白果内酯在制备治疗或预防Th17细胞相关疾病药物中的应用的制作方法

白果内酯在制备治疗或预防th17细胞相关疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及白果内酯在制备治疗或预防th17细胞相关疾病药物中的应用。


背景技术：

2.多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是一种由t细胞介导的以慢性炎症、髓鞘脱失、轴突损伤与神经变性为主要病理变化的中枢神经系统(central nervous system，cns)自身免疫性疾病。ms的病因不明，大量的研究表明该疾病与遗传和环境因素间的复杂关系有关。在ms发病过程中外周免疫首先被启动，cd4

t细胞活化，向以th17细胞为主的炎性细胞亚群极化，攻击血脑屏障导致血脑屏障缺损，多种外周免疫细胞进入中枢，引起炎症反应，胶质细胞活化极化最终造成神经元损伤。th17细胞作为破坏血脑屏障的先驱细胞，在ms的发病当中起到了“导火索”的重要作用，但是目前对ms的治疗仍然缺乏针对th17细胞分化的经济有效药物。所以基于th17细胞寻找能够抑制其分化的作用靶点，会对ms的早期治疗提供新的策略。
3.目前的大部分研究都是针对ms病理过程中的脱髓鞘和神经元的变性坏死进行的，但是近些年国内外对ms发病中外周免疫作用的研究逐渐增多。在对ms患者与正常受试者的对比检测中发现，ms患者外周血及脑部病变部位中th17细胞明显增多，相应的mrna的水平及il
‑
17含量也呈现出明显上升趋势。临床相关性研究也发现，患者外周血中th17细胞比例越高，疾病越易于复发且会导致更严重的临床残疾。在ms经典的动物模型
‑
实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergy encephalomyelitis，eae)动物模型中，也检测到高水平的th17细胞及il
‑
17因子，当用抗il
‑
17抗体进行治疗时，eae模型小鼠发病延迟，临床症状较轻。此外，沉默或敲除促进th17细胞稳定、增殖和分化的细胞因子亦可以抑制eae模型的发病，如敲除促进th17细胞的稳定和扩增的il
‑
23基因，可延缓eae的发病，抑制其严重程度；低表达th17主要的转录因子ror
‑
γt的t细胞进行细胞治疗，可以显著缓解eae的髓鞘脱失和炎性细胞浸润。对ms发病因素的研究发现，在无菌条件下用mog
35
‑
55
免疫小鼠，发现小鼠th17细胞响应降低，不能成功诱导eae模型，这和th17细胞是外周免疫中抵抗真菌细菌病原体的主要屏障有关。且全基因组关联研究通过检测编码il
‑
17受体的基因也证实th17细胞在ms发病中发挥了重要作用。
4.尽管有大量证据证实了th17细胞在ms中的重要性，但是很少有研究涉及免疫调节药物在ms中对这种特异性细胞株的靶向作用。且目前在ms的临床治疗用药上多以缓解症状及预防药物为主。如在ms发病期主要以大量的糖皮质激素有效缓解临床症状；缓解期则给予预防药物
‑
免疫调节剂如干扰素
‑
1α，干扰素
‑
1β，可以减轻反复发作导致的轴索损伤程度。但总体来讲，这些虽然有效，但会对人体产生较大的副作用，其较高的价格也对患者家庭产生了较重的经济负担。
5.白果内酯(bilabolide，bb)cas:33570
‑
04
‑
6，分子式为c
15
h
18
o8，分子量为：326.3。作为一种从银杏叶提取物中分离得到的倍半萜类化合物，药代动力学研究表明，其生物利
用度高，分布广泛，易穿过血脑屏障，对神经系统有保护作用。如bb能够减少大鼠大脑中动脉闭塞和局灶性脑缺血导致的神经元损伤与死亡。在体外bb可通过干预bv2小胶质细胞对抗ogd/复氧损伤和aβ诱导的sh
‑
sy5y细胞凋亡。近期研究也显示，bb能够通过负向调节gabaa受体α1β2γ2l发挥抗焦虑和抗惊厥的作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种白果内酯(bilabolide，bb)的新的制药用途，具体地提供白果内酯在制备th17细胞相关疾病的药物中的应用。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
7.为实现上述目的，本发明首先提供了白果内酯或其衍生物在制备治疗或预防th17细胞相关疾病的药物和/或试剂中的应用。
8.上述应用中，所述th17细胞相关疾病可为th17细胞过度激活导致的炎症性疾病。
9.上述应用中，所述th17细胞相关疾病可为自身免疫性疾病。
10.上述应用中，所述自身免疫性疾病选自多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、重症肌无力、类风湿性关节炎、哮喘或系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、牛皮癣、风湿热、血管炎、皮炎、白癜风或干燥综合征。
11.上述应用中，所述自身免疫性疾病可为多发性硬化(multiple sclerosis，ms)。
12.本发明还提供了白果内酯在制备th17细胞抑制剂中的应用。
13.所述th17细胞抑制剂可为th17细胞分化抑制剂。
14.本发明还提供了白果内酯在制备具有下述至少任一种功能的药物中的应用：
15.a1)抑制cd4

