一种磁性固相萃取富集分离生物样品中痕量芬太尼类似物的前处理方法与流程

1.本发明属于样品前处理领域，涉及一种磁性固相萃取富集分离生物样品中痕量芬太尼类似物的前处理方法，具体是一种磁性生物炭用于生物样品中痕量芬太尼类似物的富集分离，lc/ms测定。


背景技术：

2.芬太尼是一种合成阿片类阵痛麻醉药。由于芬太尼及其类似物的镇痛麻醉效果好，成本低，产生了滥用现象，近年来致死案例逐年增多。而大量或过量使用会产生抑制呼吸、心脏骤停或严重过敏等不良反应，从而对全球公共健康构成威胁。我国已将芬太尼类似物列为违禁管制药物。
3.生物检材中芬太尼及其类似物的测定可为其滥用提供重要依据。然而，生物样品基质复杂，待测芬太尼浓度低，需一种高效的样品前处理技术对其进行富集分离，排除基质干扰，进而提高分析灵敏度。磁性固相微萃取(mspe)是以磁性材料为吸附剂，将其分散于样品溶液中吸附目标物后，在外部磁铁作用下即可实现磁性材料与样品溶液分离。该方法有机溶剂用量少，操作简便。在萃取过程中，磁性吸附材料的选取尤为重要，可有效提高方法灵敏度。
4.生物炭是生物质在低氧环境下高温裂解得到的多孔炭材料，具有丰富的芳香结构和含氧官能团等特点，经过磁化后的生物炭材料可作为磁性固相萃取剂萃取复杂样品中痕量目标物，进而提高检测灵敏度。因此，制备磁性生物炭，探讨其物理、结构性能对芬太尼类似物的萃取性能的影响，并进一步用于实际样品中芬太尼类似物测定具有一定的应用价值。
5.目前，生物检材中芬太尼类似物的样品处理主要采用固相填充柱萃取或液液萃取的方式。以生物炭为吸附剂的固相萃取模式未见披露。本发明利用生物炭的高效萃取性能，结合简便的磁性固相萃取模式，为芬太尼类毒物测定提供简便灵敏的新方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种磁性固相萃取富集分离生物样品中痕量芬太尼类似物的前处理方法；采用磁性生物炭与lc/ms联用测定生物样品中芬太尼类似物，为芬太尼类似物的滥用提供有力的技术支持，亦可为我国废弃农作物的资源化利用提供方向。
7.本发明一种磁性固相萃取富集分离生物样品中痕量芬太尼类似物的前处理方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)、萃取：
9.对生物样品预处理，然后再加入磁性生物炭进行振荡萃取，使芬太尼类似物充分吸附于磁性生物炭上；
10.作为优选，萃取时间为5～30min；
11.所述的生物样品包括尿液、血清等；
12.若生物样品是尿液，尿液的预处理为对尿液稀释3～5倍；预处理前的尿液样品与磁性生物炭的质量体积比为3～5ml：10～20mg；
13.若生物样品是血清，血清的预处理为采用等体积乙腈对血清进行沉淀蛋白，离心取上清液，然后再稀释5～10倍；预处理前的血清样品与磁性生物炭的质量体积比为0.5～1ml：10～20mg；
14.步骤(2)、磁分离：利用磁铁将磁性生物炭与样品溶液分离，直至溶液澄清，倒出上清液。
15.步骤(3)、解吸：将吸附在磁性生物炭上的芬太尼类似物用甲醇振荡解吸。
16.作为优选，甲醇用量200～600μl，解吸时间2～5min。
17.步骤(4)、解吸液用0.22μm微孔滤膜过滤，lc/ms测定其中目标物。
18.作为优选，lc/ms测定中色谱条件具体是：
19.色谱柱：acquity hplc beh c18色谱柱(100
×
2.1mm，1.7μm，美国waters公司)；进样量：1μl；
20.柱温：40℃；
21.流速：0.3ml/min；
22.流动相含a、b两相；流动相a为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，流动相b为甲酸乙腈溶液，所述甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％。
23.所述洗脱方式为梯度洗脱：0～1min时，90％流动相a 10％流动相b；1～6min时，流动相a由90％降至10％，流动相b由10％升至90％；6
‑
7min时，流动相a由10％升至90％，流动相b由90％降至10％。
24.作为优选，lc/ms测定中质谱条件包括：
25.采用超高效液相色谱(dionex ultimate 3000)和q
‑
