组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法与流程

技术特征：
1.一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；s2：抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：cgmcc no.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；s3：分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；s4：菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为106个/ml；s5：紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到pda培养基中进行后培养,以提高突变率；s6：常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μl涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2ml的离心管中，加入1ml无菌超纯水，振荡1min后涂在isp2培养基上，30℃培养6～8d，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用；s7：液体摇瓶菌种培养基配方为pda，ph 7，起始ph值为5.0，共配制250ml,分装250ml三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；s8：液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13
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30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种；s9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500l一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；s10：一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500l一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10mpa，ph为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.5～1vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。
s11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000l二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；s12：二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000l二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10mpa，ph为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；s13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000l
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3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；s14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000l发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；s15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵5～7天的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000l发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，ph为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.6～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1.4vvm/min；s16：发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液；s17：将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000l发酵液暂存罐内；s18：将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；s19：将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；s20：将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；s21：将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；s22：将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a；s23：将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；s24：将萃取液进行液
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液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；s25：将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼a；s26：将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼a；s27:分别将虫草素粗品干滤饼a和喷司他丁粗品干滤饼a，送入2号或3号3000l的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍的丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；
s28:分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；s29:分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼b和喷司他丁粗品滤饼b；s30：将虫草素粗品滤饼b与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/l；s31：将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3bv；再用体积分数30
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60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；s32：将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；s33：将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；s34：将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼a、b合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/l；s35：将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3bv；再用去离子水、体积分数70
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80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；s36：将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；s37：将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；s38：将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；s39：将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；s40：将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；s41：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼a；s42：将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；s43：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼b；s44：将喷司他丁母液干滤饼b与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；s45：将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界co2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；s46:将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界co2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；s47：分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。s48：将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥
98％喷司他丁晶体粉末产品。2.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述蛹虫草菌株及抗生链霉菌株的分离和诱变和保藏方法如下：蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：cgmcc no.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养；待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养；定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液；采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为106个/ml；紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中；15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波；上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到pda培养基中进行后培养,以提高突变率；常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μl涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2ml的离心管中，加入1ml无菌超纯水，振荡1min后涂在isp2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用。3.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述菌种的制备与工业发酵方法如下：液体摇瓶菌种培养基配方为pda，ph 7，起始ph值为5.0，共配制250ml,分装250ml三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13
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30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500l一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500l一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10mpa，ph为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min,2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000l二级种子
发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000l二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10mpa，ph为7条件下发酵培养5天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000l
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3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；将发酵培养基分批泵入1～10号100000l发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000l发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，ph为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。4.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述虫草素和喷司他丁纯化步骤如下：将制得的子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000l发酵液暂存罐内；将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a；将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；将萃取液进行液
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液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼a；将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼a；分别将虫草素粗品干滤饼a和喷司他丁粗品干滤饼a，送入2号或3号3000l的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼b和喷司他丁粗品滤饼b；将虫草素粗品滤饼b与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10mg/l；将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3bv；再用体积分数30
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60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，
制得虫草素粗品滤饼；将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼a、b合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15mg/l；将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3bv；再用去离子水、体积分数70
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80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼a；将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼b；将喷司他丁母液干滤饼b与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界co2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界co2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。5.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法步骤如下：a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：cgmcc no.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为106个/ml；e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背
