一种检测早期肿瘤的标志物及其用途的制作方法

1.本发明属生物医药技术领域，涉及一种具有特异性的标志物，具体涉及一种诊断早期肿瘤的标志物、检测试剂盒及其用途。


背景技术：

2.现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，临床实践显示，大部分的肿瘤在确诊时已经到了晚期，失去了手术的意义；因此肿瘤的早期诊断和综合治疗可以显著提高疗效和改善预后。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生或宿主对肿瘤刺激异常产生或表达的一类特异性物质，对肿瘤的临床诊断、治疗和预后监测起重要作用。
3.目前比较公认的肿瘤标志物包括组织特异性的标志物，如雌激素受体er(乳腺癌)、前列腺特异性抗原psa(前列腺癌)等，也包括多组织通用的标志物如上皮生长因子受体egfr(结直肠癌、肺癌等)、原癌基因her-2/neu(乳腺癌、胃癌等)。部分肿瘤标志物还可用于预测对治疗措施(包括药物化疗、放射治疗、免疫治疗)的敏感性。除了传统的蛋白类标志物以外，近年随着新技术的发展和新概念的提出，部分核酸类分子如mirna也被作为肿瘤标志物。
4.众所周知，ras过度激活是导致肿瘤发生和发展的一个重要因素，ras gaps通过增加ras gtpase酶活性促进gtp转化为gdp从而抑制ras的活性。rasal2属于ras gaps的一种，因此被认为是一种肿瘤抑制因子，在大部分的癌症组织中表达偏低，如管腔b型乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌和鼻咽癌等等；然而，在三阴性乳腺癌(tnbc)中,rasal2过表达，同时促进肿瘤的侵袭，发挥致癌作用；在结直肠癌，rasal2通过上调lats2/yap1信号通路，能够促进结直肠癌的发生和发展；因此，rasal2在癌症中的作用与肿瘤的不同类型以及同种肿瘤的不同亚型有关。
5.虽然肿瘤标志物的研究如火如荼，各种生物大分子在肿瘤中的差异表达的研究也不断深入，但是符合临床使用标准的肿瘤标志物仍然非常有限。基于现有技术的现状与基础，本技术的发明人拟提供一种具有特异性的标志物，具体涉及一种诊断早期肿瘤的标志物、检测试剂盒及其用途。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种可用于肿瘤的临床诊断、治疗和预后监测的特异性标志物。具体涉及一种诊断早期肿瘤的标志物、检测试剂盒及其用途。
7.本发明基于在研究rasal2的信号通路过程中，发现了即使rasal2蛋白表达在肿瘤的不同类型以及同种肿瘤的不同亚型中有差异，rasal2第123位磷酸化却能够普遍的、有效的诱导自噬的形成，从而增加肿瘤对于外界应激的抵抗和耐药性的产生，促进肿瘤的发生和发展。相比于rasal2表达对肿瘤发生和发展的影响存在抑制或促进的两种矛盾的作用方式，rasal2第123位磷酸化在肿瘤有着普遍的一致性，并且rasal2磷酸化与rasal2表达量的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)在正常细胞和组织几乎接近于0，而在肿瘤细胞和组织中
却有很高的表达，并且该比值与肿瘤的耐药性，肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关；因此，rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)的高低，能够预示肿瘤的发生和发展，以及对化疗产生耐药性能力的强弱，具有重要的临床应用意义。
8.本发明提供了一种肿瘤检测标志物，所述的肿瘤检测标志物含有磷酸化的rasal2多肽。
9.所述的磷酸化的rasal2多肽含有序列如eqqtdstkgrc(seq id no 8)所示的多肽。其中，s即为(第123位)磷酸化位点。
10.制备抗原肽时，可以在前端或末端添加半胱氨酸(cys)得到抗原肽。
11.所述的肿瘤检测标志物含有第123位氨基酸磷酸化的rasal2多肽。
