一种C2C12成肌细胞分化为成熟肌细胞的培养方法与流程

一种c2c12成肌细胞分化为成熟肌细胞的培养方法
技术领域
1.本发明属于成肌细胞的分化培养，涉及一种c2c12成肌细胞分化为成熟肌细胞的培养方法。


背景技术：

2.c2c12是小鼠的成肌细胞，分化比较快，可形成具有收缩性的肌管，产生特征性的肌蛋白。因此，广泛应用于生物医学和肌肉再生的临床研究等领域。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复（再生）是非常重要的。培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征，包括增殖，迁移，融合，肌管形成和收缩。生长于含10％胎牛血清培养基中的肌肉细胞即使发生汇合，也仍然继续进行细胞增殖；而当它们生长于含2％马血清的培养基中时，会发生融合形成肌管。研究发现，采用 rando 描述的方法分化的c2c12成肌细胞最终的分化程度并不理想。
3.目前普遍被使用的c2c12细胞的分化步骤包括，1）c2c12细胞接板，48小时以后，c2c12成肌细胞生长到80％丰度，弃去生长培养基（高糖dmem，10%胎牛血清），加入分化培养基（高糖dmem，2%马血清），每隔1天更换一次分化培养基，持续培养成肌细胞直至肌管被诱导形成。通常刚刚分离到的成肌细胞生长旺盛，能够在马血清的诱导下分化形成大量肌管。采用这种方法时，当细胞代数较高时，成肌细胞会丧失在体外形成肌管的能力，成肌细胞的增殖和分化能力严重降低，导致诱导分化的效果大大下降，往往只能形成少量肌管。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种c2c12成肌细胞分化培养的方法，采用优化分化培养基的方法，可大大提高c2c12成肌细胞分化为成熟肌细胞的效率。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种c2c12成肌细胞分化培养的方法，包括以下步骤：（1）c2c12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养皿中，置于 co2培养箱中培养，培养箱条件为37摄氏度5% co2，每 48h进行传代，使用倒置显微镜观察细胞形态；（2）当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 pbs将细胞洗1次，加入 1ml胰酶细胞消化液，覆盖细胞，37度消化，同时在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞将要分离呈现圆形时，加入5ml生长培养基终止胰酶消化，用移液管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入15ml离心管中，800rpm离心3min，弃掉上清液，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按10000个/cm2铺于12孔板内，置于 co2细胞培养箱中，培养条件为37摄氏度5% co2，并使用倒置显微镜观察细胞形态；（3）48小时后，待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基，诱导其进行肌向分化，每48h 更换分化培养基，使用倒置显微镜观察细胞形态；所述的生长培养基为高糖dmem 培养基，10%胎牛血清，1%双抗；所述的分化培养基为高糖dmem 培养基，2%马血清，1%双抗，100nm胰岛素。
5.本发明的有益效果：本发明的培养方法通过优化分化培养基的方法，在分化培养基的里面增加胰岛素，胰岛素可以有效促进c2c12细胞分化，从而改善c2c12成肌细胞分化为成熟肌细胞的分化效率。通过本发明的分化培养方法，可以有效提高c2c12成肌细胞分化效率。
6.为清楚说明本发明中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行详细介绍。需要说明的是，实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
7.附图说明
8.图1为实施例1和对比例1的细胞分化图。
具体实施方式
9.下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是为了更好的描述本发明的内容，而不应视为全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
10.本发明所采用的c2c12成肌细胞购自上海富衡生物科技有限公司。c2c12小鼠成肌细胞接种于含有生长培养基的培养皿中，置于 co2细胞培养箱中培养，细胞培养箱条件为37摄氏度5% co2，每 48h传代，并使用倒置显微镜观察细胞形态，当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 pbs将细胞洗涤1次，再加入 1ml胰酶细胞消化液，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，加入5ml完全培养基终止胰酶消化，用移液管轻轻吹打数次以打散细胞团块，将细胞悬液转移至15ml离心管中，800rpm离心3min，弃去上清液。按照1：4至1：6的比例进行细胞传代。平时的细胞培养将细胞汇合度控制在80%以内。
11.实施例1一种c2c12成肌细胞分化培养的方法，包括以下步骤：（1）将c2c12成肌细胞接种于含有生长培养基的100mm细胞培养皿中，于37摄氏度5% co2培养条件下进行培养，每48h传代，并使用倒置显微镜观察细胞形态；（2）当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 pbs将细胞洗涤1次，再加入 1ml胰酶细胞消化液，覆盖细胞，将细胞置于37摄氏度进行消化，并用显微镜观察当细胞将要 分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养皿使细胞自皿底脱落，加入3ml生长培养基，用移液管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液转移至15ml离心管中，800rpm离心3min，弃去上清液，加入适量新鲜生长培养基，用移液管吹打均匀后，按10000个/cm2铺于含有生长培养基的12孔板内，置于co2孵箱内，占体积分数 95%空气，5%co2，温度为37℃，每 48h 换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；（3）待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导其进行肌 向分化，每48h 更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；生长培养基为以高糖 dmem 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷 8μ
g/升，egf0.3mg/l，胰岛素160mg/l，地黄多糖35mg/l。
12.分化培养基为以高糖 dmem 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，100nm胰岛素。
13.c2c12小鼠成肌细胞，接种于生长培养基，显微镜观察， 2天以后，显微镜下 可见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长由85%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞， 一天半以后有小的肌管形成，如图1所示， 五天以后90％以上培养的细胞分化成成熟的肌 管。
14.对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：生长培养基为以高糖 dmem 培养基为基液， 含有 10%胎牛血清，1%双抗。分化培养基为以高糖 dmem 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗。
15.将c2c12成肌细胞接种于生长培养基，显微镜观察，5天以后，显微镜下可 见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长为60%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞，三 天以后有小的肌管形成，如图1所示，五天以后30％培养的细胞分化成成熟的肌管。
16.由以上的实施例可知，本发明的培养方法可以有效的提高c2c12成肌细胞的分化。


