一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法与流程

一种检测人血清中痕量免疫球蛋白g浓度的方法
技术领域
1.本发明涉及免疫球蛋白g检测技术领域，尤其涉及一种检测人血清中痕量免疫球蛋白g浓度的方法。


背景技术：

2.免疫球蛋白g是血清的主要的抗体成分，占血清免疫球蛋白的75％，在机体的免疫中起保护的作用，还有抗菌，抗病毒等功能，有效预防相应的感染性疾病，如麻疹，水痘等。同时对某些疾病有诊断意义，如甲肝抗体，戊肝抗体等。免疫球蛋白g主要由脾和淋巴结中的浆细胞合成和分泌。免疫球蛋白g是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白，来自母体的免疫球蛋白质，能保护婴儿，防御白喉，麻疹，脊髓灰质炎等疾病。
3.igg的经典检测方法有免疫浊度法和非均相酶免疫分析法,但这些方法需要繁琐的加样、温育和洗涤等步骤,手工操作耗时且精密度差。高效液相色谱法和金属螯合色谱法分离提取免疫球蛋白,虽然提高了检测灵敏度,但前处理步骤繁琐。而常用的紫外吸收法需对样品进行复杂的纯化操作,可能破坏生物活性和结构。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决上述的问题，而提出的一种检测人血清中痕量免疫球蛋白g浓度的方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种检测人血清中痕量免疫球蛋白g浓度的方法，包括：
7.s1、试剂准备
8.igg标准溶液配制：用5mmol/l磷酸盐缓冲溶液(ph7.0)稀释igg标准品,配制成4.6
×
10-4g/l的igg标准溶液；
9.荧光素异硫氰酸酯溶液配制：准确称取fitc标准品,用丙酮溶解,配制成5
×
10-4mol/l的fitc溶液,置于冰箱中4℃保存；
10.人血清:用0.45μm滤膜过滤后再用生理盐水稀释10000倍；
11.s2、柱前衍生
12.取2μl待测igg标准样品或人血清于500μl离心管中,加入80μl5
×
10-4mol/l的fitc丙酮溶液,再加入10mmol/l硼砂缓冲溶液(ph9.5)至100μl,于暗处室温下反应14～16h，分析前用缓冲溶液稀释至所需浓度后进样测定；
13.s3、毛细管电泳
14.新毛细管依次用1mol/l的hcl溶液、亚沸蒸馏水和1mol/l的naoh溶液各冲洗30min，每两次测定之间分别用亚沸蒸馏水、0.1mol/l的naoh和电泳缓冲溶液各冲洗2min，电泳缓冲溶液为20mmol/l硼砂溶液(ph9.2),样品采用重力进样(抬高15cm)15s,运行电压为18kv，实验结束后,依次用0.1mol/l的hcl溶液、亚沸蒸馏水、0.1mol/l的naoh溶液和亚沸蒸馏水各冲洗毛细管2min；
15.s4、光导纤维诱导荧光检测
16.使用光导纤维诱导荧光检测装置采用荧光照射待测样品。
17.作为上述技术方案的进一步描述：
18.所述光导纤维诱导荧光检测装置包括：
19.蓝色led激发光源；
20.检测窗口，将检测窗口部位的聚酰亚胺涂层剥离除去5mm,用一根直径40μm、长20cm的光导纤维传导激发光源；
21.激发目镜，激发目镜由两个100倍和40倍的显微目镜组成，led发出的光经100倍的显微目镜聚焦收集后,通过光导纤维传输到毛细管检测窗位置进行衍生物的激发，发射的荧光通过一个40倍显微目镜收集；
22.检测部，检测部由狭缝、滤光片和光子倍增管组成，发射的荧光依次通过狭缝(0.3mm)和橙色滤光片(最大波长435nm)到达光电倍增管pmt，输出信号通过色谱工作站进行数据处理，整个光学系统放置在暗室中,以避免外界光的干扰。
23.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
24.本发明中，采用光导纤维发光二极管诱导荧光检测装置,建立了直接测定人血清中igg含量的方法。以蓝色的led为荧光检测器的激发光源,荧光素异硫氰酸酯为柱前衍生试剂,采用毛细管区带电泳进行分离检测。经过条件优化后,确定了一种灵敏、高效的测定igg的方法。
附图说明
25.图1为本发明中光导纤维诱导荧光检测装置结构示意图；
26.图2为本发明中fitc-igg的激发与发射光谱图。
27.图例说明：
28.1、蓝色led激发光源；2、检测窗口；3、光导纤维；4、激发目镜；5、检测部。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例一：