t细胞分化为th17细胞；
16.a2)抑制th17细胞分化相关转录因子；
17.a3)抑制外周免疫炎性反应；
18.a4)抑制神经中枢的炎症反应
19.a5)降低炎症因子的表达水平；
20.a6)缓解eae小鼠的临床症状；
21.a7)保护髓鞘。
22.eae为实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergy encephalomyelitis)，是一种以特异性致敏的cd4

t细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化(ms)的最理想动物模型。
23.所述eae小鼠为实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergy encephalomyelitis，eae)模型小鼠。
24.所述保护髓鞘是指能够抑制炎性细胞在神经中枢的浸润，减轻髓鞘脱失，进而保护髓鞘。
25.所述抑制外周免疫炎性反应可通过抑制th17细胞的分化减低外周免疫的炎症反应。
26.进一步地，所述白果内酯能明显改善神经中枢的炎症环境减轻髓鞘脱失。
27.进一步地，所述白果内酯通过抑制转录因子减少外周免疫cd4

t细胞向th17细胞分化。
28.进一步地，所述白果内酯对髓鞘自身抗原特异性th17细胞具有抑制作用。
29.进一步地，所述白果内酯通过抑制th17分化的相关转录因子减少th17细胞的分化，且对于髓鞘自身抗原特异性的th17细胞抑制作用更明显。
30.上述应用中，所述th17细胞分化相关转录因子可为rorc、irf4或batf，和/或，所述炎症因子可为il
‑
17、il
‑
1β、il
‑
6、il
‑
21或il
‑
23。
31.上述应用中，所述试剂可为th17细胞分化抑制剂、转录因子rorc抑制剂、转录因子irf4抑制剂或转录因子batf抑制剂。
32.上述应用中，所述白果内酯可为在eae小鼠发病后进行干预或治疗。
33.本发明经过大量的实验发现了白果内酯在抑制th17细胞中的作用，具有以下优点，并在动物模型中取得了预料不到的技术效果：
34.(1)本发明提供了白果内酯的新用途，即在抑制th17细胞中的应用，所述白果内酯能够抑制cd4

t细胞分化为th17细胞，进而用于制备抑制th17细胞分化的可用于治疗th17细胞相关疾病的药物或试剂。
35.(2)本发明白果内酯能抑制外周免疫炎性反应及抑制神经中枢的炎症反应，抑制或降低炎性因子的表达，使炎症因子il
‑
17表达量显著下降，明显改善神经中枢的炎症环境减轻髓鞘脱失，保护髓鞘。
36.(3)本发明白果内酯可显著改善和缓解eae小鼠的临床症状，因此，本发明的白果内酯可以有效地改善或治疗自身免疫性疾病(如多发性硬化等)。
附图说明
37.图1为两组小鼠临床评分、体重及he/lfb染色结果。eae表示eae组(对照组)；bb表示bb干预组(bb给药组)。从免疫后发病第一天开始，小鼠经腹腔注射bb，连续给药8天。图1中a为小鼠发病后每日临床神经功能评分变化折线图、体重变化折线图及每只小鼠发病后临床评分均值比较(n＝7/组)；组织病理学观察：图1中b为he染色观察神经中枢的炎性细胞浸润；图1中c为lfb染色观察脊髓脱失情况(n＝3/组)。所有数据均表示为均值
±
sem(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001vs.eae组)。
38.图2为bb抑制外周免疫炎症反应。eae表示eae组(对照组)；bb表示bb干预组(bb给药组)。图2中a为从小鼠的脾脏和淋巴结分离单个核淋巴细胞，通过流式细胞术检测cd4

