一种提高外源DNA转化玉米效率的方法与流程

一种提高外源dna转化玉米效率的方法
技术领域
1.本发明属于植物转基因育种领域，具体涉及一种倒置浸泡雌穗、利用花粉管通道提高外源dna转化玉米效率的方法。


背景技术：

2.我国科学家1978年首次提出利用花粉管通道转化作物的育种设想，并在棉花中得到了成功。之后，该技术发展迅速，在作物育种中得到了广泛应用，取得了令人瞩目的成果。花粉管通道转化法的主要原理是授粉后使外源dna能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法利用自身的生殖系统作为载体这一得天独厚的优势，克服了远缘杂交的一些障碍，进入受体基因组的是部分dna片段或目的基因，易于整合，转移基因所控制的性状在受体中容易稳定，是一种简便快速的育种途径。利用花粉管通道向植物导入外源dna，目前主要有注射法和滴加法。注射法是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将外源dna用注射器注入具有花粉管通道的组织上或组织内部，使dna进入并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。滴加法也是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将花柱切断，将外源dna滴加在切面上，或者不切断花柱，将外源dna直接滴加在柱头上，使dna沿着花粉管通道进入胚囊，整合到合子的基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。花粉管通道转化技术适用于所有有性繁殖被子植物，不依赖组织培养技术，操作简单，无需昂贵的仪器设备，能够直接得到转化种子，因此备受人们的青睐。玉米是应用花粉管通道进行转化较多的作物之一，目前已发展了：柱头滴加法、花粉粒携带法、子房微注射法、开苞叶导入法等花粉管通道转化方法。但这些方法要么是外源dna沿着花丝进入胚囊路径太长，要么与外源dna接触时间过短，转化效率都很低，严重制约其应用发展。如何进一步提高外源dna导入率将是今后很长一段时间研究的重点。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种倒置浸泡雌穗、利用花粉管通道提高外源dna转化玉米效率的方法。
4.本发明的一种倒置浸泡雌穗、利用花粉管通道提高外源dna转化玉米效率的方法，是通过以下技术方案实现的：在玉米人工授粉后，除去雌穗里层苞叶及全部花丝，套上密封的容器，并固定好，将整个玉米植株倒转过来，固定或悬挂，在密封的容器内加外源dna溶液，让无花丝的雌穗浸泡在dna溶液中，最后复原玉米植株。
5.优选地，所述的玉米采用盆栽方式，具体为：植株位于盆的中央，土壤表面离盆边上铅2～3cm，并在土壤表面放置与盆大小吻合的2块“半月板”，然后在盆外面套上一个网袋，扎紧袋口。
6.优选地，所述的半月板由塑料、泡沫、木板等其中一种做成，其半圆直径边沿中点上有一直径为1.5～2.5cm的半圆型凹陷，所述的网袋由塑料、麻等其中一种做成。
7.优选地，在玉米人工授粉16～22小时，花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，将苞叶按3等分纵向切开，把里层苞叶去除，保留最外2～3层，并且全部花丝从基部清除。
8.优选地，所述的容器为塑料袋，由聚乙烯塑料做成，底窄口宽，底宽1.5～2.0cm，口宽2.0～3.0cm，长5.0～7.0cm，根据雌穗大小进行适当折叠，并固定在雌穗外面。
9.优选地，所述的将整个玉米植株倒转过来，具体为：将种植盆及植株轻轻倒置，用s型铁钩钩住种植盆底部网袋的网眼，钩的另一头挂在支持物上，雌穗离地面30～100cm，叶片不能折断。
10.优选地，所述的在密封的容器内加外源dna溶液，具体为：用滴管把外源dna溶液沿着塑料袋和雌穗之间的缝隙加入到塑料袋小容器里，直到加满为止。
11.优选地，所述的外源dna溶液的浓度为300～500μg/ml。
12.优选地，所述的浸泡，时间为20～30min，其间，每隔4～6分钟轻轻振动塑料袋和雌穗。
13.本发明的有益效果如下：
14.1、外源dna溶液用量少，处理过程中根据需要可以添加，即使将套住雌穗的容器加满，所加的外源dna的体积也仅仅为3～5ml即可，试验结束后可以回收；
15.2、可根据需要控制浸泡时间，而且整个雌穗都得到均匀浸泡；
16.3、由于花丝从基部去除，外源dna可从花丝基部通过花粉管通道直接进入胚囊，大大缩短了外源dna进入胚囊的距离，因此外源dna导入路径很短，提高了外源dna转化玉米的效率；
17.4、容易操作，成本低廉。
18.综合上述，本发明是一种外源dna溶液浸泡长、导入路径短、充分利用花粉管通道提高外源dna转化玉米效率的方法，本发明的方法容易操作、成本低廉。
附图说明
19.图1：盆栽玉米小苗；
20.图2：玉米开花时雄穗、雌穗进行套袋；
21.图3：套雌穗专用的各种规格的塑料袋；