12.另一方面，本发明提供了所述的肿瘤检测标志物的用途，即磷酸化的rasal2在制备肿瘤检测标志物中的用途。
13.本发明提供了磷酸化的rasal2多肽，经研究显示，所述的肿瘤标志物，即rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)；该比值在正常细胞和组织几乎接近于0，而在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达，并且该比值与肿瘤的耐药性，肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关；研究结果表明，检测该肿瘤标志物，即rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)的方法可作为一种特异的早期检测肿瘤的方法；本发明提供的所述的方法可用于对高危人群肿瘤的诊断、筛查，肿瘤患者的预后和耐药性的判断，以及肿瘤治疗干预中。
14.例如，本发明的一个优选实施例中，提供了第123位氨基酸磷酸化的rasal2在制备肿瘤检测标志物中的应用。
15.例如，所述的第123位氨基酸磷酸化的rasal2与rasal2含量(p-s123-rasal2/rasal2)比值显著高于正常组织中p-s123-rasal2/rasal2，则样本含有肿瘤样本的概率高。
16.所述的rasal2的酸磷化与肿瘤的耐药性、肿瘤的级别、分化程度以及预后均呈明显正相关。
17.本发明的磷酸化的rasal2多肽可用于筛选抗肿瘤药物。
18.本发明中，所述的应用包括将第123位氨基酸磷酸化的rasal2抗体与样本的蛋白提取物杂交的步骤。
19.相应的，本发明提供了一种抗体，所述的抗体能够识别第123位氨基酸磷酸化的rasal2多肽。
20.另一方面，本发明提供了一种肿瘤检测试剂盒，所述的肿瘤检测试剂盒含有的抗体能够识别磷酸化的rasal2多肽。
21.所述的肿瘤检测试剂盒还含有作为阳性参照的磷酸化的rasal2多肽。
22.本发明技术效果是：
23.rasal2和123位磷酸化的rasal2在不同肿瘤的不同时期均有表达，但是rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)却与肿瘤的发生、发展、病人的预后以及产生化疗耐药性能力密切相关，因此能够根据该比值判断不同肿瘤的发生、发展以及耐药性等；p-s123-rasal2可以作为肿瘤治疗的靶点，通过对其表达的改变，提供新的肿瘤治疗策略；本发明所述标志物特异性强，且适用于多种类型的肿瘤。
附图说明
24.图1化疗药物增加rasal2的磷酸化。
25.图2 rasal2磷酸化肽段序列以及位点。
26.图3 rasal2第123位磷酸化抗体特异性的检测。
27.图4 western blot实验检测rasal2第123位磷酸化后自噬相关蛋白的表达。
28.图5免疫荧光显示rasal2第123位磷酸化后自噬小体的变化。
29.图6 rasal2第123位磷酸化对细胞耐药的影响。
30.图7 rasal2第123位磷酸化对肿瘤生长的影响。
31.图8免疫组化法检测乳腺癌症组织中rasal2第123位磷酸化情况。
32.图9 western blot法检测乳腺癌症组织中rasal2第123位磷酸化情况。
具体实施方式
33.实验材料：293t细胞，mcf7细胞和mda-mb-231细胞均购自中科院细胞所；实验药物二甲双胍、阿霉素、lbh和顺铂均购自selleck公司；转染试剂lipo2000购自invitrogen公司，m2-beads购自sigma公司；)，细胞培养液：rpmi 1640培养基、dmem培养基(gibco)，胎牛血清(gibco)，pbs磷酸盐缓冲液，胰蛋白酶(gibco)，opti-mem(invitrogene)，tf-lc3(addgene)，抗体如下：rasal2，vps34，lc3，p62，ndp52，β-actin均购自cst公司；p-rasal2抗体购自棠思生物医药科技。