/il
‑
17

细胞的百分比并进行数据分析；图2中b为从小鼠的脾脏和淋巴结分离单个核淋巴细胞，通过流式细胞术检测cd4

/ifn
‑
γ

细胞的百分比并进行数据分析；图2中c为小鼠眼球血制备外周血清，elisa法检测相关细胞因子。所有数据均表示为均值
±
sem(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001vs.eae组)。
39.图3为bb抑制神经中枢炎症反应。eae表示eae组(对照组)；bb表示bb干预组(bb给药组)。图3中a为小鼠脊髓冰冻切片用anti
‑
cd4抗体孵育，cd4

t细胞代表性的图片被三个研究员在荧光显微镜下观察并拍摄，每组3只小鼠，比例尺为50μm；图3中b为小鼠脊髓切片anti
‑
cd68抗体孵育，和cd8

巨噬细胞代表性的图片被三个研究员在荧光显微镜下观察并拍摄，每组3只小鼠，比例尺为50μm；脊髓模式图显示了用于图示的免疫荧光染色区域；图3
中c为小鼠脊髓制备蛋白匀浆，elisa法检测相关细胞因子。所有数据均表示为均值
±
sem(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001vs.eae组)。
40.图4为bb抑制神经中枢炎症减轻髓鞘脱失。eae表示eae组(对照组)；bb表示bb干预组(bb给药组)。图4中a为小鼠脊髓提取浸润细胞，通过流式细胞术检测cd4

/il
‑
17

细胞的百分比并进行数据分析；图4中b为小鼠脊髓蛋白匀浆尽行wb检测il
‑
17蛋白的表达量以及elisa法检测il
‑
17因子的表达量；图4中c为小鼠脊髓切片anti
‑
mbp抗体孵育，代表性的图片被三个研究员在荧光显微镜下观察并拍摄，每组3只小鼠，比例尺分别为200μm、100μm；脊髓模式图显示了用于图示的免疫荧光染色区域；图4中d为小鼠脊髓切片anti
‑
ng2抗体孵育，代表性的图片被两个研究员在荧光显微镜下观察并拍摄，每组3只小鼠，比例尺为50μm；脊髓模式图显示了用于图示的免疫荧光染色区域；图4中e为小鼠脊髓蛋白匀浆进行wb检测mbp与ng2蛋白的表达量。所有数据均表示为均值
±
sem(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001vs.eae组)。
41.图5为bb抑制转录因子减少th17细胞分化。eae表示eae组(对照组)；bb表示bb干预组(bb给药组)。图5中a为eae免疫9天小鼠分离脾脏和淋巴结单核淋巴细胞，cfse孵育后加入mog35
‑
55共培养48小时，使用流式细胞术检测细胞增殖情况；图5中b为eae免疫9天小鼠分离脾脏和淋巴结单核淋巴细胞，通过流式细胞术检测cd4

/il
‑
17

细胞的百分比，收集细胞上清，用elisa法检测il
‑
17因子并进行数据分析；图5中c为正常小鼠分离脾脏单核淋巴细胞，磁珠分选出cd4

t细胞，加入cd3、cd28、il
‑
2、il
‑
6、il
‑
23、tgf
‑
β、anti
‑
mouse il
‑
4、anti
‑
mouse ifn
‑
y诱导th17细胞分化，使用流式细胞术检测cd4