22.图4：倒置花盆和玉米植株所用的塑料网袋；
23.图5：倒置花盆时用于阻挡坭土的泡沫半月板；
24.图6：去除内层苞叶和花丝的玉米雌穗；
25.图7：雌穗套上专用的塑料袋并进行固定；
26.图8：植株倒置前用泡沫半月板和塑料网袋把花盆和植株包扎好；
27.图9：玉米植株倒置后吊挂在架子上；
28.图10：在塑料袋中加入外源dna溶液对雌穗进行浸泡；
29.图11：雌穗浸泡后外层苞叶复原；
30.图12：铁皮石斛基因组转化后收获的玉米种子在培养基上萌发的小苗；
31.图13：铁皮石斛基因组转化后收获的第一代玉米种子在田间开花、结实情况；
32.图14：alu
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like标记检测斑茅基因组dna转化玉米的电泳条带，其中，1为阳性对
照，2为海南92
‑
77品种(斑茅)，3为崖城96
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40品种(斑茅真杂种后代)，4～23为t0代转基因植株，m为marker。
具体实施方式
33.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
34.实施例1：铁皮石斛外源dna转化玉米
35.把玉米自交系品种hz1播种在花盆内进行盆栽，当小苗长至10～15cm高时，移栽到高22cm、上内径23cm、下内径17cm塑料花盆内，填上种植土至离花盆口上沿2～3cm处，放置在阳光充足的地方，正常水肥管理。在雄穗散粉前将雄穗和雌穗进行套袋，防止串粉(如图2所示)。雄穗散粉后，进行人工授粉，登记好授粉时间，雌穗继续套袋防止串粉。然后，进行本发明的外源dna转化玉米的方法，包括如下步骤：
36.(1)、根据花盆大小准备2片倒置花盆时用于阻挡坭土的泡沫半月板，泡沫半月板半圆直径边沿中点上有一直径为1.5～2.5cm的半圆型凹陷(如图5所示)，准备倒置花盆和玉米植株所用的塑料网袋(如图4所示)，宽2～3cm，长5～7cm的套雌穗专用的各种规格的小塑料袋(如图3所示)，玉米植株位于花盆的中央，土壤表面离盆边上铅2～3cm(如图1所示)，并在土壤表面放置与花盆大小吻合的2块泡沫半月板，然后在花盆外面套上一个塑料网袋，扎紧袋口；
37.铁皮石斛具有生津养胃，滋阴清热，润肺益肾，明目强腰等功效，将铁皮石斛dna导入玉米，可使玉米获得铁皮石斛一些优良性状，提高玉米的营养成分和药用价值。采用ctab法提取铁皮石斛基因组dna，纯化后放置冰箱中保存备用。然后配制好300～500μg/ml外源dna溶液(含0.02％silwet l
‑
77)，本发明的外源dna为铁皮石斛基因组dna。
38.(2)、在玉米人工授粉16～22小时，花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，用手术刀片把雌穗苞叶纵向剖开成3等份，把里层苞叶去除，保留最外2～3层，并且全部花丝从基部清除(如图6所示)；
39.(3)、选用适合大小的塑料袋，由聚乙烯塑料做成，底窄口宽，底宽1.5～2.0cm，口宽2.0～3.0cm，长5.0～7.0cm，根据雌穗大小进行适当折叠，把去掉花丝的雌穗套上，并用透明胶、回形针等扎稳、固定好(如图7所示)；
40.(4)、把花盆坭土弄平，围着植株基部铺上泡沫半月板，用塑料网袋把花盆套上并扎好(如图8所示)；
41.(5)、把花盆及植株轻轻倒置，用s型铁钩勾住花盆底的塑料网袋，然后通过铁钩勾挂在架子上，雌穗离地面30～100cm，叶片不能折断(如图9所示)；
42.(6)、用滴管把外源dna溶液沿着塑料袋和无花丝的雌穗之间的缝隙滴加到塑料袋里，直到加满为止，所加入的外源dna溶液体积为3～5ml(如图10所示)；
43.(7)、让外源dna溶液浸泡无花丝的雌穗30分钟，其间，每隔5分钟轻轻振动塑料袋和雌穗；
44.(8)、浸泡完后，把塑料袋从雌穗上松解下来，塑料袋中的外源dna溶液回收，然后把花盆及植株从架子上拿下，并复原(如图11所示)；
45.(9)、浸泡过的雌穗凉干后，把苞叶复原，并用橡皮扎好，继续套袋防止串粉；
46.(10)、种子成熟后及时收获并晒干备用，然后将铁皮石斛基因组转化后收获的玉米种子在无糖、无生长调节剂的ms0培养基上进行萌发，萌发的小苗如图12所示，转化苗从形态上与供试品种hz1有很大区别：转化的幼苗刚长出一片叶子时就已长出一个节了，叶片没有自然张开，叶鞘和叶片分界不明显，整个成喇叭状，呈紫红色；而供试品种hz1幼苗时不会拔节，只有假茎，假茎由叶鞘构成，叶鞘和叶片分界明显，叶片自然张开，呈绿色；
47.铁皮石斛基因组转化后收获的第一代玉米种子成功在田间开花、结实，如图13所示，转化苗生长较慢，出苗后约28天，株高20cm，只有3片子就开始抽穗了，雌穗基本就贴在地面上，只结10～15粒种子；而供试品种hz1一般出苗后40～48天，长出13～19片叶后才开始抽穗，雌穗、雄穗、结实等。
48.实施例2：斑茅外源dna转化玉米
