼠体外受精的受精效率和2
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细胞胚率。
具体实施方式
25.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1：小鼠体外受精效率验证实验
27.1、实验动物
28.供体：选用正常4周龄雌鼠c57和10周龄的雄鼠c57，采购自维通利华公司(选用km品系的小鼠也可以)；
29.2、实验器材
30.显微剪、眼科剪、眼科镊、脂肪夹、镊子、1ml无菌注射器、移植针、酒精灯、磨口器、磁力搅拌器、口吸管、橡胶管、空气过滤器、医用棉花、移液枪及枪头、离心管、100mm培养皿、35mm培养皿、co2培养箱。
31.3、实验药品：
32.htf混合液的原料：nacl，kcl，kh2po4，mgso4.7h2o，glucose，nahco3，cacl2.2h2o，napyruvate(苯丙酮酸)，sodium lactate(乳酸钠)，bsa(牛血清蛋白)。
33.fbs(胎牛血清)、pmsg(孕马血清促性腺激素)、hcg(人绒毛膜促性腺激素)、m2操作液、ksom胚胎培养液、矿物质油(石蜡油)、70％医用酒精等。
34.上述药品均在市场常规采购获得。
35.4、实验步骤
36.s1、超排和平衡
37.第一天下午17点，对雌鼠腹腔注射pmsg(孕马血清促性腺激素)，注射量为10iu/只；46h后，对雌鼠腹腔注射hcg(人绒毛膜促性腺激素)，注射量为10iu/只，在注射的当天下午17点制备htf混合液，在5％co2培养体系(co2培养箱，下同)下过夜平衡；
38.同时另取胎牛血清(fbs)加至htf混合液中，混合均匀制成操作液，在5％co2培养体系下过夜平衡，制得htf混合液和操作液；每1ml htf混合液加入75μl胎牛血清；
39.s2、精子获能
40.断颈处死步骤s1的雄鼠，取出两侧附睾尾于滤纸上，将htf混合液吸取0.5ml置于平皿中；在体视显微镜下用镊子夹住两端输卵管，再用显微剪横剪附睾正中处1/3深度左右的断口，用镊子将附睾尾挤出精子，移入500μl步骤s1制备的htf混合液液滴中，盖上石蜡油，在5％co2培养体系下获能55min；
41.s3、制作受精盘
42.取步骤s1的所述操作液150μl作为受精滴，取4个受精滴作为受精盘，盖上石蜡油；按需求将检出阴道栓的步骤s1的雌鼠颈椎脱臼处死，酒精擦拭腹部毛发，在阴道上方0.5cm左右横剪一道1
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2cm的口子，左手按住小鼠两只腿部，右手往上撕开小鼠表皮，暴露腹膜，在相同位置横剪开腹膜一道口子后，向两侧斜上方扩大创口后，暴露小鼠腹腔器官，将肠道往上挑起，找到y字形子宫，沿子宫往上依次找到输卵管和卵巢，夹住挑起子宫，清理旁边系膜，剪出输卵管，置于m2操作液中，在体视显微镜下撕裂膨大部，取出卵团转入受精滴中，每个所述受精滴含有5个卵团；
43.s4、受精
44.在步骤s3所得的每个所述受精滴中分别加入步骤s2的产物8μl，在5％co2培养体系下培养5.5h；
45.s5、洗胚和培养
46.将步骤s4培养后的受精盘中的胚胎挑出，在显微镜下挑选出受精胚胎，用ksom胚胎培养液清洗数次后，转到培养孔中培养洗胚。
47.实施例2
48.本实施例的实验步骤中，与实施例1的区别在于，所述胎牛血清的用量是：每1ml htf混合液中加入60μl胎牛血清。
49.实施例3
50.本实施例的实验步骤中，与实施例1的区别在于，所述胎牛血清的用量是：每1ml htf混合液中加入80μl胎牛血清。
51.对比例1
52.本对比例的实验步骤中，与实施例1的区别在于，步骤s1的操作液在制备时，所用的胎牛血清用量为：每1ml htf混合液加入90μl胎牛血清。其他步骤不变。
53.对比例2
54.本对比例的实验步骤中，与实施例1的区别在于，步骤s1的操作液在制备时，所用的胎牛血清用量为：每1ml htf混合液加入55μl胎牛血清。其他步骤不变。
55.对比例3
56.本对比例的实验步骤中，与实施例1的区别在于，步骤s3中将操作液替换成htf混合液。其他步骤不变。
57.胚胎发育观察验证
58.针对上述实施例和对比例所采用的体外受精的方法，在培养的第5天观察统计正常发育状态下的二细胞数量，并随后观察四细胞、八细胞和囊胚的数量，由此计算得到相应的受精率和胚胎细胞发育率(胚率)，进而判断出采用上述实施例和对比例的方法的ivf效果。
59.受精率＝(二细胞胚胎数量/受精胚胎总数量)*100％
60.具体试验结果如下表1所示：
61.表1胚胎发育观察结果
[0062][0063]
从上表1可以看到，采用实施例1
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3的方法，受精率均在90％以上，且实施例1的受精率达到93％。而采用对比例1的方法，受精率虽然也达到92％，但是所用的胎牛血清量相对较多，说明当使用过多胎牛血清时，对小鼠体外受精效率的提升不明显；采用对比例2、3的方法，受精率最高不超过68％，均明显不如采用实施例1
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3的方法获得的体外受精率。由此可见，只有将htf混合液和胎牛血清采用本发明的方法进行联用，才能够显著提升小鼠体外受精的受精效率和成功率。