/il
‑
17

细胞的百分比收集细胞上清，用elisa法检测il
‑
17因子并进行数据分析；图5中d为收集体外诱导的th17细胞荧光定量pcr检测th17细胞分化相关转录因子。所有数据均表示为均值
±
sem(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001vs.eae组)。
具体实施方式
42.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
43.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.下述实施例采用graphpad8.0.2统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，数据采用anova检验,两两比较采用t检验，多组采用tukey多重比较检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
45.下面实施例中，涉及的实验动物、实验细胞、试剂为：
46.1、实验动物
47.下述实施例中的小鼠为雌性c57bl/6品系小鼠(7
‑
8周龄)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在无病原体条件下饲养，光照/黑暗循环时间为12:12小时。所有动物实验都遵循国际实验动物科学理事会的护理和使用指南，病经山西中医药大学实验伦理委员
il
‑
4和anti
‑
mouse ifn
‑
y得到的培养基，th17诱导培养基中，cd3的含量为5μg/ml、cd28的含量为5μg/ml、il
‑
6的含量为0.05μg/ml、il
‑
23的含量为0.005μg/ml、tgf
‑
β的含量为0.001μg/ml、anti
‑
mouse il
‑
4的含量为10μg/ml和anti
‑
mouse ifn
‑
y的含量为10μg/ml。bb干预培养基是在诱导培养基中加入bb得到的培养基，bb干预培养基中，bb的含量为50μg/ml。得到th17细胞体外诱导模型。
61.3、bb给药：
62.在动物实验中，将bb溶于药物媒介(药物媒介是peg400和生理盐水按照20:80的体积比混合得到的液体)得到bb溶液。将14只、体重为18
‑
20g的eae模型小鼠免疫发病后按照评分和体重均分为两组：对照组(药物媒介干预组，eae组)和bb给药组(bb干预组，bb组)。从发病第一天开始给予药物干预和药物媒介干预，持续干预8天处死。bb给药组的每只小鼠按照给药剂量为20mg bb/kg体重进行腹腔注射约为0.2ml bb溶液，对照组的每只小鼠腹腔注射0.2ml药物媒介。
63.在细胞实验中，bb按照5ug/ml溶解在纯dmso中，调节最终浓度为培养基的0.1％。
64.4、样品采集与处理方法：
65.(1)动物实验样本：动物先取眼球血，4℃静置4小时促进凝血以析出血清，10000rpm离心5分钟取上层血清，
‑
80℃低温保存。取血完成后用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取脾脏和淋巴结，提取单细胞悬液。以10ml/min流速心脏灌注生理盐水20ml/小鼠，4℃低温快速解剖取脊髓组织。将脊髓组织中腰膨大、颈膨大分离，置于4％多聚甲醛中浸泡48小时固定，再以10％、20％、30％蔗糖梯度脱水，包埋剂(opti
‑
mumcutting temperature compound,oct)包埋，于液氮中冷冻，制成10μm厚度冰冻脊髓切片，用于he染色、髓鞘染色及免疫荧光染色。脊髓组织剩余部分制匀浆并提取蛋白，bca法测定蛋白浓度，用于elisa和western blot检测相关蛋白。
66.(2)细胞实验样本：细胞药物干预第六天，吸取细胞上清液，elisa法检测细胞因子；收集细胞，离心(2000rpm,5分钟),pbs洗涤，流式分析仪检测cd3