34.实验仪器：超净工作台苏州净化装备有限公司，c02细胞培养箱(thermo fisher)、冷冻离心机(thermo fisher)、培养皿(thermo fisher)、millipore水纯化系统、凝胶电泳装置bio rad，转印装置bio rad，ca及高压灭菌锅thermo(美国)，凝胶图像处理系统alpha innotech corporation，倒置显微镜(laica，dmil，wetzlar，德国)。
35.实施例1：化疗药物增加rasal2的磷酸化
36.在研究乳腺癌细胞耐药性的过程中，常规培养乳腺癌细胞mcf-7，并在细胞中瞬时转染flag-rasal2，待转染24小时后，用不同的抗肿瘤药物二甲双胍(met)50mm，阿霉素(dox)2μm，lbh58925nm和顺铂(cis)5μm处理细胞24小时随后通过co-ip实验，检测rasal2的磷酸化情况；具体操作如下：
37.1)瞬时转染
38.用invitrogen公司的lipo2000转染试剂进行转染，在转染前24h，将细胞传代，并以6
×
104/ml的密度接种于直径6cm的培养皿中，转染前细胞汇合度应该达到90％左右；转染前4小时，在培养皿中更换6ml新鲜培养基；转染时首先将12ul的lipo2000加入到含有250ul的opti-mem培养基的ep管中，同时将4ug质粒dna加入到含有250ul opti-mem培养基的ep管中，分别混匀并且在室温静置5分钟，然后将两个ep管中溶液混合，室温静置20分钟，然后将混合物逐滴加入细胞培养皿中，并放入co2细胞培养箱中培养，12小时后换成正常培养基；
39.2)co-ip
40.mcf-7细胞转染flag标签的质粒24小时后，将贴壁细胞刮下后，细胞连同培养基转移至15ml离心管中，1500rpm离心5min，然后弃去上清；用1ml的pbs重悬细胞，加入到1.5ml的ep管中，1500rpm离心5min，弃去上清；然后加入细胞裂解液，同时加入蛋白酶和磷酸酶抑
制剂。在冰上裂解30min，14000rpm离心10min，弃去沉淀；细胞裂解液，通过broadford测蛋白浓度，并将细胞裂解液调平至统一蛋白浓度；接着按照1mg蛋白加入20ul m2beads的比例，吸出适当的m2 beads，用tbs洗3遍，然后加入到裂解液中，4℃孵育过夜；将共孵育后的ep管取出，4℃6000rpm离心30s，弃去上清，加入600ul预冷的细胞裂解液洗涤beads，然后以6000rpm离心30s，弃去上清；如此反复洗涤三次，注意小心吸去上清，避免将beads一并吸走；最后一遍将上清吸去，吸干净细胞裂解液残留后加入50ul的1*上扬缓冲液，95℃变性5min；
41.3)western blot
42.①
蛋白提取及定量
43.用刮刀挂下贴壁细胞，连同培养基中的细胞一并加入15ml离心管中，4℃1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入pbs重悬细胞，4℃1000rpm离心5min，弃上清，在细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，冰上裂解30分钟后，4℃14，000
×
rpm离心10分钟，弃去沉淀，转移上清至新ep管中；
44.采用broadford法进行蛋白定量，操作如下：
45.a将标准品bsa(0.5ug/ul)按照0，1，2，3，4，6，8ul分别加入到含有500ul broadford的ep管中；混匀后，以每孔200ul 2个复孔加入96孔板中，测定标准曲线；
46.b.取2ul蛋白样品加入含有500ul broadford液的ep管中，充分混匀，以每孔200ul2个复孔加入96孔板中；
47.c.全波段酶标仪测定，波长为595nm，同时根据蛋白标准曲线计算每个标本的蛋白含量。
48.d.随后将蛋白样品用细胞裂解液调平至同一浓度，同一体积，并加入相应的5*上样缓冲液，95℃加热变性；
49.②
sds-page电泳和印迹
50.a.根据所需检测的蛋白大小，选着不同浓度的分离胶；根据说明步骤倒好分离胶和浓缩胶；
51.b.装好电泳装置，以每孔30ug蛋白量上样，未上样的空孔用1*上样缓冲液补齐，接着用1*runningbuffer进行电泳，首先80v恒压电泳30min，当蛋白跑过浓缩胶后，加大电压到120v接着电泳1小时左右，直到目标蛋白分开；