49.把玉米自交系品种wys2播种在花盆内进行盆栽，当小苗长至10～15cm高时，移栽到高22cm、上内径23cm、下内径17cm塑料花盆内，填上种植土至离花盆口上沿2～3cm处，放置在阳光充足的地方，正常水肥管理。在雄穗散粉前将雄穗和雌穗进行套袋，防止串粉(如图2所示)。雄穗散粉后，进行人工授粉，登记好授粉时间，雌穗继续套袋防止串粉。然后，进行本发明的外源dna转化玉米的方法，包括如下步骤：
50.(1)、根据花盆大小准备2片倒置花盆时用于阻挡坭土的泡沫半月板，泡沫半月板半圆直径边沿中点上有一直径为1.5～2.5cm的半圆型凹陷(如图5所示)，准备倒置花盆和玉米植株所用的塑料网袋(如图4所示)，宽2～3cm，长5～7cm的套雌穗专用的各种规格的小塑料袋(如图3所示)，玉米植株位于花盆的中央，土壤表面离盆边上铅2～3cm，并在土壤表面放置与花盆大小吻合的2块泡沫半月板，然后在花盆外面套上一个塑料网袋，扎紧袋口；
51.斑茅具有生势强、适应性广、抗旱、抗病、耐瘦瘠等特性，将斑茅dna导入玉米，可使玉米获得斑茅一些优良性状，提高玉米的抗逆性和适应性。本实施例采用ctab法提取斑茅基因组dna，纯化后放置冰箱中保存备用，然后配制好300～500μg/ml外源dna溶液(含0.02％silwet l
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77)，
52.(2)、在玉米人工授粉16～22小时，花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，用手术刀片把雌穗苞叶纵向剖开成3等份，把里层苞叶去除，保留最外2～3层，并且全部花丝从基部清除(如图6所示)；
53.(3)、选用适合大小的塑料袋，由聚乙烯塑料做成，底窄口宽，底宽1.5～2.0cm，口宽2.0～3.0cm，长5.0～7.0cm，根据雌穗大小进行适当折叠，把去掉花丝的雌穗套上，并用透明胶、回形针等扎稳、固定好(如图7所示)；
54.(4)、把花盆坭土弄平，围着植株基部铺上泡沫半月板，用塑料网袋把花盆套上并扎好(如图8所示)；
55.(5)、把花盆及植株轻轻倒置，用s型铁钩勾住花盆底的塑料网袋，然后通过铁钩勾挂在架子上，雌穗离地面30～100cm，叶片不能折断(如图9所示)；
56.(6)、用滴管把外源dna溶液沿着塑料袋和无花丝的雌穗之间的缝隙滴加到塑料袋里，直到加满为止，所加入的外源dna溶液体积为2～5ml(如图10所示)；
57.(7)、让外源dna溶液浸泡无花丝的雌穗30分钟，其间，每隔5分钟轻轻振动塑料袋和雌穗；
58.(8)、浸泡完后，把塑料袋从雌穗上松解下来，塑料袋中的外源dna溶液回收，然后
把花盆及植株从架子上拿下，并复原(如图11所示)；
59.(9)、浸泡过的雌穗凉干后，把苞叶复原，并用橡皮扎好，继续套袋防止串粉；
60.(10)、种子成熟后及时收获并晒干备用。
61.以上步骤和实施例1的操作步骤相同，因此以上步骤对应的演示附图也和实施例1一致。
62.斑茅外源dna转化玉米的检测试验
63.提取斑茅基因组dna，采用本发明的倒置浸泡雌穗、利用花粉管通道提高外源dna转化玉米效率的方法，对玉米自交系品种wys2进行转化，操作转化了18株，有16株能收获t0玉米种子，共计172粒。播种后有85株t0苗成活。
64.外源dna转化后获得的t0代的玉米种子播种后，于苗期根据观察叶子与普通的玉米叶子在形态上的不同进行初步筛选，然后采集植株的叶子提取基因组dna。采用alu
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like标记技术分析t0代的玉米苗是否含有斑茅血缘，采用的检测引物为：agrp80：5'ggg ttg tcy ttg cca tca ta3'，agrp 81：5'gag yag crc aga ggt tac ga3'，pcr扩增35个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
65.alu
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like标记是检测斑茅基因组dna的特有分析技术，凡是含有斑茅基因组dna的就可扩增出一条约270bp条带，反之无条带(如图14所示)。检测试验表明，电泳道1，2，3条带很清晰，分别为阳性对照、海南92
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77品种(斑茅)、崖城96
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40品种(斑茅真杂种f1代)；电泳道4，5，6，7，13，15，16共7条泳道有条带出现，初步证明斑茅dna浸泡导入玉米获得成功。按85株t0苗计算，转化率为8.24％，该转化率远远高于现有文献中其他转化方法所记载的数据，通常其他方法的转化率一般为2～3％。