、cd4

、il
‑
17

标定th17细胞；收集细胞离心，提取rna用qpcr检测batf、irf4、rorc转录因子。
67.5、检测方法：
[0068]5‑
1髓鞘染色：
[0069]
取步骤4中制备的脊髓切片于70％乙醇中浸泡15分钟，浸于固蓝溶液，57℃浸泡24h，于95％乙醇溶液浸洗10分钟，去离子水浸洗5分钟，0.05％碳酸锂快速浸洗10s，70％乙醇分化至灰质与白质能够清晰辨别，去离子水浸洗5分钟，乙醇梯度脱水各2分钟，二甲苯透明2次，各5分钟，中性树胶封片，光镜下观察。
[0070]5‑
2免疫荧光染色：
[0071]
步骤4中制备的脊髓切片用pbs湿润，1％bsa封闭30分钟，pbs浸洗，用1％bsa联合0.3％triton稀释一抗，置于湿盒孵育12
‑
18小时，弃去一抗(cd4、cd68、mbp、ng2)，pbs重复浸洗3次，荧光二抗(1:1000)孵育2小时，重复pbs浸洗，dapi(1:1000)复染细胞核，重复pbs浸洗，50％甘油封片，荧光显微镜下检测。
[0072]5‑
3elisa检测相关细胞因子：
[0073]
a)包板：每孔加入包被抗体工作液100ul，4℃过夜；
[0074]
b)洗板：用wash buffer洗涤96孔板3次，滤纸控干；
[0075]
c)封闭：每孔各加入1％bsa 100ul，室温封闭l小时；
[0076]
d)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤3次，滤纸控干；
[0077]
e)加样和建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入标准品稀释液100ul，第一孔中加入标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔，如此反复作对倍稀释至第七孔，最后从第七孔中吸出100ul弃去，使之体积均为100ul，第八孔为空白对照。待测样品每孔分别加入100ul，室温反应2小时；
[0078]
f)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤6次，滤纸控干；
[0079]
g)每孔中加入检测抗体工作液100ul，室温反应l小时；
[0080]
h)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤3次，滤纸控干；
[0081]
i)每孔中加入hrp标记的亲和素工作液100ul，室温l小时；
[0082]
j)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤3次，滤纸控干；
[0083]
k)每孔加入100ul底物工作液，室温避光反应5
‑
30分钟；
[0084]
l)每孔加入100ul终止液终止反应；
[0085]
m)酶标仪450nm处测定吸光值，根据标准曲线计算样品中各因子浓度。
[0086]5‑
4western blot蛋白检测：
[0087]
步骤4中取得的脊髓组织加入组织裂解液，超声破碎匀浆，4℃低温裂解30分钟后12000rpm离心30分钟。留取上清作为待测样品，bca法检测样品蛋白浓度，
‑
80℃冷冻样品备用，避免反复冻融。
[0088]
定量蛋白样品(约30μg)与等体积的loading buffer上样缓冲液混匀，100℃水浴5分钟，用10％sds
‑
page不连续凝胶电泳分离蛋白。电泳完毕后，200ma低温湿式电转移2小时转膜。随后将pvdf膜用5％脱脂牛奶室温封闭1小时。用tbst分别稀释抗tlr4(1:1000)、抗tlr2(1:1000)、抗p
‑
nf
‑
κb(1:1000)和抗gapdh(1:1000)等抗体，4℃孵育过夜。次日稀释相应hrp偶联的二抗(1:1000)，室温孵育1小时。洗膜后使用扫描仪检测染色条带强度，通过检测蛋白条带光密度与内参gapdh的光密度比值来观察两组间的差异。
[0089]5‑
5荧光定量pcr测定：
[0090]
(1)提取总rna
[0091]
a)收集细胞或组织蛋白；
[0092]
b)细胞中加500μl的裂解液，裂解10分钟将细胞裂解液转移至离心管中，涡旋震荡混匀；
[0093]
c)将溶液转移至过滤柱上，12000rpm离心2分钟,收集滤液；
[0094]
d)向滤液中加入一倍体积的70％乙醇，混匀，转入吸附柱中，12000rpm离心30
‑
60秒，倒掉废液；
[0095]
e)向吸附柱中加入350μl去蛋白液，12000rpm离心30
‑
60秒，倒掉废液；
[0096]
f)向吸附柱中央加入80μl的dnase工作液，室温放置15分钟；
[0097]
g)向吸附柱中加入350μl的去蛋白液，12000rpm离心30
‑
60秒，倒掉废液；
[0098]
h)向吸附柱中加入500μl的漂洗液，室温静置2分钟，12000rpm离心30
‑
60秒，倒掉废液；
[0099]
i)再加入500μl的漂洗液,室温静置2分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0100]
j)将吸附柱转入新的rnase
‑
free离心管中，加入30
‑
100μlrnase
‑
freeddh2o室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，得到rna溶液。
[0101]
(2)提取的rna测浓度：用擦镜纸擦拭机器，用ddh2o测试空白，取1μl样品测试浓度。
[0102]
(3)计算上样体积，轻柔混匀后进行逆转录反应，条件：37℃15分钟(反转录)，85℃5秒(反转录酶的失活反应)。
[0103]
(4)real time pcr(反应在冰上进行)，pcr引物如表2所示，
[0104]
表2pcr引物
[0105][0106][0107]5‑
6流式细胞术检测细胞数量：
[0108]
收集细胞前用完全培养基加入佛波醇酯(phorbol ester，pma)、离子霉素(ionomycin，ion)、布雷非德菌素a(brefeldin a，bfa)在37℃二氧化碳培养箱中培养5小时，然后收集细胞，pbs洗涤两次，流式膜标记抗体cd3、cd4染色20分钟后固定20分钟，pbs洗涤两次，透膜液中加入流式胞内标记抗体il
‑
17，4℃染色过夜，次日pbs洗涤两次后500ul pbs重悬，流式细胞仪检测th17细胞数量。
[0109]
6、结果分析
[0110]6‑
1bb在eae小鼠发病后进行干预可以缓解eae小鼠的临床症状并保护髓鞘
[0111]
动物实验结果表明mog35
‑
55免疫小鼠10天后，小鼠陆续发病。与eae组(对照组)小鼠相比，bb干预组的每只小鼠发病后平均临床评分显著地降低(图1中a，p<0.05)，发病后体重减轻程度也有所缓解(图1中a，p<0.05)。这表明，在小鼠发病后再进行bb药物治疗，能够显著缓解小鼠的临床症状。通过组织病理学分析，与eae组小鼠相比，bb干预组小鼠脊髓炎性细胞浸润量显著减少(图1中b，p<0.05)，髓鞘累计光密度较高(图1中c，p<0.05)，这表明小鼠发病后再进行bb药物治疗，能够显著抑制炎性细胞在神经中枢的浸润，减轻了髓鞘脱失，保护了髓鞘。
[0112]6‑
2bb在eae小鼠发病后进行干预可以抑制外周免疫炎性反应
[0113]
外周免疫最先被激活，cd4