52.c.转膜：配好1*转膜液并在4℃保存，将分离胶从玻璃板中拆下，按照三明治法，胶的表面覆盖nc膜，同时上下在覆盖滤纸以及海绵，电转夹等，放入电转槽中，加入冰块和电转液，盖上盖子接通电源，恒压120v转膜60min；
53.d.封闭：转膜结束后，取出nc膜，在tbst中漂洗一遍，去除残留的转膜液，随后在5％的脱脂牛奶中封闭30min；
54.e.孵育抗体：封闭结束后，取出nc膜，加入按照比例稀释好的一抗，4℃孵育过夜；随后用tbst在摇床上漂洗4次，每次10min，取出多余的一抗和非特异结合的抗体；接着，加入hrp标记的与一抗对应的二抗，室温摇床孵育1.5hr；tbst洗涤4次，每次10min；
55.f.显影：采用ecl显影，将试剂盒中a液和b液等量混匀，均匀滴加在nc膜上，约反应30秒后，经multi gauge v3.0(fuji公司，japan)软件对免疫印迹的条带定量。
56.结果显示，抗癌药物均能使得rasal2的磷酸化水平上升，其中二甲双胍处理后，
rasal2的磷酸化水平上升最为明显(如图1所示)。
57.实施例2：化疗药物增加rasal2的第123位磷酸化
58.将实例1中co-ip后得到的rasal2蛋白送去公司进行质谱分析，结果显示rasal2第123位丝氨酸在二甲双胍处理后，能够发生磷酸化修饰(如图2所示)，根据该结果，构建了针对rasal2第123位磷酸化的特异性抗体p-rasal2，随后构建了rasal2敲除细胞株rasal2-ko，并构建了rasal2 s123a和s123d突变质粒，分别模拟rasal2第123位去磷酸化和123位持续磷酸化状态；具体操作如下：
59.1)rasal2-ko细胞的构建
60.①
lenti-crispr v2引物设计和病毒包装
61.首先通过http://crispr.mit.edu网站设计rasal2的grna序列，并按照载体使用说明在正向载体的5’端上加入cacc，反向载体的5’端加入aaac，均能够被bbsi内切酶识别；网站中高评分的序列如下：
62.exon4 grna1 cctgagatactccgtctacg(seq id no 1)，
63.exon4 grna2 ctgagatactccgtctacga(seq id no 2)，
64.exon1 grna3 atccaacatgccaccggcga(seq id no 3)。
65.随后按照质粒构建的步骤将合成的引物通过酶切酶连接的方式装进lenti-crispr-v2载体中，并测序验证；
66.病毒包装：在转染前24小时，将293t细胞传代，并以6
×
104/ml的密度接种于直径6cm的培养皿中，转染前细胞汇合度应该达到90％左右；转染前4小时，在培养皿中更换6ml新鲜培养基；转染时首先将24ul的lipo2000加入到含有250ul的opti-mem培养基的ep管中，同时将8ug质粒(lenti-crispr v2为4ug，pvsvg为1ug，pspax2为3ug)dna加入到含有250ul opti-mem培养基的ep管中，分别混匀并且在室温静置5分钟；然后将两个ep管中溶液混合，室温静置20分钟，促进dna-脂质体的形成，然后将混合物逐滴加入细胞培养皿中，并放入co2细胞培养箱中培养；12小时后换成正常培养基，转染72小时后，收集培养基上清，5000rpm离心5分钟，去除细胞碎片，接着通过0.45um的滤膜过滤，进一步去除细胞碎片，将过滤后的上清病毒分装-80℃冻存；
67.②
crispr-cas9稳定细胞株的构建
68.病毒感染目的细胞前的24小时，将mcf7细胞按照1x 105均匀铺在6孔细胞培养板中，待细胞贴壁过夜后，将含有plenti-cripsr-v2-grna的慢病毒感染mcf7细胞，并在感染过程中加入终浓度为4ug/ml的polybrene，来增强病毒的感染效率，病毒感染并表达3天后，用0.25％的胰酶消化细胞，1500rpm离心弃去上清，将细胞重新铺在10cm的细胞培养皿中，同时加入1ug/ml的嘌呤霉素来筛选出稳定表达crispr-cas9系统的细胞克隆，每5天换一次培养基；