exactive orbitrap质谱仪(thermo fisher，美国)；电喷雾电离源(hesi)，正离子采集模式。离子源参数：碰撞气：氮气；雾化气压力：35arb；传输毛细管温度：300℃，喷射电压：3800v；雾化温度：320℃；辅助气压力：15arb。其余质谱参数见表1所示：
26.表1不同芬太尼类似物对应的质谱条件
27.分析物精确分子定量(m/z)理论分子量(m/z)精确度(
△
ppm)乙酰芬太尼323.21179323.211122.07丙烯酰芬太尼335.21179335.211065.08异丁酰芬太尼351.24309351.242401.96戊酰芬太尼365.25874365.258121.694
‑
氟丁酰芬太尼369.23367369.232991.84奥芬太尼371.21293371.212162.07呋喃芬太尼375.20670375.205961.97
28.上述磁性生物炭的制备方法如下：
29.(1)竹屑干燥后用高速粉碎机粉粹，将竹屑粉、含fe
2
盐、含fe
3
盐与去离子水中混匀，得到均匀的混合液；其中竹屑、含fe
2
盐中fe
2
离子、含fe
3
盐中fe
3
离子和去离子水的投
料比为8～12：1.2～2.4：16～32：30～40，单位为g：mmol：mmol：ml；
30.(2)对上述混合液调节ph至10～11，磁力搅拌30～40min，过滤后放入烘箱于100～110℃干燥2～3h；
31.(3)将上述干燥后材料置于管式炉内，n2氛围下400～700℃条件下热解40～60min，得到炭化后材料；
32.(4)将上述炭化后材料用1～2mol/lnaoh溶液浸泡2～5h进行改性，然后去离子水洗涤至中性，100～110℃干燥2～3h，得到磁性竹屑生物质炭。
33.作为优选，所述含fe
2
盐为fecl2·
4h2o、含fe
3
盐为fecl3·
6h2o；
34.作为优选，竹屑粉、含fe
2
盐中fe
2
离子、含fe
3
盐中fe
3
离子和去离子水的投料比为10：1.2：16：40，单位为g：mmol：mmol：ml。
35.作为优选，热解温度为400℃。
36.上述方法制备的磁性生物炭材料通过扫描电镜、磁滞回线、红外光谱进行表征。本发明具有以下有益效果：
37.1)竹屑生物质廉价、来源丰富，竹屑生物炭具有活性含氧官能团，通过π
‑
π堆积和氢键作用吸附目标物；
38.2)制得的磁性竹屑生物炭磁性良好，可快速磁分离，稳定性好，可重复利用至少8次，萃取性能无明显损失，具有回收率高的优点。
39.3)磁性生物炭可高效富集芬太尼类似物，富集倍数高；与lc/ms联用测定尿液和血清中芬太尼类似物，检出限可达3.05～9.43ng/l，灵敏度高。
附图说明
40.图1是磁性竹屑生物炭的扫描电镜图；
41.图2是磁性竹屑生物炭的磁滞回线。
42.图3是磁性材料分离的实物图。
43.图4是不同热解温度下制备的磁性竹屑生物质炭的红外谱图。
44.图5是不同热解温度下制备的磁性竹屑生物质炭对芬太尼的萃取效果对比图。
45.图6是芬太尼类似物混标直接进样和经磁性竹屑生物质炭富集后的lc/ms对比图；其中(a)为乙酰芬太尼、(b)为丙烯酰芬太尼、(c)为异丁酰芬太尼、(d)为戊酰芬太尼、(e)为4
‑
氟丁酰芬太尼、(f)为奥芬太尼、(g)为呋喃芬太尼。
46.图7是磁性生物炭的重复利用性能。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
48.实施例1：磁性竹屑生物炭的制备
49.首先将竹屑干燥后用高速粉碎机粉粹，取10g与fecl2·
4h2o(0.2386g，0.0012mol)、fecl3·
6h2o(4.3248g，0.016mol)于40ml离子水中混匀，磁力搅拌30min。滴加10mol/lnaoh溶液至ph为10～11，继续搅拌30min，过滤，放入110℃烘箱2h后，置于管式炉内。在n2气氛下，以20℃/min升温速率升至400℃，热解60min。将得到的产物用1mol/lnaoh溶液浸泡2～5h进行改性，去离子水洗至中性，烘干，得到磁性竹屑生物炭，命名为mbc400。
50.实施例2：改变热解温度，分别在不同温度下(500、600、700℃)制备磁性生物炭，其它制备步骤同实施例1，得到的磁性竹屑生物炭分别命名为mbc500、mbc600和mbc700。