景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到pda培养基中进行后培养,以提高突变率；f、常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μl涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2ml的离心管中，加入1ml无菌超纯水，振荡1min后涂在isp2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。6.根据权利要求5所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：步骤a中，所述乙醇为体积分数75％；步骤c中，所述蛹虫草马铃薯培养基包括：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000ml，ph 6.5～7，所述抗生链霉菌培养基包括：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph 6.5～7；步骤e中，所述紫外线照射时间分别为0min、0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、5min；步骤f中，所述isp2培养基30℃培养6～8d；步骤a～f中，所述抗生链霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号为：cgmcc no.1349。7.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：菌种的制备与工业发酵方法：i、液体摇瓶菌种培养基配方为pda，ph 7，起始ph值为5.0，共配制250ml,分装250ml三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13
‑
30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500l一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500l一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10mpa，ph为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000l二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000l二级种子发酵罐中，用种
子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10mpa，ph为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000l
×
3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000l发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000l发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，ph为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。8.根据权利要求7所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：步骤i中，所述蛹虫草马铃薯培养基(pda改)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000ml，ph 6.5～7；所述抗生链霉菌培养基(pda改)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph 6.5～7；步骤ii中，所述接种后于28℃摇床培养5～7天左右，转速为120转/分钟；步骤iv中，所述发酵温度28～30℃，罐压0.10mpa，ph为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10mpa，ph为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10mpa，ph为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；步骤vii中，所述优化培养基配方：蔗糖90g、细豆柏25～30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉18g、l
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苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、氯化钠3～5g、硫酸镁0.5～1g、苯甲酸钠0.02mg、花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、醋酸锌40g、蒸馏水1000ml，ph 7；步骤i、iii、v、viii中，所述灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；步骤ix中，所述接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，ph为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；所述发酵时间为240h；步骤x中，所述发酵液ph低于6.2时，开始通氨，100h前ph6.3～6.5，100h后ph在6.2～6.3，放罐前8h停止通氨；所述补液标准为根据发酵液的残糖值补入总糖，在发酵100h前残
糖值控制在8.0～9.0％，在发酵后100h～150h残糖值控制在7.0～8.0％，150h至放罐前6h，残糖值控制在5.0％；9.根据权利要求7所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：虫草素和喷司他丁纯化方法：n1、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000l发酵液暂存罐内；n2、将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；n3、将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；n4、将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；n5、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；n6、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a；n7、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼a重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；n8、将萃取液进行液
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液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；n9、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼a；n10、将水相泵入6000l絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼a；n11、分别将虫草素粗品干滤饼a和喷司他丁粗品干滤饼a，送入2号或3号3000l的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；n12、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；n13、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼b和喷司他丁粗品滤饼b；n14、将虫草素粗品滤饼b与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/l；n15、将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3bv；再用体积分数30
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60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；n16、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；n17、将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；n18、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼a、b合并，装入2号上柱液配
制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/l；n19、将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3bv；再用去离子水、体积分数70
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80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5bv；分别收集吸附流出液和洗脱液；n20、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；n21、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；n22、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；n23、将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；n24、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；n25、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼a；n26、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；n27、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼b；n28、将喷司他丁母液干滤饼b与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；n29、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界co2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；n30、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界co2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；n31、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，n32、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量v型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。10.根据权利要求9所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：步骤n2中，所述的粗滤设备为自动刮刀离心机或袋式过滤机或板框式压滤机；所述产能为4000l/h；步骤n3中，所述所述膜超滤机组为全自动控制超滤机组，产能为4000l/h；步骤n4中，所述自动刮刀离心机型号为pgz
‑
1000；步骤n5中，所述膜纳滤浓缩机组为全自动控制纳滤浓缩机组，产能为4000l/h；步骤n6中，所述自动刮刀离心机型号为pgz
‑
1000；步骤n7中，所述溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯溶剂；所述溶剂萃取温度为40～60℃；步骤n9中，所述液
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液离心萃取设备为ctl350
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n，产能1000～3000l/h；步骤n10中，所述絮凝剂为ztc 1 1天然澄清剂；所述絮凝沉淀温度为60～80℃；所述沉
淀时间为4～6h；步骤n11中，所述脱色剂为活性白土或活性碳；步骤n9、n10、n12、n16、n20、n24、n29、n31中，所述浓缩器为mvr蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩机组；所述mvr蒸发器或全电蒸发器浓缩温度为55～60℃；真空度为0.07～0.085mpa；所述该设备产能为500～4000l/h；步骤n13中，所述自动刮刀离心机型号为pgz
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1000；步骤n14中，所述溶剂为体积分数30～60％、ph4～6乙醇或甲醇；所述上柱液溶质浓度为5～12g/l；步骤n15中，所述大孔树脂系统为全自动控制大孔树脂柱系统；所述大孔树脂为d001或hd
‑
8或711或ml
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7大孔树脂；大孔树脂吸附流速2～3bv；洗脱溶剂为体积分数30
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60％的乙醇；洗脱液流速3～5bv；步骤n18中，所述上柱液溶质浓度5～15g/l；步骤n19中，所述大孔树脂为hz202或d201或d241或d261；所述吸附流速为3～4bv/h；洗脱液分别用去离子水、ph4～6、体积分数85～95％乙醇或甲醇；所述去离子水洗脱流速为2～3bv/h；所述乙醇或甲醇梯度洗脱流速为3～5bv/h；步骤n22中，所述结晶溶剂为体积分数30～60％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃
→
5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000l结晶釜；步骤n24中，所述析晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述析晶温度为40～50℃
→‑
15℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000l结晶釜；步骤n26中，所述结晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇或丙酮；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃
→
5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000l结晶釜；步骤n28中，所述母液浸膏为虫草素含量≥50％以上的结晶母液浸膏；步骤n29、n30中，所述超临界干燥装置为200l双萃双分电加热全自动控制的超临界干燥装置；超临界干燥并脱残溶压力为20～30mpa、干燥温度为40～60℃、co2流量为1500～4500l/h、干燥时间为360～480min；步骤n31中，所述批量v型混合机为v
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1000；批量混合时间为30～60min。

技术总结
本发明提供一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，本方法以蛹虫草菌和抗生链霉菌为出发菌株，经分别试管斜面培养、悬浮液培养、诱变、组合种子培养、发酵培养、发酵液高速离心、大孔树脂纯化、重结晶等技术及超临界CO2流体干燥技术和全自动控制技术相结合，在多者协同作用下进行蛹虫草菌和抗生链霉菌组合发酵产虫草素和喷司他丁化合物，实现了虫草素和喷司他丁化合物同时进行非化学合成、非蛹虫草提取的生物合成；利用本发明技术组合发酵生产虫草素和喷司他丁化合物，其反应条件温和、操作相对简单、产品成本低、收率高、纯度高、残溶低、能耗低、产能大、环境污染小，适宜工业化规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。景。


技术研发人员：陈开云 冯成勇
受保护的技术使用者：陈开云
技术研发日：2021.10.14
技术公布日：2021/12/14