t细胞活化分化为炎性作用为主的th17与th1细胞，这些细胞会分泌炎症因子造成外周免疫炎性环境，损伤血脑屏障，导致炎性细胞向神经中枢的浸润。因此我们分离了两组小鼠的脾脏和淋巴结的单核细胞进行检测，与eae组相比，bb治疗组小鼠脾脏(图2中a，p<0.05)和淋巴结的单核细胞(图2中a，p<0.001)中th17细胞数量降低，但th1细胞数量并无差异(图2中b，p>0.05)。然后我们对小鼠血清进行炎性细胞因子水平的检测，结果显示bb治疗组明显降低了包括il
‑
17(图2中c，p<0.01)、il
‑
1β(图2中c，p<0.05)、il
‑
6(图2中c，p<0.01)、il
‑
21(图2中c，p<0.01)、il
‑
23(图2中c，p<0.001)在内的常见炎症因子的水平，但对于ifn
‑
γ(图2中c，p>0.05)没有明显的抑制效果。以上数据表明,发病后对eae小鼠应用bb进行干预，主要通过抑制th17细胞的分化减低外周免疫的炎症反应。
[0114]6‑
3bb在eae小鼠发病后进行干预可以抑制神经中枢的炎症反应
[0115]
外周免疫数据显示bb能够减少外周的活化的cd4

t细胞分化为th17细胞，进一步能够推测出因th17攻击破坏的血脑屏障也会减少，从而使活化的cd4

t细胞和巨噬细胞向神经中枢的迁移减少，中枢的炎症环境会得到一定程度的缓解。所以我们对小鼠的脊髓冰冻切片进行免疫荧光染色来验证上述推断。结果显示，相较于eae组，bb干预组小鼠脊髓浸润的cd4