69.嘌呤霉素对mcf7最小致死量的选择：将mcf7细胞接种到6孔板中，同时按照浓度梯度加入嘌呤霉素：0，0.5ug/ml,1ug/ml,2ug/ml,3ug/ml，5ug/ml进行筛选；选择在第三天能全部杀死mcf7细胞的最低浓度；对于mcf7细胞，确定的最小嘌呤霉素终浓度是1ug/ml；最后通过提取细胞内的基因组dna测序同时检测细胞内目的蛋白的表达，确认是否敲除成功，并将成功的细胞克隆扩增并冻存；
70.2)rasal2 s123a和s123d突变质粒的构建
71.①
突变引物的设计
[0072][0073]
②
pcr扩增
[0074]
a反应体系
[0075][0076]
轻弹混匀,置离心机稍转使侧壁液体于管底；
[0077]
b反应条件:
[0078][0079][0080]
c pcr产物检测：
[0081]
pcr结束后,将pcr产物取出,取3ul扩增产物与6ul ddh2o和1ul 10xloading buffer混合，进行1％琼脂糖凝胶电泳,以出现一条明亮清晰的2500bp扩增条带为阳性判断标准；
[0082]
③
pcr产物的酶切
[0083]
a取pcr产物30ul，加入1.5ml的ep管中，直接加入1ul的dpn i限制性内切酶；
[0084]
b缓慢的用枪混匀混合物，然后再离心机上离心30sec；
[0085]
c立即将ep管放入37℃水浴孵育，酶切过夜；
[0086]
④
酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞；
[0087]
a取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入连接产物，轻轻混匀，阴性对照不加连接产物，冰浴中放置30min；
[0088]
b 42℃水浴中热激90s,然后快速将离心管转移到冰浴中5min，该过程不要摇动离心管；
[0089]
c向每个离心管中加入500μl不含抗生素的lb培养基，混匀后置于37℃,200转/分钟培养1h，使细菌复苏；
[0090]
d 5000g离心1min，留100μl上清，重悬菌体,吸取全部感受态细胞加到含amp 的lb琼脂培养基上，将细胞均匀涂开，将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板,37℃过夜培养；
[0091]
⑤
阳性克隆的挑选、鉴定
[0092]
挑取3个单克隆，送测序公司测序；
[0093]
为了检测p-rasal2抗体的特异性，将mcf7 rasal2-ko细胞株瞬时转染flag-rasal2和flag-rasal2 s123a(具体方法见实施例1)，接着加入二甲双胍(50mm)处理24小时，并通过western blot实验检测rasal2123位磷酸化水平(如图3所示)，结果显示，二甲双胍处理后，flag-rasal2组中rasal2第123位磷酸化水平明显上升，然而rasal2 s123a组却基本检测不到磷酸化的情况，结果说明rasal2123位磷酸化抗体具有一定的特异性，尤其是该结果证明二甲双胍的确能够促进rasal2第123位磷酸化。
[0094]
实施例3：rasal2的第123位磷酸化增加细胞的自噬水平
[0095]
为了证明rasal2第123为磷酸化能够促进细胞的自噬，在rasal2敲除细胞株中，转染flag-rasal2及其磷酸化突变(123a,和123d)，构建稳定表达rasal2(wt,123a,和123d)的细胞株,同时以转染空载质粒(flag-pcdna3.1)为对照(ct)，并通过western blot实验，检测其中自噬相关蛋白的表达(如图4所示)；结果显示，与wt相比，123d的lc3明显增加，而自噬底物p62，ndp52，nbr1明显降低；123a的lc3显著降低，但是p62，ndp52，nbr1则明显上升，表明rasal2第123位磷酸化后能够促进自噬的发生；此外，在rasal2(wt,123a和123d)和对照ct细胞株中瞬时转染tf-lc3质粒(如图5所示)，结果显示，wt以及123a中gfp和rfp是弥散的，而稳定表达123d的细胞株中，tf-lc3呈现红色和黄色的点状聚集，结果进一步表明rasal2的123位磷酸化促进自噬的发生；具体操作如下：