51.图1为400℃条件下得到的磁性竹屑生物炭的表面形貌，可以看出，表面褶皱卷曲，有利于与目标物的充分接触，利于萃取；
52.图2为400℃条件下得到的磁性竹屑生物炭的磁滞回线图，可知，该材料无剩磁，饱和磁化强度为40.62emu/g，表现出超顺磁性。
53.图3的磁分离效果图显示，可用磁铁在10s内快速将磁性生物炭从样品溶液中快速分离出来，满足磁性分离的需求。
54.图4为不同温度(400～700℃)得到的磁性生物炭的红外谱图，可知，温度较低时，生物炭有丰富的含氧官能团，如
‑
oh(伸缩振动吸收峰～3400cm
‑1，弯曲振动吸收峰1375cm
‑1)，c＝o(伸缩振动吸收峰～1600cm
‑1)和c
‑
o(伸缩振动吸收峰1008cm
‑1)。然而，随着热解温度的升高，由于脱羧和脱羟基反应，含氧官能团吸收峰逐渐减弱；进一步升温至700℃，无明显吸收峰。
55.实施例3：磁性生物炭对芬太尼类似物的萃取性能表征
56.7种目标芬太尼类似物为：乙酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、异丁酰芬太尼、戊酰芬太尼、4
‑
氟丁酰芬太尼、奥芬太尼和呋喃芬太尼。配置20ml芬太尼类似物混合标液(1μg/l)，加入15mg磁性竹屑生物质炭萃取20min，然后用200μl甲醇解吸4min，解吸液用lc/ms测定。
57.(1)不同热解温度对芬太尼类似物的萃取结果如图5所示。生物炭中含有刚性苯环结构、且表面有含氧官能团，能够通过π
‑
π作用和氢键作用吸附芬太尼类似物。一般来讲，在炭化过程中，随着热解温度升高，其刚性苯环增强，同时含氧官能团减弱，对目标物的萃取效率会产生明显影响。由图5可知，磁性生物炭对7种芬太尼类似物的萃取性能随热解温度的升高而降低。而红外谱图说明热解温度由400℃升高至700℃时，生物质炭中的含氧官能团逐渐减弱，导致生物炭与芬太尼类似物中n、o极性官能团间的氢键作用减弱，是造成其萃取性能下降的主要因素。因此，400℃条件下制备的磁性生物质炭萃取性能最好。
58.(2)富集因子考察：400℃下制备的磁性生物质萃取1μg/l芬太尼类似物混标的色谱图如图6所示，并与1μg/l芬太尼类似物混标直接进样的谱图进行对比。可以看出，经生物炭萃取后，峰面积有明显提高。对富集因子进行计算(萃取后的目标物浓度与萃取前浓度的比值)，结果得磁性生物炭对7种芬太尼类似物的富集因子分别为80.9、88.2、93.7、58.9、89.2、80.9和66.6，理论最高富集因子为100，反应了磁性竹屑生物炭对芬太尼类似物的高效富集性能。
59.实施例4：磁性生物炭的重复利用性如图7所示，由图可知，重复利用8次后，材料萃取效果基本稳定，8次以后，萃取性能明显下降。证明该材料稳定性好，具有良好的重复使用性能，与该材料良好的磁学性能密切相关。
60.表2mspe与lc/ms联用法测定芬太尼类似物的方法学数据
[0061][0062]
方法学结果证明，由表可知，该方法在0.05～10.0μg/l范围内有良好的线性关系，相关系数r2均高于0.99。以s/n＝3计算检出限(lods)，lods为3.05～9.43ng/l。考察该方法的精密度，以同批次制备的磁性生物炭，随机取其5份，萃取1μg/l芬太尼类似物混标的相对标准偏差(rsds)低于5.0％；3个不同批次制得的磁性生物炭萃取1μg/l芬太尼类似物混标，rsds低于10.0％，证明该方法精密度高，重现性良好。
[0063]
实施例5：尿液和血清中芬太尼类似物的加标回收实验
[0064]
所建立的磁性生物炭固相萃取与lc/ms联用方法对尿液和血清(来自于志愿者)中的芬太尼类似物进行分析，空白样品中未检测到芬太尼类似物。并采用加标回收实验评估本方法的可靠性，结果如表3所示。尿液加标4μg/l芬太尼类似物的回收率为82.8～111.3％，rsds为1.3～7.3％；血清加标10μg/l的回收率为84.5～103.9％，rsds为1.3～8.5％，回收率较高。本方法适用于尿液和血清中痕量芬太尼类似物的残留分析。
[0065]
表3尿液和血清样品中的芬太尼的分析及回收率测定
[0066][0067][0068]
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。