t细胞(图3中a，p<0.001)和cd68

巨噬细胞(图3中b，p<0.05)显著减少。在脊髓蛋白匀浆检测到较低水平的il
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6(图3中c，p<0.05)，il
‑
23(图3中c，p<0.05)，il
‑
1β(图3中c，p<0.05)等炎性细胞因子，但是检测发现il
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21(图3中c，p>0.05)的水平没有明显降低。接着我们进一步检测了中枢浸润的th17细胞、髓鞘脱失程度与少突胶质细胞再生情况。结果显示，与eae组小鼠相比，bb干预组小鼠神经中枢浸润的th17细胞减少(图4中a，p<0.5)，脊髓蛋白匀浆进行wb检测和elisa检测到il
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17因子的水平也有明显降低(图4中b，p<0.5)，并且在脊髓切片的mbp和ng2免疫荧光染色与wb结果中发现，髓鞘脱失减轻(图4中c，p<0.5，图4中e，p<0.01)但是对少突胶质细胞的再生没有明显作用(图4中d，p>0.5，图4中e，p>0.5)。综上，发病后对eae小鼠应用bb进行干预，能明显改善神经中枢的炎症环境减轻髓鞘脱失。
[0116]6‑
4bb通过抑制转录因子减少外周免疫cd4 t细胞向th17细胞分化
[0117]
为了进一步研究bb抑制th17细胞分化的机制，我们将eae免疫9天的小鼠脾脏和淋巴结制备的单核淋巴细胞加入mog
35
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55
与bb进行培养，检测bb对于细胞增殖的抑制作用。
[0118]
具体实验方法如下：
[0119]
使用生理盐水完全溶解小鼠髓磷脂寡突细胞糖蛋白肽
35
‑
55
(mog
35
‑
55，chinapeptides company)，与完全弗氏佐剂(complete freud ajuvent,cfa，sigma，f5881)溶解的结核分支杆菌h37r(bd difco，231141)充分混合乳化后得到mog35
‑
55免疫制剂，在雌性c57bl/6品系小鼠(7
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8周龄)背侧脊柱腰骶部膨大区两翼四点皮下注射mog35
‑
55免疫制剂免疫诱导eae，mog35
‑
55免疫制剂的注射剂量为200ug mog
35
‑
55
/只小鼠，400ug结核分支杆菌h37r/只小鼠，免疫当日和免疫48小时后给予每只小鼠腹腔注射300ng百日咳毒素。eae免疫第9天，分离小鼠脾脏和淋巴结制备的单核淋巴细胞，将细胞平均分为mog
35
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组、mog
35
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55
bb组、mog
35
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55
‑
组与mog
35
‑
55
‑
bb组。mog
35
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组中使用加入mog
35
‑
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的完全培养基，mog
35
‑
55
bb组中使用加入mog
35
‑
55
与bb的完全培养基，mog
35
‑
55
‑
组中只使用完全培养基，mog
35
‑
55
‑
bb组中使用加入bb的完全培养基，上述分组细胞在37℃细胞培养箱中培养48小时后，收集细胞上清，用elisa检测细胞上清中的细胞因子；收集细胞，流式细胞术检测th17细
胞的分化情况。结果显示，与mog
35
‑
55
‑
组相比，bb对于mog
35
‑
55
组中th17细胞增殖(图5中a，p<0.5)与分化(图5中b，p<0.5)有明显的抑制效果，细胞上清用elisa法检测il
‑
17因子的含量也显示出bb对髓鞘自身抗原特异性th17细胞的抑制作用(图5中b，p<0.5)。利用正常小鼠脾脏单核淋巴细胞磁珠分选出cd4

t细胞，加入cd3、cd28、il
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2、il
‑
6、il
‑
23、tgf
‑
β、anti
‑
mouse il
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4、anti
‑
mouse ifn
‑
y诱导th17细胞分化的结果显示，bb对于单纯诱导的th17也有明显的抑制作用(图5中c，p<0.5),细胞实验的荧光定量pcr结果显示bb对il
‑
17和分化相关转录因子rorc、irf4、batf也有明显的抑制作用(图5中d)。图5中d，normal为normal组细胞，model为th17诱导组细胞，bb为bb干预组细胞。
[0120]
综合上述结果，bb通过抑制th17分化的相关转录因子减少th17细胞的分化，且对于髓鞘自身抗原特异性的th17细胞抑制作用更明显。
[0121]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。