[0096]
1)稳定表达rasal2(wt,123a,和123d)细胞株的构建
[0097]
将rasal2敲除mcf7细胞按照1x 105均匀铺在6孔细胞培养板中，待细胞贴壁过夜后，按照上述方法，瞬时转染flag-rasal2(wt,123a和123d)。转染后3天，用0.25％的胰酶消化细胞，1500rpm离心弃去上清，将细胞重新铺在10cm的细胞培养皿中，同时加入800ug/ml的g418来筛选出稳定表达flag-rasal2(wt,123a和123d)的细胞克隆，每5天换一次培养基；
[0098]
g418对mcf7最小致死量的选择：将mcf7细胞接种到6孔板中，同时按照浓度梯度加入嘌呤霉素：0，100ug/ml,200ug/ml,400ug/ml,800ug/ml，1.6mg/ml进行筛选；选择在第七天能全部杀死mcf7细胞的最低浓度；对于mcf7细胞，确定的最小g418浓度是800ug/ml；最后通过western blot检测细胞内目的蛋白的表达，确认是否构建成功，并将成功的细胞克隆
扩增并冻存；
[0099]
2)免疫荧光检测自噬
[0100]
取指数生长期稳定表达rasal2(wt,123a,和123d)细胞和对照细胞，瞬时转染tf-lc3并培养24小时；胰酶消化后，1500rpm离心5min，弃去上清液后用相应培养基打匀，制成细胞悬液，用计数仪计数后稀释成浓度为5.6
×
104个细胞/ml的细胞悬液，接种于共聚焦皿中，每孔200μl，置于细胞培养箱24h后；移去上清，pbs洗涤细胞一遍后，用100μl/孔含4％多聚甲醛，室温固定细胞15min后，用pbs洗3遍，后加入10μg/ml hoechst的pbs常温孵育5min后，于opera上成像，成像中物镜选择40x水镜头，每个孔随机自动采集9张图片，分别用488激发检测gfp蛋白，594激发检测rfp蛋白，用425激发hoechst检测细胞核。
[0101]
实施例4：rasal2的第123位磷酸化促进细胞产生耐药性并促进肿瘤生长
[0102]
自噬在肿瘤的发生和发展过程中扮演者双重角色，有时自噬能够促进肿瘤的生长，有时自噬会加速肿瘤细胞的死亡；为了探究rasal2第123位磷酸化诱导的自噬与肿瘤的关系，在rasal2 s123a和s123d以及野生型rasal2的乳腺癌细胞中，加入二甲双胍处理24小时，结果显示，rasal2第123位磷酸化能显著保护乳腺癌细胞，抑制药物诱发的细胞死亡(如图6所示)；
[0103]
进一步，检测该磷酸化对肿瘤细胞生长和增殖的影响，结果显示，无论在管腔b型乳腺癌还是三阴性乳腺癌(tnbc)中，rasasl2第123位磷酸化均能促进荷瘤小鼠中肿瘤的生长(如图7所示)；具体操作如下：
[0104]
1)rasal2第123位磷酸化对细胞耐药的影响
[0105]
取指数生长期稳定表达flag-rasal2(wt,123a和123d)的细胞，1500rpm离心5min，弃去上清液后用相应培养基重悬，制成细胞悬液，用细胞计数器计数后稀释成浓度为6.0
×
104个细胞/ml，接种于96孔板中，每孔180μl，另留一孔不加细胞作为背景对照；将板置于细胞培养箱过夜，次日，每孔加入二甲双胍(50mm),对照组加入等体积的dmso，在培养箱内培养48小时，吸掉培养液，在每个孔内加入100μl的新鲜培养液，其中含10μl的cck-8试剂，在培养箱内培养1-2小时，在450nm波长处用envision测定吸光度，参比波长为650nm，将所有孔读值减去不种细胞孔的背景值后，计算测试化合物对细胞的增殖抑制率ir(％)＝(od值对照孔－od值给药孔)/od值对照孔
×
100％。实验重复3次，计算3次实验的平均值作为抑制能力的最终指标以及sd值；
[0106]
2)rasal2第123位磷酸化对肿瘤生长的影响
[0107]
将稳定表达flag-rasal2(wt,123a和123d)的mcf7细胞按5
×