技术特征：
1.本专利提供一种c2c12成肌细胞分化为成熟肌细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）取c2c12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养皿中，置于 co2培养箱中培养，培养条件为37摄氏度，5% co2；（2）当细胞汇合度达到80%左右时，弃去旧培养基，用 pbs将细胞洗1次，再加入胰酶细胞消化液，覆盖细胞，37摄氏度消化数分钟，期间用倒置显微镜观察细胞形态，当细胞呈圆形时，表明已经完成细胞消化，这时加入5ml生长培养基终止胰酶消化，用移液管轻轻吹打数次以打散细胞团块，将细胞悬液转移至15ml离心管，800rpm离心3min，弃去上清，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按10000个/cm2密度铺于12孔板内，置于 co2细胞培养箱中，培养条件为37摄氏度5% co2，使用倒置显微镜观察细胞形态；（3）待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基，诱导其进行肌向分化，每48h 更换分化培养液，使用倒置显微镜观察细胞形态；所述的生长培养基为高糖dmem培养基，10%胎牛血清，1%双抗；所述的分化培养基为高糖dmem培养基，2%马血清，1%双抗，100nm胰岛素；所述的c2c12成肌细胞购自上海富衡生物科技有限公司；原代成肌细胞分化培养基的配制方法是：500毫升的dmem培养基（hyclone，货号sh30243.01）中加入5毫升的青霉素-链霉素溶液(100x)（碧云天，货号c0222），加入10毫升的马血清（生工，货号e500007-0400），混匀，保存在4℃，每次更换分化培养基时，在上述分化培养基中加入终浓度为100nm的胰岛素，混匀后再进行换液。2.根据权利要求1所述的一种c2c12成肌细胞分化培养的方法，其特征在于：所述的生长培养基为高糖 dmem，10%胎牛血清，1%双抗。3.根据权利要求1所述的一种c2c12成肌细胞分化培养的方法，其特征在于：所述的分化培养基为高糖 dmem，2%马血清，1%双抗，100nm胰岛素。

技术总结
本发明属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，采用C2C12小鼠成肌细胞为对象，通过细胞增殖培养、分化培养等步骤，优化分化培养基，可以有效的提高C2C12成肌细胞分化为成熟肌细胞的效率。成肌细胞分化为成熟肌细胞的效率。


技术研发人员：马一明 李家鹏
受保护的技术使用者：勤浩医药（苏州）有限公司
技术研发日：2020.05.08
技术公布日：2021/11/8