31.请参阅图1，一种检测人血清中痕量免疫球蛋白g浓度的方法，包括：
32.s1、试剂准备
33.igg标准溶液配制：用5mmol/l磷酸盐缓冲溶液(ph7.0)稀释igg标准品,配制成4.6
×
10-4g/l的igg标准溶液；
34.荧光素异硫氰酸酯fitc溶液配制：准确称取fitc标准品,用丙酮溶解,配制成5
×
10-4mol/l的fitc溶液,置于冰箱中4℃保存；
35.人血清:用0.45μm滤膜过滤后再用生理盐水稀释10000倍；
36.s2、柱前衍生
37.取2μl待测igg标准样品或人血清于500μl离心管中,加入80μl5
×
10-4mol/l的fitc丙酮溶液,再加入10mmol/l硼砂缓冲溶液(ph9.5)至100μl,于暗处室温下反应14～16h，分析前用缓冲溶液稀释至所需浓度后进样测定；
38.s3、毛细管电泳
39.新毛细管依次用1mol/l的hcl溶液、亚沸蒸馏水和1mol/l的naoh溶液各冲洗30min，每两次测定之间分别用亚沸蒸馏水、0.1mol/l的naoh和电泳缓冲溶液各冲洗2min，电泳缓冲溶液为20mmol/l硼砂溶液(ph9.2),样品采用重力进样(抬高15cm)15s,运行电压为18kv，实验结束后,依次用0.1mol/l的hcl溶液、亚沸蒸馏水、0.1mol/l的naoh溶液和亚沸蒸馏水各冲洗毛细管2min；
40.s4、光导纤维诱导荧光检测
41.使用光导纤维诱导荧光检测装置采用荧光照射待测样品。
42.光导纤维诱导荧光检测装置包括：
43.蓝色led激发光源1；
44.检测窗口2，将检测窗口2部位的聚酰亚胺涂层剥离除去5mm,用一根直径40μm、长20cm的光导纤维3传导激发光源；
45.激发目镜4，激发目镜4由两个100倍和40倍的显微目镜组成，led发出的光经100倍的显微目镜聚焦收集后,通过光导纤维3传输到毛细管检测窗位置进行衍生物的激发，发射的荧光通过一个40倍显微目镜收集；
46.检测部5，检测部5由狭缝、滤光片和光子倍增管组成，发射的荧光依次通过狭缝(0.3mm)和橙色滤光片(最大波长435nm)到达光电倍增管pmt，输出信号通过色谱工作站进行数据处理，整个光学系统放置在暗室中,以避免外界光的干扰。
47.进行荧光检测时,光源的发射波长必须与荧光衍生物的激光波长相匹配,才能有效激发衍生物获得高的激发效率。为提高检测灵敏度,需对发光二极管进行选择。通过荧光光度计获得了fitc-igg的激发和发射光谱,结果见图2。由图可知fitc-igg的最大激发、发射波长分别为495、516nm。由于荧光化合物的最大激发和最大发射波长仅存在较小差异(21nm),如果选用最大发射波长在495nm的led,将会造成led的发射光谱与fitc-igg的发射光谱约有35％的重叠,从而引起较高的背景和噪音,对检测产生较大影响。fitc-igg的激发光谱在465～475nm处有一肩峰,当采用475nm的蓝色led激发fitc-igg时,虽然其激发效率会降低,但由于低的背景和噪音水平,仍能获得高的检测灵敏度,故实验选择最大发射波长在475nm的led作为激发光源。
48.为了与ce的背景电解质兼容,保持基线稳定,实验采用硼砂为衍生反应的缓冲溶液。分别选用5、10、15、20、25、30、40、50mmol/l的硼砂缓冲溶液(ph9.2)对相同浓度的igg标准品进行衍生。结果发现,硼砂溶液的浓度对igg衍生物的荧光强度影响很小。但硼砂浓度为5mmol/l时,igg衍生物的荧光强度最小。而较高浓度又会使体系的离子强度增大,将在ce分离中产生较强的电动迁移扩散,导致分辨率下降,对混合物分离不利。为使ce分离有良好的分辨率,选用10mmol/l硼砂缓冲溶液用于衍生反应。2.2.2缓冲溶液的ph值采用不同ph值的10mmol/l硼砂溶液作为衍生反应的缓冲液,在室温(25℃)下对igg进行衍生反应,16h后进行ce分离。结果表明,当ph值为9.5时igg衍生物荧光强度较高,因此将衍生反应中硼砂缓冲溶液的ph值定为9.5。2.2.3反应温度及时间根据fitc作为衍生试剂进行衍生的研究报道
[18],选择衍生反应在室温(25℃)下避光反应16h。在此条件下,igg衍生物的荧光强度高,且副产物少。将储存在4℃冰箱中48h后的衍生物溶液进行ce分析,发现igg衍生物的峰高没有明显变化,说明衍生物的稳定性良好。综上,衍生反应的最佳条件为:10mmol/l硼砂缓冲溶液(ph9.5),室温(25℃)避光反应16h。
[0049]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。