106细胞/只分别皮下接种于5到6周的雌性裸小鼠(来源于中国bk实验动物中心)右侧腋窝。每个3天，用游标卡尺测定测量肿瘤长(b，肿瘤直径)宽(a，肿瘤横径)，并由此计算肿瘤体积v＝a
×
b2/2，2-3周后处死小鼠，瘤块取出后，拍照并称重。
[0108]
实施例5：western blot和免疫组化法检测乳腺癌症组织中rasal2第123位磷酸化
[0109]
在免疫组化实验中，经福尔马林固定和石蜡包埋的组织芯片购自威奥生物；切片经脱蜡和水化后，经0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph＝6.0)水煮复原抗原，与1∶100稀释的抗tim17的一抗4度过夜孵育，再由抗兔的hrp聚合体检测系统检测，olympus bx51显微镜系统成像，分别对染好的组织芯片进行评分，至少10％的乳房上皮细胞被染上色的芯片算作阳性芯片；数据用fisher exact方法进行统计学显著性检验.p＜0.05，图8显示了正常和乳腺
癌免疫组化染色，结果显示，p-rasal2在乳腺癌中高表达，而在正常组织中表达极低，同时p-rasal2的表达与病人的生存周期呈明显的负相关；
[0110]
wb检测病人样本中，磷酸化rasal2和rasal2本底表达的关系；应用p-rasal2的抗体在组织中进行western blot和免疫组化实验。western blot方法同前；图9显示了免疫印迹实验在组织中的结果，结果表明，虽然rasal2在癌症和癌旁的表达并不均一，但是p-rasal2/rasal2的比值在癌旁组织中与肿瘤组织中差异明显；结果表明，p-rasal2/rasal2能作为乳腺癌早期检测的方法。
[0111]
本发明在研究rasal2与肿瘤特别是乳腺癌耐药关系时，发现了不同的抗肿瘤药物处理后，rasal2的磷酸化明显升高，其中二甲双胍作用后最为明显(如图1所示)；通过质谱鉴定，显示二甲双胍作用后rasal2的第123位能够发生显著的磷酸化(如图2所示)；为此，本发明构建了rasal2 123位磷酸化特异性的抗体，并鉴定了其特异性(如图3所示)；进一步，研究显示，rasal2第123位磷酸化，能够激活自噬的发生，当rasal2的123位氨基酸s突变成a(使得rasal2的123位不能磷酸化)时，肿瘤细胞自噬水平明显降低；当rasal2第123位氨基酸s突变为d使得rasal2的123位持续磷酸化时，肿瘤细胞自噬水平明显上升(如图4和5所示)；表明自噬与肿瘤的发生，发展以及耐药性均有着密切的关系；进一步研究显示，rasal2第123位磷酸化后能显著保护乳腺癌细胞，抑制肿瘤药物诱发的细胞死亡，同时rasasl2第123位磷酸化后能促进荷瘤小鼠中肿瘤的生长(如图6和7所示)；结果表明，rasal2的123位磷酸化与肿瘤的耐药性以及肿瘤的发生和发展相关；本发明在病人的样本中，通过免疫组化和western blot实验证实，在乳腺癌病人样品中，虽然rasal2的表达差异化，但是rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值的高低与肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关(如图8和9所示)，结果表明，rasal2第123位磷酸化水平与rasal2蛋白表达水平的比值(即：p-s123-rasal2/rasal2)可用作为新的早期检测肿瘤的方法，在肿瘤中该比值的变化，与肿瘤的发生、发展、病人的预后以及产生化疗耐药性能力密切相关；本发明的研究结果表明，(1)对高危人群外周血进行p-s123-rasal2/rasal2比值的检测，可以协助进行肿瘤的早期诊断；(2)对穿刺或手术切除的肿瘤样本进行p-s123-rasal2/rasal2比值的检测，可以辅助诊断肿瘤的分级或预后以及耐药性；(3)以p-s123-rasal2/rasal2比值的为靶点，对其表达水平和作用通路进行调控，可为肿瘤治疗干预提供新的策略。
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以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。